UPLC-MS/MS測定啤酒中茚嗪氟草胺及其代謝物殘留量

吳敏蓮，黃偉乾，吳俊發(fā)，吳國輝，葉 玲，黃曼谷

（廣州檢驗檢測認證集團有限公司 國家加工食品質(zhì)量檢驗中心（廣東），廣東 廣州 511447）

除草劑是一類廣泛應(yīng)用在農(nóng)業(yè)發(fā)展上，用于防治雜草和有害植物的藥劑。其中三嗪類除草劑成本較低，針對于闊葉和禾本科雜草有很好的抑制作用[1]。通過作用于光合系統(tǒng)Ⅱ，影響電子傳遞，從而抑制植物的光合作用[2-3]，達到除草效果。茚嗪氟草胺是拜耳作物科學(xué)公司近年來研發(fā)的一種新型三嗪類除草劑，因此相關(guān)的毒理研究報道尚較少。有研究表明，三嗪類除草劑能對生物體脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）造成一定的損傷[4]，并引起生物體的生理紊亂[5]。同時，除草劑的實用也可能對作物的產(chǎn)量造成影響[6-7]，甚至?xí)σ恍├ハx的生理造成損傷[8-9]。在釀造工業(yè)中，作物在預(yù)處理不充分的情況下，除草劑較容易在酒中殘留[10-11]，從而對消費者的健康造成威脅。同時，雖然茚嗪氟草胺目前只在澳大利亞及美國等一些美洲國家登記使用，但在中國仍未登記，因此相關(guān)的檢測方法和法律法規(guī)仍未建立，可能存在貿(mào)易輸入或不法商家濫用的風(fēng)險，建立有效測定酒中除草劑的分析方法意義重大。

目前，除草劑的檢測方法主要集中在液相色譜法[12]、氣相色譜法[13-14]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[15-19]和氣相色譜-質(zhì)譜法[20-25]。其中，液相色譜法和氣相色譜法靈敏度相對質(zhì)譜法較低，對目標物選擇性較差，因此，結(jié)果容易受到雜質(zhì)的影響，使結(jié)果造成偏差。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法和氣相色譜-質(zhì)譜法對目標物選擇性強，對多組分進行分析時，時間短，且儀器靈敏度較高，適合農(nóng)藥殘留量的分析測定。本研究基于分散固相萃取技術(shù)，建立了同時測定啤酒中茚嗪氟草胺及其代謝物的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS），該方法相對于目前普遍的三嗪類除草劑分析方法，分析時間短，選擇性強，可同時對代謝物殘留量進行監(jiān)測，目前國內(nèi)外的相關(guān)分析方法報道較少，可為后續(xù)研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

啤酒：廣州市售；無水硫酸鎂、氯化鈉（分析純）：廣州化學(xué)試劑廠；中性氧化鋁（alumina N，Al-N）；N-丙基乙二胺（primary secondary amine，PSA）、石墨化碳黑（graphitized carbon black，GCB）、硅膠鍵合十八烷基（silica gel bonded octadecyl，C18）；甲醇、乙酸乙酯、乙腈（均為色譜純）：美國Fisher公司；1-氟乙基三嗪二胺、三嗪-茚滿酮、茚嗪氟草胺-烯烴、茚嗪氟草胺標準品（純度≥93.0%）：德國拜爾公司；實驗用水為經(jīng)Milli-Q純水系統(tǒng)制得的超純水（電阻率為18.2 MΩ·cm-1）。

1.2 儀器與設(shè)備

API4000QTRAP質(zhì)譜儀：美國ABSCIEX公司；LC-20AD島津液相色譜系統(tǒng)：日本島津公司；Milli-Q Advantage A10超純水系統(tǒng)：法國Merck Millipore公司；TGL-16MH2050R高速離心機：湘儀離心機儀器有限公司；NMSG-12多管渦旋震蕩儀：泰州諾米醫(yī)療科技有限公司；KQ-500DE超聲波清洗機：昆山市超聲儀器有限公司；Vibramax 100臺式搖床：德國Heidolph公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液的配制

分別準確稱取4種標準品各0.010 0 g于100 mL棕色具塞容量瓶中，用乙腈定容，配制成100 mg/L儲備液，用空白基質(zhì)溶液稀釋至質(zhì)量濃度分別為1.00 μg/L、2.00 μg/L、5.00 μg/L、10.0 μ g/L、20.0 μg/L、50.0 μg/L的標準工作溶液。

1.3.2 樣品前處理

提?。悍Q取2 g試樣（精確至0.01 g）于50 mL聚四氟乙烯具塞離心管中，加入8 mL水，振搖使分散均勻，再加入10 mL乙腈，渦旋振蕩1 min，加入4 g無水硫酸鎂和1.0 g氯化鈉的混合粉末，迅速振搖，渦旋振蕩提取15 min，以4 000 r/min離心5 min。

凈化：稱取（100±5）mgC18置于2mL聚四氟乙烯具塞離心管中，移取待凈化液1 mL至此離心管中，渦旋混合2 min，以12 000 r/min離心5 min，0.22 μm有機相濾膜過濾，取濾液備用待測。

1.3.3 色譜及質(zhì)譜條件

色譜條件：Waters Atlantis T3色譜柱（150 mm×2.1 mm，3.0 μm）；柱溫：40 ℃；進樣量：10 μL；流動相A為乙腈，B為0.1%甲酸（含5 mmol/L甲酸銨）-水（V/V），采用等度洗脫方式洗脫分離：0.0～5.0 min，80%A-20%B；流速：0.35 mL/min。

質(zhì)譜條件：離子源為電噴霧電離源，離子化模式為正離子模式，氣簾氣35 psi，毛細管電壓5 500 V，離子源溫度550 ℃，霧化氣壓力50 psi，加熱輔助氣壓力50 psi，碰撞氣（CAD）：medium，采集模式為多反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）。

1.3.4 前處理條件和基質(zhì)效應(yīng)的探討

以陰性樣品為實驗對象，回收率為考察指標，優(yōu)化固相萃取劑及用量和乙腈提取用量，另外，以空白樣品處理后的基質(zhì)液配制標準溶液，使用基質(zhì)效應(yīng)公式計算相應(yīng)結(jié)果。

1.3.5 方法學(xué)驗證

選取陰性樣品進行低濃度加標，以信噪比確定方法的檢出限（limit of detection，LOD）和定量限（limit of quantitation，LOQ），按照定量限的1、2、10倍進行加標回收實驗，每個水平重復(fù)6次平行樣品，所得回收率計算相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

所得數(shù)據(jù)以Excel 2016軟件統(tǒng)計并進行計算，以公式擬合標準曲線方程和計算出回收率和相對標準偏差，目標物的定量離子流圖導(dǎo)出后，用Origin 8.5軟件重新繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件及質(zhì)譜條件的確定

由于茚嗪氟草胺及其3種代謝物在結(jié)構(gòu)上均含有N原子[26]，屬于親核型化合物，因此在正離子模式下，更趨向于生成穩(wěn)定的[M+H]+母離子，在流動相中加入甲酸作為質(zhì)子供體，可提高一級母離子的質(zhì)譜響應(yīng)，另外加入甲酸銨可增大流動相離子強度，改善峰型。4種目標物標準溶液分別在混合流動相的情況下，以流動注射的方式對母離子及各子離子進行掃描，逐步優(yōu)化母離子和各個子離子的去簇電壓（declustering potential，DP）和碰撞能量（collision energy，CE）等參數(shù)條件，以到達最大響應(yīng)，最終選取響應(yīng)最高的子離子作為定量離子，響應(yīng)次之的作為輔助定性離子。具體定量離子的提取離子流圖和質(zhì)譜參數(shù)分別見圖1和表1。

表1 4種目標化合物的質(zhì)譜分析參數(shù)Table 1 Mass spectrometry parameters of 4 targeted compounds

圖1 4種目標化合物的UPLC-MS/MS總離子流色譜圖Fig.1 UPLC-MS/MS total ion flow chromatograms of 4 targeted compounds

2.2 茚嗪氟草胺及其代謝物的質(zhì)譜裂解途徑分析

根據(jù)茚嗪氟草胺及其代謝物的質(zhì)譜碎片響應(yīng)強度，可確定4種目標化合物在質(zhì)譜中形成的主要碎片為m/z158和m/z138，4種目標化合物均選擇這兩個碎片作為定量離子。在二級質(zhì)譜碰撞電壓的轟擊下，三嗪環(huán)上的仲胺基-NH所連接的C-N鍵斷裂，三嗪環(huán)上的N結(jié)合H+形成帶正電荷，質(zhì)荷比為m/z158和m/z138的碎片通過四極桿，其余部分帶負電或作為中性粒子丟失，而部分m/z158的碎片進一步丟失一分子的F和H，形成雙鍵，繼續(xù)產(chǎn)生m/z138的碎片。具體途徑見圖2。最終，以化合物的母離子和響應(yīng)最高的兩個子離子的質(zhì)荷比，結(jié)合出峰時間進行定性。

圖2 4種目標化合物的質(zhì)譜裂解途徑Fig.2 Mass spectrometry fragmentation pathways of 4 targeted compounds

2.3 凈化劑的種類選擇及用量優(yōu)化

實驗前期先使用100 mg的PSA、GCB、C18和Al-N對4種目標物的標準溶液進行吸附，以考察不同的固相萃取劑對4種目標物的吸附程度，結(jié)果見圖3。由圖3可知，C18和Al-N對4種目標物的吸附效果較小，但Al-N相對于C18，對1-氟乙基三嗪二胺的吸附仍然較大，回收率只有57.6%，而C18處理后，4種目標物的回收率均在88%～102%之間，因此C18作為固相萃取劑進行進一步的用量優(yōu)化。

圖3 不同萃取劑對4種目標化合物回收率的影響（n=6）Fig.3 Effect of different extractants on recovery rate of 4 targeted compounds (n=6)

分別使用50 mg、75 mg、100 mg、125 mg、150 mg的C18固相萃取劑進行實驗，重復(fù)6次平行樣品，結(jié)果見圖4。由圖4可知，當用量＜100 mg時，4種目標物回收率較低，可能是由于凈化不充分，分析結(jié)果受到雜質(zhì)的影響，從而回收率變低。而當用量＞100 mg之后，回收率變化不明顯，說明C18使用量在100～150 mg之間，不會對目標物產(chǎn)生明顯的吸附，為了降低檢驗成本，最終選擇100 mg為凈化用量。

圖4 不同C18用量對4種目標化合物回收率的影響（n=6）Fig.4 Effect different of C18 dosage on recovery rate of 4 targeted compounds (n=6)

2.4 乙腈用量對回收率的影響

在C18用量為100 mg的條件下，以啤酒作為實驗樣品，選擇5 mL、10 mL、15 mL、20 mL、25 mL乙腈進行提取實驗，以對應(yīng)體積空白基質(zhì)液配得的基質(zhì)曲線進行校正，以確?；|(zhì)效應(yīng)不會因乙腈稀釋而變化，最終回收率作為考察依據(jù)。結(jié)果表明，乙腈用量為10 mL時，回收率達到分析測定要求，當用量繼續(xù)增大，回收率變化不明顯，綜合考慮操作便捷性和耗材成本，最終選取10 mL為最佳乙腈用量。

2.5 基質(zhì)效應(yīng)分析

由于啤酒經(jīng)小麥發(fā)酵而制得，因此啤酒中含有大量的氨基酸、多肽、酒精和還原糖等小分子物質(zhì)，在離子化的過程中會產(chǎn)生較強的基質(zhì)效應(yīng)（matrix effect，ME）。實驗分別使用空白基質(zhì)溶液和乙腈按照1.3.1的方法配制標準曲線于儀器測定。以ME值計算公式：（k1/k2-1）×100%計算基質(zhì)效應(yīng)程度，其中k1為基質(zhì)曲線斜率，k2為純?nèi)軇┣€斜率，結(jié)果見表2。由表2可知，4種目標化合物基質(zhì)均呈負效應(yīng)，且抑制率遠超過-20%，抑制效應(yīng)明顯，因此需要使用基質(zhì)曲線進行定量計算。

表2 4種目標化合物的基質(zhì)效應(yīng)值Table 2 Matrix effect value of 4 targeted compounds

2.6 線性方程、方法檢出限和定量限

按照1.3.2的前處理方法處理空白樣品，所得空白基質(zhì)液配制基質(zhì)曲線，質(zhì)量濃度范圍為1.0～50 μg/L。在優(yōu)化后的儀器條件下進行測定，以質(zhì)量濃度為橫坐標（X）和峰面積為縱坐標（Y）采用Excel 2016軟件中擬合曲線方程，并得出相關(guān)系數(shù)R2。結(jié)果表明，相關(guān)系數(shù)R2均大于0.999，說明線性關(guān)系較好，曲線能準確定量。同時通過低濃度的加標實驗，以信噪比3倍（S/N=3）和信噪比10倍（S/N=10）確定方法檢出限（LOD）和定量限（LOQ），4種目標化合物的LOD為2.0 μg/kg，LOQ為5.0 μg/kg，方法整體靈敏度較高，滿足一般產(chǎn)品除草劑殘留量的檢測需求，具體線性方程和靈敏度參數(shù)見表3。

表3 4種目標化合物線性方程及靈敏度參數(shù)Table 3 Linear equations and sensitivity parameters of 4 targeted compounds

2.7 加標回收率試驗及精密度試驗

選取市售啤酒作為加標實驗樣品，以4種目標化合物的方法定量限為基準進行1、2、10倍水平的添加，每個水平日內(nèi)重復(fù)6個平行樣品測定，計算出相應(yīng)的回收率和相對標準偏差。結(jié)果見表4。由表4可知，4種目標化合物的平均回收率為85.4%～98.1%，精密度試驗的相對標準偏差（RSD）為2.29%～4.55%，結(jié)果說明方法的回收率高，重現(xiàn)性較好，可用于日常檢測中。

表4 4種目標化合物的加標回收率和精密度實驗（n=6）Table 4 Standard recovery rate and precision test of 4 targeted compounds (n=6)

2.8 方法實際應(yīng)用

實驗隨機選取實驗室日常啤酒樣品（進口樣品10個，國內(nèi)樣品10個）進行測定，結(jié)果均未檢出。但在2017年，美國環(huán)保署分別對茚嗪氟草胺的毒理性和致癌性開展了風(fēng)險評估，其中結(jié)果認為干啤酒花中，茚嗪氟草胺的使用限量為0.06 mg/kg。因此，本方法可為后續(xù)的分析測定方法開發(fā)提供技術(shù)儲備。

3 結(jié)論

實驗基于分散固相萃取技術(shù)結(jié)合UPLC-MS/MS建立了啤酒中茚嗪氟草胺及其3種代謝物的分析方法。通過C18固相萃取劑對提取液進行凈化，降低了啤酒中雜質(zhì)對目標物的基質(zhì)效應(yīng)，同時提高了回收率，最終結(jié)果使用基質(zhì)曲線進行校正。結(jié)合超高效液相色譜和優(yōu)化的流動相配比，茚嗪氟草胺及其3種代謝物在2 min內(nèi)完成出峰，且峰型良好。加標回收實驗結(jié)果表明，準確度和精密度較高，為啤酒中除草劑檢測方法的開發(fā)與研究提供了一定參考依據(jù)。