高效液相色譜法測定乳酸菌發(fā)酵液中γ-氨基丁酸

劉宗樂，高林森，張東東，韓俊華，趙娟娟，高文惠*

（1.河北科技大學(xué) 食品與生物學(xué)院，河北 石家莊 050018；2.河北省農(nóng)林科學(xué)院農(nóng)業(yè)信息與經(jīng)濟(jì)研究所，河北 石家莊 050050；3.河北省果蔬發(fā)酵技術(shù)創(chuàng)新中心（籌）（SG2021129），河北 衡水 053000）

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是一種非蛋白氨基酸。目前，GABA作為重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，在生理活性、作用機(jī)制以及制備方法等方面已經(jīng)有了較為深入的研究。研究發(fā)現(xiàn)，通過γ-氨基丁酸A型受體（γ-aminobutyric acidAreceptor，GABAAR）、γ-氨基丁酸B型受體（γ-aminobutyric acid B receptor，GABABR）和γ-氨基丁酸C型受體（γaminobutyric acid C receptor，GABACR）這三種受體，GABA可以起到調(diào)節(jié)情緒[1]、改善睡眠質(zhì)量[2]和增強(qiáng)記憶力[3]等作用。此外，GABA在癲癇[4-5]、降血壓[6]、糖尿病[7]以及一些神經(jīng)系統(tǒng)疾病[8]中發(fā)揮著有益作用。微生物發(fā)酵法是制備GABA的主要方法之一，該方法具有得率高、安全性好以及條件溫和等優(yōu)點(diǎn)[9]，其合成機(jī)制是利用乳酸菌、酵母菌、霉菌等微生物體內(nèi)谷氨酸脫羧酶催化L-谷氨酸脫羧形成GABA[10]。短乳桿菌與希氏乳桿菌發(fā)酵制備的GABA已被批準(zhǔn)為新資源食品，在食品工業(yè)中有著良好的應(yīng)用前景，建立適用于發(fā)酵液中定量分析GABA的檢測方法對評價(jià)乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)品質(zhì)量具有參考意義。

目前，針對國內(nèi)外關(guān)于GABA的檢測方法主要有高效液相色譜法、紙層析-酶標(biāo)儀法、毛細(xì)管電泳法等。農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)NY/T2890—2016《稻米中γ-氨基丁酸的測定高效液相色譜法》[11]，以4-二甲基胺基偶氮苯-4-磺酰氯作為衍生化試劑，但樣品前處理較復(fù)雜且耗時(shí)長。郭海洋等[12]采用超高效液相色譜法對乳酸菌發(fā)酵液中GABA含量進(jìn)行測定，目標(biāo)物保留時(shí)間較長。張敏等[13]采用紙層析-酶標(biāo)儀法測定了微孔板發(fā)酵液中GABA產(chǎn)量，HAGI T等[14]采用毛細(xì)管電泳法對乳酸菌發(fā)酵乳中GABA含量進(jìn)行了測定，但紙層析-酶標(biāo)儀法和毛細(xì)管電泳法精密度相對較低。為此需開發(fā)簡單、快速、精密準(zhǔn)確的檢測發(fā)酵液中GABA方法。與多數(shù)氨基酸一樣，GABA需要通過衍生化處理來實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)物質(zhì)的定量測定，鄰苯二甲醛（O-phthalaldehyde，OPA）[15-16]、丹磺酰氯[17-18]、2,4-二硝基氟苯[19-20]和異硫氰酸苯酯[21]等是常用的衍生劑。其中，OPA相比后3種衍生試劑具有操作簡便，反應(yīng)快速，且本身不具有紫外吸收等優(yōu)點(diǎn)。

本試驗(yàn)擬采用OPA作為柱前衍生化試劑，通過單因素試驗(yàn)，研究衍生試劑濃度、衍生時(shí)間和衍生溫度的影響，優(yōu)化并選擇檢測波長、流動相比例和柱溫條件，建立一種簡單、靈敏、精密準(zhǔn)確，適用于乳酸菌發(fā)酵液中GABA的定量分析方法，為篩選高產(chǎn)GABA乳酸菌菌株提供理論依據(jù)，同時(shí)為開發(fā)高效GABA發(fā)酵工藝提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

分離自桑葚、藍(lán)莓中的5株乳酸菌，經(jīng)生理生化特征及16S rDNA序列測序鑒定，均為植物乳桿菌（Lactiplantibacillus plantarum），本實(shí)驗(yàn)室保存菌種。

1.1.2 化學(xué)試劑

GABA標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99%）：上海源葉生物科技有限公司；OPA、β-巰基乙醇（純度99%）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙腈（色譜純）：天津賽孚瑞科技有限公司；氫氧化鈉、結(jié)晶乙酸鈉、冰乙酸、硼酸（均為分析純）：天津市永大化學(xué)試劑有限公司；L-谷氨酸鈉（分析純）：山東西亞化學(xué)股份有限公司；實(shí)驗(yàn)室用水為超純水。

1.1.3 培養(yǎng)基

MRS液體培養(yǎng)基：蒸餾水1.0 L，蛋白胨10.0 g，葡萄糖10.0 g，結(jié)晶乙酸鈉5.0 g，牛肉浸粉5.0 g，酵母浸粉4.0 g，檸檬酸胺2.0 g，吐溫-80 1.0 mL，磷酸氫二鉀2.0 g，MnSO4·H2O 0.05 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，pH值調(diào)至6.8，121 ℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：在上述MRS液體培養(yǎng)基中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的L-谷氨酸鈉，pH值調(diào)至6.8，121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1260高效液相色譜儀：安捷倫科技（中國）有限公司；UPT-I-10T超純水制備機(jī)：四川優(yōu)普超純科技有限公司；TGL-16C高速離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；ST3100實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)：奧豪斯儀器有限公司；KH5200超聲波清洗儀：昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；SHB-3A循環(huán)水式多用真空泵：鄭州杜甫儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌發(fā)酵液制備

分別將5株乳酸菌在無菌環(huán)境下接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)12 h，轉(zhuǎn)接3次至菌株活力恢復(fù)至正常生長狀態(tài)，得到種子液。種子液以4%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)48 h，得到5株乳酸菌發(fā)酵液，編號為樣品1#～5#。分別取適量樣品1#～5#，10 000 r/min離心10 min，將所得上清液過0.22 μm有機(jī)濾膜，待檢測使用。

1.3.2 溶液的配制

GABA標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：準(zhǔn)確稱取10.0 mg GABA標(biāo)準(zhǔn)品用水溶于10mL容量瓶中，定容，得到質(zhì)量濃度為1.00mg/mL的母液，并依次稀釋為0.05 μg/mL、0.1 μg/mL、3 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、250 μg/mL、400 μg/mL和500 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于0～4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

硼酸緩沖液的配制：稱取2.47 g硼酸溶于85 mL水中，用氫氧化鈉調(diào)pH=10.4，定容至100 mL，置于0～4 ℃可保存7 d。

OPA衍生液的配制：準(zhǔn)確稱取5.0 mg OPA，超聲溶解于2.5 mL乙腈中，再加入β-巰基乙醇10 μL，置于0～4 ℃避光，可保存7 d。

1.3.3 衍生條件的優(yōu)化

由于GABA本身無紫外吸收，故標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液中的GABA需要進(jìn)行衍生化處理，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)定量測定目標(biāo)物質(zhì)的目的。本試驗(yàn)采用OPA作為柱前衍生化試劑，使OPA與GABA在pH=10.4的硼酸緩沖液反應(yīng)體系下發(fā)生衍生化反應(yīng)，生成具有紫外吸收的物質(zhì)，但該生成物的穩(wěn)定性差。因此，試驗(yàn)對不同衍生試劑濃度（5～30 mmol/L）、不同衍生時(shí)間（1～7 min）和不同衍生溫度（室溫～65 ℃）的影響進(jìn)行了考察。

操作流程：用移液槍分別量取1.3.2配制的硼酸緩沖液400 μL、OPA衍生液80 μL以及GABA標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣品溶液80 μL，混合，即衍生反應(yīng)開始，過0.22 μm有機(jī)濾膜，洗針，量取20 μL，立即進(jìn)樣分析檢測，并嚴(yán)格控制整個(gè)衍生操作時(shí)間。

1.3.4 色譜條件的優(yōu)化

在上述最佳衍生條件下對GABA標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行衍生化處理，采用二極管陣列檢測器在210～400 nm范圍內(nèi)對衍生物進(jìn)行光譜掃描，根據(jù)紫外吸收和實(shí)際分離情況選擇最適檢測波長。并在該檢測波長下，考察不同流動相比例（乙腈與20 mmol/L結(jié)晶乙酸鈉體積比分別為23∶77、22∶78、21∶79、20∶80）、不同柱溫（25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃）對分離效果的影響，以確定最佳流動相比例和柱溫條件。其他色譜條件為：XBridgeC18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流速0.8 mL/min；進(jìn)樣量20 μL。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

通過Agilent 1260高效液相色譜儀配套的Chem Station工作站完成數(shù)據(jù)的采集與處理。采用Excel 2016和Origin 2019b進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和繪圖。每組試驗(yàn)重復(fù)測量3次，數(shù)據(jù)均為3次平行試驗(yàn)平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 衍生試劑濃度的影響

選取同一質(zhì)量濃度的GABA標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別采用濃度為5 mmol/L、10 mmol/L、15 mmol/L、20 mmol/L、25 mmol/L、30 mmol/L的OPA衍生劑進(jìn)行衍生化處理后快速進(jìn)樣分析檢測，以考察衍生試劑濃度對峰面積的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 鄰苯二甲醛濃度對γ-氨基丁酸衍生物峰面積的影響Fig.1 Effect of O-phthalaldehyde concentration on the peak area of γ-aminobutyric acid derivative

由圖1可知，當(dāng)OPA衍生劑濃度高于10 mmol/L后，衍生物峰面積并未隨OPA衍生劑濃度的增加而明顯增加，表明當(dāng)OPA衍生劑濃度為10 mmol/L時(shí)，GABA已基本實(shí)現(xiàn)完全衍生化。因此，選取適當(dāng)衍生劑濃度，既可減少衍生劑用量，又能避免過量衍生劑對色譜分離的影響，同時(shí)還能提高靈敏度。因此，選取最適OPA衍生試劑濃度為15 mmol/L。

2.2 衍生時(shí)間的影響

在室溫條件下，選取同一質(zhì)量濃度的GABA標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行衍生化處理，控制反應(yīng)時(shí)間分別為1 min、2 min、3 min、4 min、5 min、6 min和7 min，以考察衍生時(shí)間對峰面積的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 衍生時(shí)間對γ-氨基丁酸衍生物峰面積的影響Fig.2 Effect of derivatization time on the peak area of γ-aminobutyric acid derivative

由圖2可知，在所考察的衍生時(shí)間范圍內(nèi)，當(dāng)衍生時(shí)間增加，GABA衍生物的峰面積總體呈現(xiàn)先增加后降低的變化趨勢。當(dāng)衍生時(shí)間為1 min時(shí)，衍生反應(yīng)不完全；當(dāng)衍生時(shí)間延長至2 min時(shí)，對應(yīng)GABA衍生物峰面積最大，但由于GABA衍生物不穩(wěn)定，隨著衍生時(shí)間的延長，GABA衍生物峰面積快速下降；當(dāng)延長衍生時(shí)間至5 min后，GABA衍生物的峰面積趨于穩(wěn)定，即GABA衍生物相對穩(wěn)定。在衍生劑與樣品溶液混合后，需要進(jìn)行過濾、洗針、手動進(jìn)樣等操作，在衍生時(shí)間為2 min時(shí)，檢測靈敏度最高，但時(shí)間難以控制，為確保試驗(yàn)建立的方法具有良好的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性。因此，選取最適衍生時(shí)間為5 min。

2.3 衍生溫度的影響

選取同一質(zhì)量濃度的GABA標(biāo)準(zhǔn)溶液分別在室溫、35 ℃、45℃、55℃和65℃下進(jìn)行衍生化處理，控制反應(yīng)時(shí)間為5min，以考察不同衍生溫度對峰面積的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 衍生溫度對γ-氨基丁酸衍生物峰面積的影響Fig.3 Effect of derivatization temperature on the peak area of γ-aminobutyric acid derivative

由圖3可知，在不同衍生溫度下對應(yīng)的GABA衍生物峰面積間有著明顯差異。在所考察的衍生溫度范圍內(nèi)，當(dāng)衍生溫度升高時(shí)，GABA衍生物的峰面積呈下降的變化趨勢，說明OPA與GABA的衍生化產(chǎn)物穩(wěn)定性變差。因此，選取最適衍生化溫度為室溫。

2.4 檢測波長的選擇

按照1.3.3方法對GABA標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行衍生化處理，其衍生物經(jīng)過C18柱分離后進(jìn)入二極管陣列檢測器在210～400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，結(jié)果見圖4。

圖4 γ-氨基丁酸生物的紫外光譜掃描結(jié)果Fig.4 Ultraviolet spectrum results of γ-aminobutyric acid derivative

由圖4可知，GABA衍生物有2個(gè)特征吸收峰，分別為228 nm和334 nm。在最佳衍生條件下，設(shè)置波長分別為228 nm和334 nm，固定其他色譜條件不變，選取同一樣品進(jìn)行分析檢測。與檢測波長334 nm相比，盡管228 nm時(shí)，色譜圖有較多雜峰，但這些雜峰對于GABA的定性與定量分析并無影響，且大幅提高了分析靈敏度。因此，選擇最適檢測波長為228 nm。

2.5 流動相比例的選擇

在上述最佳衍生條件及固定色譜柱溫度為30 ℃，且其他色譜條件不變，設(shè)置流動相乙腈與20 mmol/L結(jié)晶乙酸鈉的體積比為23∶77、22∶78、21∶79和20∶80，分別對標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液中GABA進(jìn)行分離分析，考察流動相比例對目標(biāo)物質(zhì)與其他成分分離情況的影響，以確定最佳流動相比例，結(jié)果見圖5。由圖5可知，當(dāng)流動相中乙腈比例從23%變化到19%的過程中，隨著乙腈比例的降低，目標(biāo)物質(zhì)的保留時(shí)間逐漸增長。當(dāng)流動相A與B比例為23∶77時(shí)，樣品中雜質(zhì)與目標(biāo)物質(zhì)的色譜峰重疊嚴(yán)重；當(dāng)流動相A與B比例為22∶78時(shí)，目標(biāo)物質(zhì)與雜質(zhì)峰仍不能完全分離；當(dāng)流動相A與B比例為21∶79時(shí)，目標(biāo)物質(zhì)可以實(shí)現(xiàn)基線分離，且無拖尾現(xiàn)象；當(dāng)流動相A與B比例為20∶80時(shí)，樣品中雜質(zhì)與目標(biāo)物質(zhì)的色譜峰完全分離，但分析時(shí)間較長。因此，選擇流動相乙腈-20 mmol/L結(jié)晶乙酸鈉最適體積比為21∶79。

圖5 乙腈與20 mmol/L結(jié)晶乙酸鈉體積比對γ-氨基丁酸衍生物峰面積的影響Fig.5 Effect of volume ratio of acetonitrile and 20 mmol/L crystalline sodium acetate on the peak area of γ-aminobutyric acid derivative

2.6 柱溫的選擇

在上述最佳衍生條件及固定流動相為乙腈-20 mmol/L結(jié)晶乙酸鈉溶液體積比21∶79，且其他色譜條件不變，設(shè)置柱溫為25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃，分別對標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液中GABA進(jìn)行分析檢測，考察柱溫對分離效果的影響，以確定最佳柱溫條件，結(jié)果見圖6。

當(dāng)色譜柱溫度為40 ℃和35 ℃時(shí)，樣品中雜質(zhì)與GABA衍生物的色譜峰分離效果不佳。當(dāng)色譜柱溫度為30℃和25℃時(shí)，目標(biāo)物質(zhì)均可以實(shí)現(xiàn)基線分離。但由于提高柱溫可以縮短分析時(shí)間，故選擇最適柱溫為30℃。30℃條件下樣品的HPLC色譜圖見圖6。由圖6可知，在最佳色譜條件下，0.1 mg/mL GABA標(biāo)準(zhǔn)品和乳酸菌發(fā)酵液樣品的保留時(shí)間為11.2 min。

圖6 γ-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)品（a）及乳酸菌發(fā)酵液樣品（b）的HPLC色譜圖Fig.6 HPLC chromatograms of γ-aminobutyric acid standard (a) and lactic acid bacteria fermentation broth sample (b)

2.7 線性關(guān)系與檢出限

在室溫條件下，對1.3.2配制的質(zhì)量濃度為0.05 μg/mL～0.50 mg/mL的一系列GABA標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行衍生化處理，按照最佳色譜條件進(jìn)樣，以考察GABA質(zhì)量濃度與峰面積的線性關(guān)系。以GABA質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，以峰面積（y）為縱坐標(biāo)，繪制GABA標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，GABA質(zhì)量濃度在0.05 μg/mL～0.50 mg/mL之間線性關(guān)系好（相關(guān)系數(shù)R2=0.999 4），且線性范圍寬，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為y=66.452x-136.82，檢出限為0.02 μg/mL（S/N=3）。

2.8 回收率和精密度的測定

在GABA質(zhì)量濃度為0.5 μg/mL、5 μg/mL、50 μg/mL3個(gè)添加水平下，進(jìn)行加標(biāo)回收率和精密度試驗(yàn)，結(jié)果見表1。由表1可知，樣品的平均加標(biāo)回收率為91.87%～105.58%，精密度試驗(yàn)結(jié)果相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviations，RSD）為0.55%～3.74%（n=5）。結(jié)果表明，試驗(yàn)建立的方法準(zhǔn)確度和精密度良好，分析方法可靠，且適用于乳酸菌發(fā)酵液中GABA含量的檢測。

表1 加標(biāo)回收率和精密度試驗(yàn)結(jié)果（n=5）Table 1 Results of standard recovery rate test and precision tests (n=5)

2.9 實(shí)際樣品的測定

按照1.3.1方法對乳酸菌發(fā)酵液樣品進(jìn)行制備及處理，按照1.3.3對樣品進(jìn)行衍生化處理，在最佳色譜分析條件下進(jìn)樣檢測，并計(jì)算發(fā)酵液中GABA的含量，結(jié)果見表2。由表2可知，所測乳酸菌發(fā)酵液樣品中均含有GABA，且含量在0.157～0.369 mg/mL之間，表明這幾株乳酸菌均具有發(fā)酵表達(dá)谷氨酸脫羧酶合成GABA的能力。由于GABA的合成與不同菌種、菌株以及發(fā)酵培養(yǎng)基條件等有著密切關(guān)系，使其合成GABA的含量具有一定差異。結(jié)果表明，在最佳色譜條件下，對經(jīng)衍生處理后的乳酸菌發(fā)酵液進(jìn)行檢測，乳酸菌發(fā)酵液中目標(biāo)物質(zhì)與其他成分具有良好的分離效果，而且該檢測方法較文獻(xiàn)方法簡單[22]、靈敏[23-25]。

表2 不同乳酸菌發(fā)酵液樣品中γ-氨基丁酸含量Table 2 γ-aminobutyric acid contents in the different lactic acid bacteria fermentation broth samples

3 結(jié)論

試驗(yàn)通過考察衍生試劑濃度、衍生時(shí)間和衍生溫度的影響，檢測波長、流動相比例和柱溫的優(yōu)化與選擇，建立了一種適用于檢測乳酸菌發(fā)酵液中GABA的高效液相色譜法，并對實(shí)際樣品進(jìn)行測定。結(jié)果表明，以O(shè)PA作為衍生化試劑，在室溫下進(jìn)行衍生化處理，控制反應(yīng)時(shí)間為5 min，按照檢測波長228 nm，流動相為乙腈-20 mmol/L結(jié)晶乙酸鈉溶液體積比21∶79，柱溫30 ℃，流速0.8 mL/min的色譜條件快速進(jìn)樣分析檢測，目標(biāo)色譜峰分離效果好，質(zhì)量濃度在0.05 μg/mL～0.50 mg/mL之間線性關(guān)系好（相關(guān)系數(shù)R2=0.999 4），且線性范圍寬，檢出限為0.02 μg/mL，準(zhǔn)確度和精密度良好，試驗(yàn)建立的方法簡單、靈敏、準(zhǔn)確可靠，適用于乳酸菌發(fā)酵液中GABA含量的檢測，為篩選高產(chǎn)GABA的乳酸菌、優(yōu)化發(fā)酵工藝提供了依據(jù)，對提高乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)品質(zhì)量具有重要作用。