高酸價(jià)肉油在傳統(tǒng)泡酒過(guò)程中的脂質(zhì)氧化及風(fēng)味成分變化

梁詩(shī)雅，張鳳嬌，何松貴，關(guān)菁怡，黎偉剛，吳振強(qiáng)*

（1.華南理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510006；2.廣東省九江酒廠有限公司，廣東 佛山 528200）

豉香型白酒因其獨(dú)特的脂肪風(fēng)味而廣受歡迎，尤其是在中國(guó)南方地區(qū)[1]。豉香型白酒采用大米為原料，經(jīng)蒸煮后拌入大酒餅，邊糖化邊發(fā)酵，發(fā)酵后的醪液經(jīng)釜式蒸餾后得乙醇體積分?jǐn)?shù)為28%～38%的低度白酒，俗稱“齋酒”，具有酒體渾濁、味道辛辣的特點(diǎn)[2]，需經(jīng)過(guò)陳肉醞浸后形成豉香風(fēng)味，最后經(jīng)過(guò)陳釀、勾兌、過(guò)濾后得到成品酒[3]。陳肉醞浸是豉香型白酒的關(guān)鍵工序，是典型風(fēng)格形成的必要工序，它能夠通過(guò)提供醛和酸等物質(zhì)豐富基酒的成分，并通過(guò)提供辛醛和壬醛等物質(zhì)形成強(qiáng)烈的脂肪香氣[1，4]。陳肉在生產(chǎn)過(guò)程中發(fā)生緩慢而復(fù)雜的脂質(zhì)氧化變化，但操作較為繁瑣且耗時(shí)，難以滿足日益增長(zhǎng)的市場(chǎng)需求，因此，需要加速陳肉的生產(chǎn)。

陳肉具有高酸價(jià)（acid value，AV）和高氧化水平的特點(diǎn)。到目前為止，已研究了光照、過(guò)氧化氫、脂肪氧合酶等對(duì)泡酒肥肉的加速氧化作用，但是都未能有效提高其酸價(jià)[5]。其中，在齋酒內(nèi)加入適量取自陳肉浸泡過(guò)程中逸出的具有高酸價(jià)的肥油，共同浸泡使肥肉的酸價(jià)提高，然而這并不能根本意義上促進(jìn)脂質(zhì)氧化，而是一種傳質(zhì)作用[6]。

脂肪酶能催化甘油三酯水解生成甘油和游離脂肪酸。有研究報(bào)道，在多種食品系統(tǒng)中，油脂水解過(guò)程可以促進(jìn)油脂氧化[7]。國(guó)內(nèi)有研究者分別在羊肉發(fā)酵香腸[8]、臘鴨腿[9]中加入脂肪酶，發(fā)現(xiàn)適量地添加外源脂肪酶能加速腌臘肉制品脂肪酸的分解，從而加速脂質(zhì)氧化。為了提高肉油的酸價(jià)和脂肪酶的利用效率，本研究采用包埋法固定脂肪酶，通過(guò)固定化脂肪酶的水解作用提高肉油自身的酸價(jià)，獲得高酸價(jià)的肉油，并進(jìn)一步研究高酸價(jià)肉油在傳統(tǒng)泡酒工藝下的脂質(zhì)氧化和風(fēng)味變化，以期為替代傳統(tǒng)工藝提出高效、簡(jiǎn)單的潛在途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

取自豬肩背部的新鮮肥豬肉（約5 cm×5 cm×5 cm，質(zhì)量約50 g）、齋酒（酒精度為55%vol）：廣東省九江酒廠有限公司；脂肪酶（10萬(wàn)U/g）：上海麥克林生化科技有限公司；37種脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品（均為色譜純）：Sigma-Adrich（上海）貿(mào)易有限公司；明膠、海藻酸鈉（均為生化試劑）、正己烷、甲醇、鄰二氯苯（均為色譜純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-S恒溫水浴鍋：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；C21-WT2118電磁爐：廣東美的生活電器制造有限公司；JS39D-250絞肉機(jī)：浙江紹興蘇泊爾家居用品有限公司；ZWYD-2402恒溫培養(yǎng)振蕩器（搖床）：智誠(chéng)分析儀器制造有限公司；FJ200-SH高速分散均質(zhì)機(jī)：上海滬析實(shí)業(yè)有限公司；UV-2802S型紫外分光光度計(jì)：尤尼柯（上海）儀器有限公司；GC-2014C氣相色譜（gas chromatography，GC）儀、Wondacap-WAX色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）：島津（中國(guó)）有限公司；PDMS/DVB/CAR固相微萃取探針：青島貞正分析儀器有限公司；7000C頂空進(jìn)樣氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）儀、HP-5ms Ultra Inert色譜柱（15 m×0.25 mm×0.25 μm）：美國(guó)安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 固定化脂肪酶的制備

準(zhǔn)確稱取海藻酸鈉1.5 g，明膠1.5 g于燒杯中，混合后加入50 mL去離子水，于80 ℃水浴加熱并攪拌，充分溶解后冷卻至室溫，再于100 r/min條件下加入100 mg脂肪酶直至充分混勻。用10 mL注射器將上述溶液逐滴加入4%的氯化鈣溶液中，于4 ℃固化2 h。過(guò)濾后取酶制劑凝珠，用去離子水洗滌3次，抽濾，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 高酸價(jià)肉油的制備

新鮮的肥豬肉在50 ℃溫水中浸泡40 min，然后在沸水中煮15 min，煮熟的肥豬肉在絞肉機(jī)中絞碎，用雙層紗布過(guò)濾后得到普通肉油。將普通肉油與固定化脂肪酶按質(zhì)量比50∶3于30 ℃、120 r/min條件下反應(yīng)20 h，作為加酶組，每4 h取樣測(cè)其酸價(jià)。取最佳處理時(shí)間的肉油經(jīng)雙層紗布過(guò)濾除去固定化脂肪酶，再于95 ℃水浴加熱去除肉油中可能殘留的酶活，得到高酸價(jià)肉油。未經(jīng)固定化脂肪酶水解的普通肉油也執(zhí)行上述操作，作為對(duì)照組。

1.3.3 高酸價(jià)肉油的傳統(tǒng)泡酒實(shí)驗(yàn)

以未經(jīng)固定化脂肪酶水解的普通肉油為對(duì)照組，將獲得的高酸價(jià)肉油與酒精度為55%vol的齋酒以料液比1.0∶2.5（g∶mL）加入密封罐中，于25 ℃的黑暗處?kù)o置浸泡60 d，每15 d取樣檢測(cè)其酸價(jià)、過(guò)氧化值、茴香胺值和脂肪酸組成，60 d后取樣檢測(cè)其揮發(fā)性化合物組成。

1.3.4 高酸價(jià)肉油的脂質(zhì)氧化分析

油脂脂質(zhì)氧化常用的評(píng)價(jià)指標(biāo)包括酸價(jià)（AV）、過(guò)氧化值（peroxide value，PV）、茴香胺值（anisidine value，AnV）。將肉油與石油醚（沸程30～60 ℃）按料液比1∶1（g∶mL）混合后，靜置提取24 h。經(jīng)裝有無(wú)水硫酸鈉的漏斗過(guò)濾，取濾液，在低于40 ℃的水浴中，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸干石油醚，殘留物即為待測(cè)樣品。酸價(jià)的測(cè)定參照國(guó)標(biāo)GB 5009.229—2016《食品中酸價(jià)的測(cè)定》[10]。過(guò)氧化值的測(cè)定參照GB5009.227—2016《食品中過(guò)氧化值的測(cè)定》[11]。茴香胺值的測(cè)定參照國(guó)標(biāo)GB/T 24304—2009《動(dòng)植物油脂茴香胺值的測(cè)定》[12]。

1.3.5 高酸價(jià)肉油的脂肪酸組成分析

通過(guò)對(duì)BHOURI A M等[13]所報(bào)道的方法稍作調(diào)整，使用GC測(cè)定肉油的長(zhǎng)鏈脂肪酸組成。準(zhǔn)確稱取約0.02 g待測(cè)樣品，加入2 mL正己烷，充分振搖至其溶解，然后加入4 mL 2 mol/L的氫氧化鉀-甲醇溶液，渦旋3 min，使待測(cè)樣品中的脂肪酸完全甲酯化。靜置后，取上層液體并用正己烷稀釋10倍，然后經(jīng)0.22 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾后用于氣相色譜分析。

氣相色譜條件：Wondacap-Wax熔融石英毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.32 mm×0.25μm）；載氣為氮?dú)猓∟2）；流速1.5 mL/min；進(jìn)樣量1 μL；進(jìn)樣口與檢測(cè)器溫度250 ℃；分流比1∶2；升溫程序?yàn)樵?60 ℃保持3 min，再以10 ℃/min的速率升溫至200 ℃，最后以2 ℃/min的速率升溫至220 ℃，保持3 min。

定性、定量方法：通過(guò)脂肪酸甲酯化標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間對(duì)待測(cè)樣品中的脂肪酸進(jìn)行定性，通過(guò)外標(biāo)法進(jìn)行定量。

1.3.6 高酸價(jià)肉油的揮發(fā)性化合物測(cè)定

參照WEN R X等[14]的方法采用固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜法（solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，SPME-GC-MS）測(cè)定肉油的揮發(fā)性化合物。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析

采用軟件Origin 8.5進(jìn)行繪圖，采用SPSS 17.0單因素分析方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有實(shí)驗(yàn)平行進(jìn)行3次，最終結(jié)果均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 固定化脂肪酶處理肉油酸價(jià)的變化

普通肉油及固定化脂肪酶處理肉油過(guò)程中酸價(jià)的變化見(jiàn)圖1。由圖1可知，在加入固定化脂肪酶的肉油中，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，肉油的酸價(jià)逐漸上升而后下降；當(dāng)水解時(shí)間為16 h時(shí)，酸價(jià)最高，達(dá)到（26.32±2.01）mg/g。而在對(duì)照組的肉油中，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，肉油的酸價(jià)變化緩慢且酸價(jià)始終較低，均在0.4 mg/g左右。水解16 h后，加酶組肉油的酸價(jià)約是對(duì)照組的66倍，即制備得到高酸價(jià)肉油。說(shuō)明脂肪酶促進(jìn)脂肪水解生成大量脂肪酸，導(dǎo)致酸價(jià)上升，從而獲得高酸價(jià)肉油。因此，選擇固定化脂肪酶處理肉油時(shí)間為16 h。

圖1 普通肉油及固定化脂肪酶處理肉油過(guò)程中酸價(jià)的變化Fig.1 Changes of acid value of common pork fat pulp and pork fat pulp treated with immobilized lipase

2.2 傳統(tǒng)泡酒過(guò)程中高酸價(jià)肉油的脂質(zhì)氧化

2.2.1 酸價(jià)的變化

傳統(tǒng)泡酒過(guò)程中肉油酸價(jià)的變化見(jiàn)圖2。由圖2可知，傳統(tǒng)泡酒過(guò)程中（0～60 d），普通肉油（對(duì)照組）的酸價(jià)由（0.59±0.05）mg/g變?yōu)椋?.47±0.04）mg/g，期間的酸價(jià)只有微小波動(dòng)，這表明普通肉油（對(duì)照組）的水解程度和氧化程度均很低。高酸價(jià)肉油浸泡0 d時(shí)的酸價(jià)[（26.32±2.01）mg/g]顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），這是因?yàn)樵谥久傅乃庾饔孟拢颈凰獬芍舅?；浸?5 d時(shí)，高酸價(jià)肉油的酸價(jià)降低為（22.47±1.10）mg/g，可能是因?yàn)椴糠种舅岜谎趸到鉃闅溥^(guò)氧化物[15-16]。浸泡15～60 d時(shí)，高酸價(jià)肉油的酸價(jià)逐漸升高，浸泡60 d時(shí)，酸價(jià)為[（26.73±2.84）mg/g]，可能是因?yàn)楦咚醿r(jià)肉油的脂質(zhì)在泡酒過(guò)程中仍不斷被水解為脂肪酸[17]，而且部分氧化產(chǎn)物（如醛類、酮類等物質(zhì)）被進(jìn)一步氧化為羧酸[18]。

圖2 傳統(tǒng)泡酒過(guò)程中肉油酸價(jià)的變化Fig.2 Changes of acid value of pork fat pulp during traditional liquor soaking

2.2.2 過(guò)氧化值的變化

幾乎所有的油脂氧化過(guò)程均會(huì)產(chǎn)生氫過(guò)氧化物，它是脂質(zhì)氧化的第一個(gè)中間產(chǎn)物，因此過(guò)氧化值（PV）可用來(lái)評(píng)價(jià)油脂的氧化程度。傳統(tǒng)泡酒過(guò)程中肉油過(guò)氧化值的變化見(jiàn)圖3。

圖3 傳統(tǒng)泡酒過(guò)程中肉油過(guò)氧化值的變化Fig.3 Changes of peroxide value of pork fat pulp during traditional liquor soaking

由圖3可知，肉油的PV均隨浸泡時(shí)間的增加而逐漸升高，表明脂肪酸發(fā)生氧化，生成氫過(guò)氧化物。浸泡0～45 d內(nèi)，高酸價(jià)肉油與對(duì)照組普通肉油的PV無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；浸泡60 d時(shí)，高酸價(jià)肉油的PV[（4.99±0.34）meq/kg]是浸泡0 d的12.17倍（P＜0.05），比同時(shí)期的普通肉油（對(duì)照組）顯著提高了32%（P＜0.05）。結(jié)果表明，脂肪酶的作用促進(jìn)了脂肪水解，快速生成脂肪酸，并氧化生成氫過(guò)氧化物，這與脂肪酶對(duì)火腿片的作用結(jié)果一致[15]。

2.2.3 茴香胺值的變化

脂肪酸氧化產(chǎn)生的氫過(guò)氧化物極不穩(wěn)定，容易分解生成次級(jí)氧化產(chǎn)物，如α或β不飽和醛，其生成量用茴香胺值（AnV）表示[19]。傳統(tǒng)泡酒過(guò)程中肉油茴香胺值的變化見(jiàn)圖4。由圖4可知，高酸價(jià)肉油與普通肉油（對(duì)照組）的AnV都隨浸泡時(shí)間的增加而逐漸升高，且高酸價(jià)肉油的AnV高于對(duì)照組普通肉油。浸泡0～60 d內(nèi)，高酸價(jià)肉油的AnV升高速度較快且幅度較大；而普通肉油（對(duì)照組）的AnV升高速度緩慢且幅度極小。當(dāng)浸泡時(shí)間為60 d時(shí)，高酸價(jià)肉油的AnV為1.30±0.13，是同時(shí)期對(duì)照組的5.65倍（P＜0.05）。這表明脂肪酶制備得到的高酸價(jià)肉油氧化產(chǎn)生的大量氫過(guò)氧化物，進(jìn)一步分解為醛、酮、酸等低分子物質(zhì)[12]。

圖4 傳統(tǒng)泡酒過(guò)程中肉油茴香胺值的變化Fig.4 Changes of anisidine value of pork fat pulp during traditional liquor soaking

2.3 傳統(tǒng)泡酒過(guò)程中高酸價(jià)肉油脂肪酸的變化

傳統(tǒng)泡酒過(guò)程中高酸價(jià)肉油長(zhǎng)鏈脂肪酸組成的變化見(jiàn)表1。

由表1可知，浸泡0 d時(shí)，高酸價(jià)肉油的脂肪酸總量為（58.20±0.18）g/100 g，比普通肉油（對(duì)照組）[（55.63±0.95）g/100 g]提高了4.62%；飽和脂肪酸（saturated fatty acid，SFA）和不飽和脂肪酸（unsaturated fatty acid，UFA）分別是普通肉油（對(duì)照組）的1.07倍和1.01倍，這可能是因?yàn)橹久复龠M(jìn)肉油脂肪水解并釋放了更多的脂肪酸[20]。浸泡60 d時(shí)，高酸價(jià)肉油的脂肪酸總量為（51.99±0.16）g/100 g，普通肉油（對(duì)照組）的脂肪酸總量為（58.96±0.33）g/100 g，這可能是因?yàn)楦咚醿r(jià)肉油的脂質(zhì)氧化速度快于普通肉油（對(duì)照組），脂肪酸迅速被氧化降解為氫過(guò)氧化物、醛、酮等物質(zhì)，導(dǎo)致其脂肪酸總量減少[21]?？傮w而言，高酸價(jià)肉油的飽和脂肪酸（SFA）、單不飽和脂肪酸（monounsaturated fattyacid，MUFA）、多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFA）和脂肪酸總量的變化趨勢(shì)都與普通肉油（對(duì)照組）的變化趨勢(shì)一致，其中C16：0、C18：1和C18：0是兩組肉油中含量最豐富的3種脂肪酸，這與李玲芳等[22]的研究結(jié)果一致。浸泡60 d時(shí)，C16：0、C18：1和C18：0的含量分別占高酸價(jià)肉油脂肪酸總量的38.07%、28.54%和17.45%，分別占普通肉油（對(duì)照組）脂肪酸總量的35.80%、28.82%和19.30%。

2.4 傳統(tǒng)泡酒過(guò)程中高酸價(jià)肉油揮發(fā)性化合物的變化

通過(guò)SPME-GC-MS測(cè)定固定化脂肪酶處理前后的肉油及其在傳統(tǒng)浸制條件下浸泡60 d后的揮發(fā)性物質(zhì)組成，結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2可知，肉油中共檢測(cè)出43種揮發(fā)性化合物，包括5種醇類，4種醛類，11種酯類，16種碳?xì)浠衔铮?種呋喃，1種醚類和5種含氮化合物。

表2 肉油在傳統(tǒng)條件下浸泡0 d和60 d的揮發(fā)性化合物組成Table 2 Composition of volatile compounds in pork fat pulp soaked for 0 d and 60 d under traditional conditions mg/kg

續(xù)表

浸泡0 d時(shí)，普通肉油（對(duì)照組）和高酸價(jià)肉油的揮發(fā)性化合物組成相似。其中，2,4-二甲基己烷未在高酸價(jià)肉油中檢出，甲氧基苯肟未在普通肉油（對(duì)照組）中檢出。與普通肉油（對(duì)照組）相比，高酸價(jià)肉油中正己醛的含量顯著提高了229%（P＜0.05）。正己醛具有青草氣味，被認(rèn)為是ω-6不飽和脂肪酸的氧化產(chǎn)物[23]，推測(cè)是脂肪酶的作用促進(jìn)脂質(zhì)降解和氧化。

浸泡60 d時(shí)，高酸價(jià)肉油的揮發(fā)性化合物種類共有38種，含量為（46.99±0.50）mg/kg，其種類和含量分別比普通肉油（對(duì)照組）提高40.74%和25.74%。其中，酯類和醛類物質(zhì)的含量增加最明顯，高酸價(jià)肉油的酯類和醛類含量分別是普通肉油（對(duì)照組）的5.99倍和4.29倍，醛類物質(zhì)含量的增加可能是高酸價(jià)肉油脂質(zhì)氧化程度較高產(chǎn)生大量次級(jí)氧化產(chǎn)物導(dǎo)致的[16]；酯類物質(zhì)含量的增加可能是來(lái)源于齋酒本身的成分?jǐn)U散[24]，也可能來(lái)源于高酸價(jià)肉油氧化產(chǎn)生的酸類物質(zhì)與齋酒中的乙醇發(fā)生的酯化反應(yīng)[25]。與浸泡60 d的普通肉油（對(duì)照組）相比，高酸價(jià)肉油中的正己醛和壬醛分別是對(duì)照組的5.36倍和3倍。順-2-壬烯-1-醇、庚醛、乙酸苯乙酯、壬酸乙酯、9-癸烯酸乙酯以及一些芳香烯類物質(zhì)為高酸價(jià)肉油特有的成分，未在普通肉油（對(duì)照組）中檢出。順-2-壬烯-1-醇被描述為綠色的、脂肪的味道[26]，庚醛具有獨(dú)特的脂肪香味[27]，而乙酯類具有強(qiáng)烈的果味和低閾值[28]，一些芳香烯如D-檸檬烯可以提供花香[29]、柑橘香[30]，α-蒎烯則可以提供薄荷香[25]。

對(duì)照組中，浸泡60 d的肉油的揮發(fā)性化合物的種類是浸泡0 d的3.86倍，其含量比浸泡0 d的提高了22.65%；高酸價(jià)肉油中，浸泡60 d的肉油的揮發(fā)性化合物的種類是浸泡0 d的5.43倍，其含量比浸泡0 d的提高了52.17%。說(shuō)明齋酒浸泡過(guò)程能促進(jìn)肉油和高酸價(jià)肉油的揮發(fā)性化合物釋放，且高酸價(jià)肉油比未經(jīng)脂肪酶處理的肉油具有更高豐度的揮發(fā)性化合物。

3 結(jié)論

固定化脂肪酶處理肉油16 h可獲得高酸價(jià)肉油，其酸價(jià)是普通肉油（對(duì)照組）的66倍，達(dá)到（26.32±2.01）mg/g；該高酸價(jià)肉油在傳統(tǒng)條件下泡酒60 d后，其酸價(jià)和茴香胺值分別是普通肉油（對(duì)照組）的58.11倍和5.65倍，其過(guò)氧化值比對(duì)照組提高了32%，說(shuō)明脂肪酶促進(jìn)了脂質(zhì)的水解和氧化。傳統(tǒng)泡酒過(guò)程中，高酸價(jià)肉油的飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸、多不飽和脂肪酸和脂肪酸總量的變化趨勢(shì)均與對(duì)照組普通肉油的變化趨勢(shì)一致，其中C16：0、C18：1和C18：0含量最豐富，分別占總含量的38.07%、28.54%和17.45%。脂肪酶作用前后肉油的揮發(fā)性化合物種類相差不大，但經(jīng)過(guò)齋酒浸泡60 d后，其揮發(fā)性化合物的種類和含量都顯著提高，且高酸價(jià)肉油更具有產(chǎn)生豐富風(fēng)味的潛力，其揮發(fā)性化合物的種類和含量較對(duì)照組分別提高40.74%和25.74%，其中酯類和醛類物質(zhì)的含量增加最明顯，分別是對(duì)照組的5.99倍和4.29倍。綜上，固定化脂肪酶可以促進(jìn)泡酒肉油的脂質(zhì)氧化和揮發(fā)性物質(zhì)產(chǎn)生，為豉香白酒肥肉陳化工藝創(chuàng)新提供潛在途徑。