丁草胺降解菌P10的分離鑒定及其對(duì)植株修復(fù)效果的研究

彭亞軍，程小梅，王俊華，李 欣，蔡海林，周小毛，柏連陽(yáng),2

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)藥研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.湖南人文科技學(xué)院，湖南 婁底 417000）

丁草胺是一種高效內(nèi)吸傳導(dǎo)型苯乙酰胺類芽前除草劑，對(duì)以種子萌發(fā)的雜草有很好的防除效果。由于其性質(zhì)穩(wěn)定，土壤中丁草胺的降解主要是由微生物完成的[1-4]，所以篩選丁草胺高效降解菌的意義重大。目前，已篩選出很多丁草胺高效降解菌[5-6]，但還未見(jiàn)利用降解菌來(lái)修復(fù)丁草胺藥害植株的相關(guān)報(bào)道。筆者通過(guò)室內(nèi)盆栽試驗(yàn)研究了丁草胺降解菌P10對(duì)丁草胺藥害植株的修復(fù)效果，為丁草胺污染的生物治理提供了一條有效途徑。

1 材料與方法

1.1 供試原藥及培養(yǎng)基

土樣采自有長(zhǎng)期生產(chǎn)丁草胺經(jīng)歷的江蘇常隆化工有限公司。

供試藥劑為95%的丁草胺原藥（安徽豐樂(lè)農(nóng)化有限責(zé)任公司）。

基 礎(chǔ) 鹽 培 養(yǎng) 基 ：K2HPO41 g，KH2PO41 g，NH4NO31 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，NaCl 0.2 g，微量元素液1 mL，蒸餾水1 000 mL，pH值7.2~7.4。

半固體基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基：在基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中加入0.4%的瓊脂粉。

LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母膏5 g，NaCl 10 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 值 7.0~7.2。

1.2 丁草胺降解菌的富集和分離

在含50 mg/L丁草胺的基礎(chǔ)鹽液體培養(yǎng)基中加入5 g采集的土樣，于30℃恒溫?fù)u床中黑暗振蕩培養(yǎng)，振蕩頻率為150 r/min；每隔1周以5%（體積分?jǐn)?shù)）的接種量轉(zhuǎn)接到新鮮培養(yǎng)基中，并逐步提高丁草胺濃度，至培養(yǎng)液中丁草胺濃度達(dá)到200 mg/L，如此馴化約1個(gè)月。于丁草胺LB培養(yǎng)基上劃線分離，選取長(zhǎng)勢(shì)好的菌落純化3次，得到純化的丁草胺降解細(xì)菌。將純化好的細(xì)菌回接至丁草胺基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中，取0 h、7 d樣各1 mL，10 000 r/min離心5 min后過(guò)0.45 μm的水相濾膜進(jìn)液相色譜檢測(cè)。

1.3 液相色譜檢測(cè)條件

色譜柱：Kromasil 100-5C18 柱（5 μm）4.6 mm×150 mm；檢測(cè)波長(zhǎng)：215 nm[7]；流動(dòng)相：乙腈∶水=75∶25；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL。

1.4 菌株P(guān)10的鑒定

菌株P(guān)10的形態(tài)以及生理生化鑒定參照東秀珠等的方法[8]。P10的16S rDNA序列測(cè)定：采用細(xì)菌的16S rDNA通用引物，以細(xì)菌的總DNA為模板，對(duì)菌株的16S rDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；PCR產(chǎn)物用GENEray膠回收試劑盒進(jìn)行回收，將回收產(chǎn)物克隆到pEASY-T1載體上，轉(zhuǎn)化Top10感受態(tài)細(xì)胞，以氨芐青霉素為篩選劑進(jìn)行篩選；挑取陽(yáng)性克隆斑，進(jìn)行PCR驗(yàn)證，同時(shí)用堿法提取質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序；用BLAST分析序列的同源性，采用MEGA 5.05軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

16S rDNA 通用引物為：上游，5′-AGAGTTTGA TCCTGGCTCAG-3′；下游，5′-GGTTACCTTCTTACG ACTT-3′。反應(yīng)體系（25 μL）為：10×EX-Taq buffer 2.5 μL，dNTP mix 2 μL，16S rDNA 上、下游引物各0.4 μL，EX-Taq 酶 0.2 μL，總 DNA 模板 1 μL，ddH2O 18.5 μL。 PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性 6 min，94℃變性 1 min，55℃退火 1 min，72℃延伸 3 min，擴(kuò)增32個(gè)循環(huán)，72℃后延伸10 min。

1.5 菌株P(guān)10修復(fù)藥害植株試驗(yàn)

處理1：半固體基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基滅菌后倒150 mL于250 mL燒杯中；處理2：半固體基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基滅菌稍放冷后，加入丁草胺儲(chǔ)備液，濃度為20 mg/L，倒150 mL于250 mL燒杯中；處理3：半固體基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基滅菌稍放冷后，加入丁草胺儲(chǔ)備液，濃度為20 mg/L，冷卻到50℃左右后加入10%經(jīng)基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基活化一周的P10培養(yǎng)液，倒150 mL于250 mL燒杯中。待凝固后播種經(jīng)清水浸種、催芽，且萌發(fā)一致的水稻種子，每盆20粒，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。于28℃，16 h光照、8 h黑暗培養(yǎng)10 d后觀察，記錄出苗個(gè)數(shù)、株高、株鮮重，50℃烘干至恒重后，稱取株干重。

2 結(jié)果與分析

2.1 丁草胺降解菌P10的篩選

富集、純化后，篩選出一株丁草胺高效降解細(xì)菌P10，P10在 30℃、150 r/min黑暗搖床培養(yǎng) 7 d，能降解培養(yǎng)液中89.6%的丁草胺，所測(cè)降解液相圖譜見(jiàn)圖1，液相圖譜峰面積和丁草胺的濃度成正比，A為0 h取樣的檢測(cè)圖譜，B為只加丁草胺的空白樣7 d后取樣的檢測(cè)圖譜，C為加有降解菌P10的處理樣7 d后取樣的檢測(cè)圖譜。

2.2 菌株鑒定

圖1 P10 7 d對(duì)丁草胺的降解液相圖譜（A：0 h；B：空白；C：P10）

P10在LB平板上30℃培養(yǎng)1 d后，菌落呈乳白色，圓形、隆起、不透明，圖2為菌體在電鏡下的形態(tài)。通過(guò)理化性質(zhì)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：菌株P(guān)10與接觸酶、葡萄糖、甲基紅、V-P[檢測(cè)某種細(xì)菌分解碳水化合物產(chǎn)生乙酰甲基甲醇CH3CH（OH）COCH3的反應(yīng)]、脲酶等反應(yīng)呈陽(yáng)性；與氧化酶、H2S產(chǎn)生、明膠液化、淀粉水解等呈陰性?？顾幮詸z測(cè)的結(jié)果表明：P10對(duì)硫酸卡那霉素（20 mg/L）、硫酸鏈霉素（20 mg/L）和硫酸新霉素（20 U/mL）敏感；而對(duì)氨芐青霉素（20 mg/L）和氯霉素（20 mg/L）不敏感。菌株P(guān)10和相關(guān)菌株的16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果表明：菌株P(guān)10與 Klebsiella ornithinolytica（AJ251467.1）及Klebsiella sp.R-21934（AJ786796.1）的相似性均為99%，并且與它們共同組成一個(gè)分支，再結(jié)合P10的理化特征將其鑒定為克雷白氏桿菌屬（klebsiella sp.）（圖 3）。

圖2 P10的電鏡照片

圖3 P10菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.3 菌株P(guān)10修復(fù)藥害植株試驗(yàn)結(jié)果

從室內(nèi)藥害植株修復(fù)試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，施加降解菌P10后對(duì)水稻的出苗率、株高及株重均有明顯影響（見(jiàn)表1），當(dāng)盆栽中丁草胺濃度為20 mg/L，接菌量為10%時(shí)，水稻的出苗率、株高、株鮮重和株干重分別比空白組處理1低44%、60%、49%和55%；但是比含同樣濃度丁草胺、未接菌對(duì)照組處理2分別高129%、208%、178%和123%。降解菌株P(guān)10對(duì)丁草胺藥害水稻的出苗率和株鮮重均有極顯著的修復(fù)效果，對(duì)株高和株干重有顯著的修復(fù)效果。這說(shuō)明在室內(nèi)條件下，降解菌能夠促進(jìn)殘留丁草胺的降解，減輕其對(duì)水稻的藥害。

表1 菌株P(guān)10施用后對(duì)水稻生長(zhǎng)指標(biāo)的影響

3 討論

因?yàn)槎〔莅烽L(zhǎng)期大面積的使用，給環(huán)境帶來(lái)了很?chē)?yán)重的危害，所以解決丁草胺危害問(wèn)題迫在眉睫。利用高效降解菌消除除草劑殘留有運(yùn)行成本低、無(wú)二次污染等優(yōu)勢(shì)，發(fā)展前景非常好，故應(yīng)對(duì)利用微生物降解除草劑這一課題進(jìn)行更多、更深層次的研究。

該研究篩選出的降解細(xì)菌P10被鑒定屬于克雷白氏桿菌屬，和已報(bào)道的丁草胺降解菌為不同屬，擴(kuò)大了微生物治理的選擇范圍。有關(guān)該菌降解丁草胺的途經(jīng)將在后續(xù)工作中進(jìn)一步研究。

目前微生物修復(fù)丁草胺藥害植株的研究還未見(jiàn)報(bào)道，通過(guò)室內(nèi)盆栽發(fā)現(xiàn)所篩選的丁草胺高效降解菌株對(duì)丁草胺藥害水稻植株的出苗率、株高以及株鮮、干重都有很好的修復(fù)效果，這為將來(lái)室外田間丁草胺藥害的修復(fù)提供了很好的指導(dǎo)作用。

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