細(xì)菌全基因組測(cè)序技術(shù)用于沙門(mén)氏菌流行病學(xué)調(diào)查的可行性分析

林本夫，任欣悅，袁曉琪，梁夢(mèng)詩(shī)，丘穗萍，潘婧淇，原麗紅

（1.廣州市花都區(qū)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，廣東廣州 510800；2.廣東藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，廣東廣州 510006）

食源性疾病一直是全球廣泛關(guān)注的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)[2]，每年有6億人患食源性疾病，其中42 萬(wàn)人死亡，每10 人中就約有1 人患病。其中，由沙門(mén)氏菌（Salmonella）引起的食物中毒人數(shù)居我國(guó)食源性致病菌致病人數(shù)的首位[3]。當(dāng)前沙門(mén)氏菌實(shí)驗(yàn)室診斷方法（GB 4789.4—2016）[4-5]成本高、周期長(zhǎng)，對(duì)操作人員技術(shù)要求高，不能滿(mǎn)足基層高通量、快速、低成本的檢測(cè)需求[6]。全基因組測(cè)序（whole genome sequencing，WGS）以特異性基因差異來(lái)表征菌株之間的差異，具有顯著的分型優(yōu)越性[7]，并且可以快速詳盡地得到耐藥細(xì)菌的特征，是檢測(cè)細(xì)菌耐藥性的有效技術(shù)手段，極大克服了傳統(tǒng)方法的局限性[8-9]。

前期對(duì)分離到的9株沙門(mén)氏菌進(jìn)行了傳統(tǒng)的血清分型和耐藥性分析[10]。本研究以這9株沙門(mén)氏菌為研究對(duì)象，通過(guò)全基因組測(cè)序預(yù)測(cè)其血清型和耐藥基因，進(jìn)而將全基因組測(cè)序結(jié)果與傳統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，評(píng)價(jià)兩者結(jié)果的一致性和各自?xún)?yōu)缺點(diǎn)，探討全基因組測(cè)序技術(shù)在沙門(mén)氏菌基層檢測(cè)和監(jiān)控工作中的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 材料

從豬、禽屠宰場(chǎng)環(huán)境樣品中分離得到9株沙門(mén)氏菌，其中6株來(lái)自生豬屠宰場(chǎng)（土壤2株、污泥2株、屠宰車(chē)間拭紙2株），3株來(lái)自禽類(lèi)屠宰場(chǎng)（土壤1株、污泥1株、屠宰車(chē)間拭紙1株），具體采樣和分離方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)[10]。

1.2 方法

1.2.1 全基因組測(cè)序 9株沙門(mén)氏菌全基因組測(cè)序，由廣東美格基因科技有限公司（中國(guó)廣州）完成。提取細(xì)菌基因組DNA，對(duì)DNA 進(jìn)行完整性和純度檢測(cè)；使用NEB Next UltraTMDNA Library Prep Kit（Illumina）進(jìn)行建庫(kù)和質(zhì)檢；利用Ilumina Novaseq 6000 平臺(tái)對(duì)文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序，生成150 bp的對(duì)端序列。

1.2.2 基因組數(shù)據(jù)質(zhì)控、拼接和組裝 對(duì)沙門(mén)氏菌基因組測(cè)序原始數(shù)據(jù)，采用FastQC 質(zhì)控分析合格后，通過(guò)SPAdes_3.14.1（https://github.com/ablab/spades）進(jìn)行拼接組裝，去除＜200 bp的重疊群片段；用RAST（rapid annotation using subsystem technology，https://rast.nmpdr.org/rast.cgi）統(tǒng)計(jì)沙門(mén)氏菌基因組大小、GC 含量等信息。

1.2.3 血清型預(yù)測(cè)和MLST 分型 根據(jù)全基因組測(cè)序結(jié)果，通過(guò)SeqSero 1.2（https://cge.cbs.dtu.dk/services/SeqSero/）進(jìn)行血清型預(yù)測(cè)，同時(shí)在沙門(mén)氏菌基因組中檢索7 個(gè)看家基因（aroC、dnaN、hemD、hisD、purE、sucA和thrA），將序列上傳至MLST 2.0（https://cge.cbs.dtu.dk/services/MLST/）中，與數(shù)據(jù)庫(kù)中原有的等位基因型序列進(jìn)行比對(duì)，得到每個(gè)管家基因的編號(hào)，將其組合后得到對(duì)應(yīng)的序列型（sequence type，ST）。

1.2.4 耐藥基因分析 基于9株沙門(mén)氏菌的全基因組測(cè)序分析結(jié)果，采用ResFinder 3.2（https://cge.cbs.dtu.dk/services/ResFinder/）對(duì)菌株基因組所包含的耐藥基因進(jìn)行預(yù)測(cè)。耐藥基因預(yù)測(cè)參數(shù)為ID ＞90%，且序列長(zhǎng)度大于目的基因長(zhǎng)度的60%；基因組組裝中，去掉覆蓋度＜20 的節(jié)點(diǎn)。

1.2.5 與傳統(tǒng)分析結(jié)果對(duì)比 將9株沙門(mén)氏菌全基因組測(cè)序結(jié)果與傳統(tǒng)血清分型和耐藥性檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。傳統(tǒng)血清分型和耐藥性檢測(cè)，根據(jù)GB4789.4—2016 對(duì)樣品進(jìn)行增菌/選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)、篩選，隨后經(jīng)PCR 擴(kuò)增、測(cè)序鑒定，利用傳統(tǒng)血清分型方法對(duì)沙門(mén)氏菌O/H 多價(jià)和單因子血清型鑒定；根據(jù)行標(biāo)WS/T639—2018 選擇慶大霉素（GEN）、氟苯尼考（FFC）、環(huán)丙沙星（CIP）、阿莫西林（AMX）、氨芐西林（AMP）、諾氟沙星（NFX）、頭孢噻吩（CEF）、頭孢噻肟（CTX）、頭孢曲松（CRO）、頭孢他啶（CAZ）、氨曲南（ATM）、亞胺培南（IPM）等12 種臨床常用抗菌藥物，對(duì)沙門(mén)氏菌分離株進(jìn)行抗藥性分析。具體檢測(cè)方法及結(jié)果判定參考文獻(xiàn)[10]。

2 結(jié)果

2.1 全基因組測(cè)序

9株沙門(mén)氏菌編號(hào)分別為P-SSL1、P-SSL2、P-SSL3、P-SSL4、P-SSO1、P-SSO3、A-SSL3、A-SSL1、A-SSL4，基因組總長(zhǎng)度為4 738 737～5 161 611 bp，基因平均長(zhǎng)度為41 964.3～103 016 bp，GC 含量平均為52.06%。其中：P-SSL1、P-SSL2 的GC 含量最少，為51.9%；P-SSL3、P-SSL4 的GC 含量最多，為52.2%；A-SSL1 大于200 bp 的重疊群片段數(shù)量最少，僅46 條，基因組長(zhǎng)度也最短，僅4 738 737 bp；P-SSL2 大于200 bp 的重疊群片段數(shù)量最多，為123 條，基因組長(zhǎng)度也最長(zhǎng)，為5 161 611bp。具體結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2 血清型預(yù)測(cè)和MLST 分型

9株沙門(mén)氏菌中共預(yù)測(cè)到3 種血清型和ST型，分別是鼠傷寒沙門(mén)氏菌（S.typhimurium，ST34）、德?tīng)柋吧抽T(mén)氏菌（S.derby，ST40）、腸炎沙門(mén)氏菌（S.enteritidis，ST11），具體見(jiàn)表1。其中：鼠傷寒沙門(mén)氏菌為優(yōu)勢(shì)血清型，占55.56%（5/9），其次為德?tīng)柋吧抽T(mén)氏菌和腸炎沙門(mén)氏菌，均占22.22%（2/9）。分離自豬屠宰場(chǎng)的6株沙門(mén)氏菌中，有5株鼠傷寒沙門(mén)氏菌、1株德?tīng)柋吧抽T(mén)氏菌；來(lái)自禽屠宰場(chǎng)的3株沙門(mén)氏菌中，有2株腸炎沙門(mén)氏菌、1株為德?tīng)柋吧抽T(mén)氏菌（表2）。

2.3 耐藥基因預(yù)測(cè)

通過(guò)對(duì)9株沙門(mén)氏菌全基因組進(jìn)行耐藥基因分析，得到7 大類(lèi)抗菌藥物共22 種耐藥基因，包括氨基糖苷類(lèi)[aac（3）-IVa、aph（3′）-Ia、aph（4）-Ia、aadA1、aadA2、aadA3、strA、strB]、β-內(nèi)酰胺類(lèi)（blaTEM-1B、blaOXA-1）、氯霉素類(lèi)（floR、catB3、cmlA1）、喹諾酮類(lèi)[qnrS2、aac（6′）Ib-cr]、利福平（ARR-3）、磺胺類(lèi)（sul1、sul2、sul3、dfrA12）、四環(huán)素類(lèi)[tet（A）、tet（B）]。其中：氨基糖苷類(lèi)耐藥基因中攜帶率最高的是strA和strB基因，攜帶率均為66.67%（6/9）；β-內(nèi)酰胺類(lèi)耐藥基因中攜帶率最高的是blaTEM-1B基因，攜帶率為66.67%（6/9）；磺胺類(lèi)耐藥基因中攜帶率最高的是sul2基因，攜帶率為88.89%（8/9）；其余種類(lèi)耐藥基因攜帶率均不超過(guò)55.56%。在預(yù)測(cè)的所有耐藥基因中，攜帶率最高的耐藥基因是磺胺類(lèi)的sul2基因（88.89%），攜帶率最低的是氨基糖苷類(lèi)的aadA3基因（11.11%）。不同菌株間耐藥基因差異較大，在22 種耐藥基因中，有10 種耐藥基因的檢出率超過(guò)55.56%；9株沙門(mén)氏菌均攜帶3 種及以上的耐藥基因。具體結(jié)果見(jiàn)表1。

2.4 與傳統(tǒng)分析結(jié)果對(duì)比

利用傳統(tǒng)血清分型方法共鑒定出鼠傷寒沙門(mén)氏菌、腸炎沙門(mén)氏菌、德?tīng)柋吧抽T(mén)氏菌3 種血清型。其中分離自豬屠宰場(chǎng)的6株沙門(mén)氏菌中，有5株鼠傷寒沙門(mén)氏菌、1株德?tīng)柋吧抽T(mén)氏菌；來(lái)自禽屠宰場(chǎng)的3株沙門(mén)氏菌中，有2株腸炎沙門(mén)氏菌、1株為德?tīng)柋吧抽T(mén)氏菌?；谌蚪M測(cè)序預(yù)測(cè)的血清分型結(jié)果與傳統(tǒng)的血清分型結(jié)果[10]一致（表2）。

表2 基于全基因組測(cè)序的血清分型結(jié)果與傳統(tǒng)血清分型結(jié)果對(duì)比

傳統(tǒng)試驗(yàn)時(shí)選擇了基層畜禽養(yǎng)殖實(shí)踐中常用的4 類(lèi)（β-內(nèi)酰胺類(lèi)、喹諾酮類(lèi)、氨基糖苷類(lèi)和氯霉素類(lèi)）12 種抗菌藥物，對(duì)9株沙門(mén)氏菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)（表3），發(fā)現(xiàn)9株沙門(mén)氏菌對(duì)阿莫西林和氨芐西林完全抗藥，豬屠宰場(chǎng)分離到的6株沙門(mén)氏菌中有4株對(duì)慶大霉素耐藥，有3株對(duì)氟苯尼考耐藥；禽屠宰場(chǎng)分離到的3株沙門(mén)氏菌中有1株對(duì)慶大霉素、氟苯尼考和環(huán)丙沙星耐藥。而基于細(xì)菌全基因組數(shù)據(jù)的耐藥基因分析結(jié)果顯示，共檢測(cè)到7 大類(lèi)22 種耐藥基因，其中針對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)、喹諾酮類(lèi)、氨基糖苷類(lèi)和氯霉素4 類(lèi)抗菌藥物的檢測(cè)結(jié)果與傳統(tǒng)檢測(cè)方法結(jié)果一致。全基因組測(cè)序與耐藥性分析對(duì)比結(jié)果表明，β-內(nèi)酰胺類(lèi)、氯霉素類(lèi)、喹諾酮類(lèi)和氨基糖苷類(lèi)藥物的耐藥表型[10]與耐藥基因的檢測(cè)結(jié)果符合率為100%，即所有耐藥菌株中均檢測(cè)到相應(yīng)的耐藥基因。此外，全基因組測(cè)序預(yù)測(cè)到利福平、磺胺類(lèi)和四環(huán)素3 大類(lèi)抗菌藥物的7 個(gè)耐藥基因，表明9株沙門(mén)氏菌可能對(duì)這3 大類(lèi)抗菌藥物耐藥。

表3 基于全基因組測(cè)序的耐藥基因分析與藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)比

3 討論

沙門(mén)氏菌作為主要的食源性病原菌，嚴(yán)重威脅著人類(lèi)健康。由于沙門(mén)氏菌分型多且復(fù)雜[11]，加之長(zhǎng)期使用某種抗菌藥物甚至濫用抗菌藥物導(dǎo)致（多重）耐藥菌株出現(xiàn)，尤其是在畜牧業(yè)養(yǎng)殖中，為防治疾病感染，促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)，大量的抗菌藥物被用作飼料添加劑，使得基層沙門(mén)氏菌病防控工作面臨嚴(yán)峻挑戰(zhàn)[12-13]。

對(duì)沙門(mén)氏菌進(jìn)行快速準(zhǔn)確的分型和耐藥判斷，針對(duì)性地指導(dǎo)臨床用藥，對(duì)于沙門(mén)氏菌病防控尤為重要[14]。臨床上常用的傳統(tǒng)血清分型方法是通過(guò)玻片凝集法確定O 抗原和H 抗原[15]，然后根據(jù)沙門(mén)氏菌血清抗原表確定血清型。此方法對(duì)血清質(zhì)量要求高，且花費(fèi)大、用時(shí)長(zhǎng)、人工成本高；對(duì)某些凝集不明顯難以進(jìn)行判別的情況依賴(lài)于技術(shù)人員的經(jīng)驗(yàn)積累，容易造成誤判；此外，某些罕見(jiàn)血清型由于缺少特異診斷血清，常常難以檢測(cè)。相比之下，基于全基因組測(cè)序的分型方法，針對(duì)細(xì)菌特異性基因的差異來(lái)表征菌株之間的差異，用時(shí)短，準(zhǔn)確率高，避免了常規(guī)血清分型中主觀判斷的影響，同時(shí)對(duì)傳統(tǒng)血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)無(wú)法鑒定的菌株也可以進(jìn)行分析，是一種高分辨率的分型方法。分子分型技術(shù)（如MLST、cqMLST、wgMLST 等）隨著基因組時(shí)代的來(lái)臨將成為當(dāng)前細(xì)菌分型研究的熱點(diǎn)[16]。

監(jiān)測(cè)沙門(mén)氏菌耐藥性，研究其耐藥形成主要機(jī)制，對(duì)沙門(mén)氏菌病的預(yù)防和控制具有重要意義。沙門(mén)氏菌耐藥性一般分為天然耐藥和獲得性耐藥。天然耐藥是細(xì)菌的固有特性和賴(lài)以生存的基本條件；獲得性耐藥主要是由于長(zhǎng)期藥物使用而逐漸形成，主要由可以轉(zhuǎn)移的DNA（轉(zhuǎn)座子或者質(zhì)粒）介導(dǎo)，可以水平傳播[17]。沙門(mén)氏菌耐藥性種類(lèi)的增多，加大了依賴(lài)抗菌藥物治療沙門(mén)氏菌病和基層沙門(mén)氏菌病防控工作的難度，因此在食源性動(dòng)物飼養(yǎng)過(guò)程中抗菌藥物的使用應(yīng)嚴(yán)格限制并遵守休藥期，以減少細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生，保障食品安全和人類(lèi)健康[18]。

實(shí)驗(yàn)室在進(jìn)行耐藥性分析時(shí)，主要基于當(dāng)?shù)乜咕幬锸褂们闆r選擇性進(jìn)行藥敏分析，無(wú)法進(jìn)行大規(guī)模藥敏試驗(yàn)，且該方法培養(yǎng)周期長(zhǎng)，易受培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件、人員操作等因素的影響。全基因組測(cè)序準(zhǔn)確率高，操作簡(jiǎn)便，用時(shí)更短，預(yù)測(cè)耐藥基因范圍更廣，而且ResFinder 抗性基因數(shù)據(jù)庫(kù)在預(yù)測(cè)耐藥基因方面可以檢出更多的耐藥基因，是耐藥性分析的首選工具。耐藥基因?qū)δ退幮缘念A(yù)測(cè)也為明確耐藥機(jī)制以及耐藥性的檢測(cè)提供了新的視角和方法[19]。當(dāng)出現(xiàn)新的血清型或耐藥基因時(shí)，可直接通過(guò)全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行檢索和分析，無(wú)需再次進(jìn)行常規(guī)的細(xì)菌培養(yǎng)鑒定，為沙門(mén)氏菌血清型和耐藥性的分析提供了更加簡(jiǎn)便的方法。

食品安全問(wèn)題在我國(guó)乃至全球已經(jīng)成為一個(gè)重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題，食源性致病菌作為食品安全的一個(gè)主要因素逐漸受到人們的重視。為確保我國(guó)食品安全，保證人民健康，防止食源性感染的發(fā)生，需要開(kāi)展廣泛的流行病學(xué)調(diào)查，建立完善的食源性疾病監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)[19]。全基因組測(cè)序技術(shù)已應(yīng)用于細(xì)菌性傳染病暴發(fā)調(diào)查和流行病學(xué)分析中，如2010年海地地震后的霍亂暴發(fā)菌株溯源，2011 年發(fā)生在歐洲的O104:H4 大腸埃希菌暴發(fā)事件調(diào)查，發(fā)生在加拿大持續(xù)3 年的結(jié)核病暴發(fā)分析，新生兒重癥監(jiān)護(hù)室耐甲氧西林金黃色葡萄球菌暴發(fā)的調(diào)查，耐碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物肺炎克雷伯菌醫(yī)院內(nèi)感染暴發(fā)調(diào)查等[20]。此技術(shù)在沙門(mén)氏菌流行病學(xué)中為抗病、生長(zhǎng)、食欲、代謝調(diào)節(jié)、表型、環(huán)境適應(yīng)機(jī)制及重要經(jīng)濟(jì)性狀基因的分析提供重要數(shù)據(jù)，促進(jìn)了對(duì)畜禽遺傳資源的深入研究與利用[21]。

隨著全基因組測(cè)序的不斷成熟，以及數(shù)據(jù)庫(kù)的不斷完善，會(huì)出現(xiàn)更多基因數(shù)據(jù)庫(kù)和研究軟件，為今后的研究提供了便捷[22]?；谌蚪M測(cè)序的沙門(mén)氏菌分型和耐藥性分析方法的檢測(cè)成本和周期也將會(huì)進(jìn)一步降低，測(cè)序速度、測(cè)序讀長(zhǎng)也將會(huì)進(jìn)一步增加，細(xì)菌分型和耐藥基因分析范圍會(huì)更廣，能夠滿(mǎn)足基層沙門(mén)氏菌病防控的高通量、快速、低成本的需求，從而指導(dǎo)沙門(mén)氏菌病防控的用藥。因此，基于全基因組測(cè)序開(kāi)發(fā)操作簡(jiǎn)單、低成本、高效、快速的沙門(mén)氏菌分型和耐藥性分析方法，在沙門(mén)氏菌流行病學(xué)調(diào)查和基層疫病防控具有一定的應(yīng)用價(jià)值，相信全基因組測(cè)序也會(huì)被廣泛應(yīng)用于更多物種的基因組研究。