劉志鵬，黃敏興，林繼欽，楊李勝，王小鵬，高裕鋒，陳其釗*

（1.廣東省科學(xué)院生物與醫(yī)學(xué)工程研究所，廣東 廣州 510316；2.中國輕工業(yè)甘蔗制糖工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510316）

沙拉醬是一種西式調(diào)味沙司，在西方人的飲食生活中必不可少，主要應(yīng)用于沙拉、三明治等菜品中，在我國的消費(fèi)主要集中在大、中城市，消費(fèi)群體主要為年輕人，目前還有很大的市場空間[1-2]。傳統(tǒng)沙拉醬的主要原料是植物油、雞蛋、食醋，再加上調(diào)味料和香辛料等[3]。由于沙拉醬營養(yǎng)豐富、保質(zhì)期短，生產(chǎn)廠家為保證其能有較長保質(zhì)期，會加入防腐劑來抑制其中的微生物生長。其中，苯甲酸、山梨酸和脫氫乙酸是在沙拉醬中使用最廣泛的防腐劑，但過量的食用會影響人體對維生素和鈣的吸收，加重人體肝臟負(fù)擔(dān)，并引起毒癥反應(yīng)或貧血和免疫功能下降[4-7]。GB 2760—2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定了上述3種防腐在沙拉醬中的最大使用量分別為1.0 g/kg、1.0 g/kg、0.5 g/kg[8]。

現(xiàn)階段針對這3種防腐劑的檢測方法有高效液相色譜法（high-performance liquid chromatography，HPLC）[9-13]、氣相色譜法（gas chromatography，GC）[14-17]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）法[18-19]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）法[20-24]。目前，檢測食品中這3種防腐劑的的國標(biāo)方法為液相色譜法和氣相色譜法[25-26]。液相色譜法和氣相色譜法雖然前處理簡單，儀器維護(hù)成本低，但其靈敏度相對較低，定性能力一般，容易出現(xiàn)假陽性情況。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，這3種防腐劑若要實(shí)現(xiàn)同時(shí)測定，需要用不同的前處理方法和不同儀器設(shè)備，實(shí)驗(yàn)操作起來費(fèi)時(shí)費(fèi)力。氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜（gas chromatogratriple quadrupole tandem mass spectrometry，GC-MS/MS）具有高準(zhǔn)確性、高效性、基質(zhì)干擾小的特點(diǎn)，以及多反應(yīng)監(jiān)測模式檢測的高靈敏度、高選擇性和對色譜峰形改善等優(yōu)點(diǎn)，目前多用于高通量農(nóng)藥殘留的檢測[27]。國內(nèi)外對于使用氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法測定食品中多種防腐劑的研究鮮有報(bào)道。

本研究采用分散固相萃取（dispersive solid phase extraction，DSPE）結(jié)合氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜（GC-MS/MS）法同時(shí)測定沙拉醬中的3種防腐劑（山梨酸、脫氫乙酸、苯甲酸），對其前處理?xiàng)l件的提取方式、渦旋時(shí)間、萃取溶劑進(jìn)行優(yōu)化，以期建立一種前處理簡單，靈敏度高，抗干擾能力強(qiáng)，能夠快速、準(zhǔn)確地同時(shí)檢測沙拉醬中山梨酸、脫氫乙酸、苯甲酸的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

沙拉醬：市售；山梨酸、苯甲酸、脫氫乙酸（純度均＞99%）：廣東省計(jì)量科學(xué)研究院；乙酸乙酯、正己烷、乙醚、二氯甲烷）、石油醚（均為色譜純）：上海星可高純?nèi)軇┯邢薰?；七水合硫酸鋅（分析純）：西隴科學(xué)股份有限公司；無水硫酸鎂（分析純）：廣州化學(xué)試劑廠；C18（分析純）：博納艾杰爾科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TSQ9000三重四極桿氣質(zhì)聯(lián)用儀、Sorvall ST4 Plus高性能通用臺式離心機(jī)：美國賽默飛世爾科技有限公司；ME204E電子天平：德國梅特勒-托利多集團(tuán)；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；UPC-I-60L型超純水機(jī)：成都超純科技有限公司；MultiReax多位試管渦旋振蕩器：德國Heidolph公司；WS-150D型往復(fù)式搖床：德國Wiggens公司；HP-FFAP色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）：美國Agilent Technologies公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液的制備：分別準(zhǔn)確稱取0.025 0 g山梨酸、脫氫乙酸和苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用乙酸乙酯溶解并定容至25 mL的容量瓶中，得到質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液，置于4 ℃條件下儲存。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的制備：精密量取混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液100 μL，用乙酸乙酯定容至100 mL容量瓶中，得到質(zhì)量濃度為1 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。然后用乙酸乙酯進(jìn)行逐級稀釋，制得質(zhì)量濃度分別為0.001 mg/L、0.005 mg/L、0.010 mg/L、0.050 mg/L、0.100 mg/L、0.500 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3.2 樣品的前處理

準(zhǔn)確稱取樣品1 g（精確至0.000 1 g）置于50 mL離心管中，加入10 mL水、2.5 mL七水合硫酸鋅溶液和4 mL氫氧化鈉溶液，以轉(zhuǎn)速2 000 r/min渦旋10 min后加水定容至20 mL，于4 000 r/min離心5 min，準(zhǔn)確吸取10 mL上清液于50 mL離心管中，加入0.5 mL鹽酸溶液（1∶1）酸化后，加入5 mL乙酸乙酯渦旋2 min后，于4 000 r/min離心5 min，移取2 mL上清液于裝有分散固相萃取劑（C18和無水硫酸鎂各200 mg）的試管中渦旋1 min，取上清液過0.22 μm微孔濾膜，待測。

1.3.3 氣相色譜-質(zhì)譜條件

氣相色譜條件：HP-FFAP色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；升溫程序?yàn)槌跏紲囟?0 ℃，保持1 min，以20 ℃/min上升到230 ℃，保持5 min；載氣為高純氦氣（He）（純度≥99.999%）；碰撞氣為氬氣（Ar）（純度≥99.999%）；進(jìn)樣口溫度為250 ℃；色譜柱流量為1.2 mL/min；分流比為10∶1；進(jìn)樣量為1 μL。

質(zhì)譜條件：離子源為電子電離源（electron ionization，EI）；離子源溫度為300 ℃；傳輸線溫度為280 ℃；掃描方式為選擇反應(yīng)監(jiān)測（selected reaction monitoring，SRM）模式。3種防腐劑的保留時(shí)間、定性及定量監(jiān)測離子對和碰撞能量參數(shù)見表1。

表1 3種防腐劑的保留時(shí)間、定性及定量離子對和碰撞能量Table 1 Retention time,qualitative and quantitative ion pair and collision energy of the 3 preservatives

定性定量分析：采用保留時(shí)間結(jié)合離子對豐度比進(jìn)行定性分析。以目標(biāo)物（3種防腐劑）的質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，峰面積（y）為縱坐標(biāo)繪制防腐劑標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到其線性回歸方程進(jìn)行定量分析?；厥章视?jì)算公式如下：

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2019對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，采用Origin 9.0制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.1.1 提取方式的選擇

常規(guī)的提取方式有超聲、渦旋和振搖。用不含防腐劑的沙拉醬作為樣品，進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，3種提取方式均分別處理10 min，其中超聲處理的功率為1 500 W，渦旋振蕩器轉(zhuǎn)速設(shè)為2 000 r/min，往復(fù)式搖床振搖頻率為300 r/min，其余條件按照1.3.2前處理，考察3種提取方式（超聲、渦旋和振搖）對回收率的影響。提取方式對回收率的影響見圖1。由圖1可知，整體來看，采用渦旋提取方式，山梨酸、脫氫乙酸及苯甲酸的平均回收率較高，這3種防腐劑的平均回收率分別為89.6%、95.4%、104.2%。超聲與振搖的提取方式對提取效果的影響差別不大。因此，選擇渦旋提取方式。

圖1 提取方式對回收率的影響Fig.1 Effect of extraction method on recovery rates

2.1.2 渦旋時(shí)間的選擇

采用渦旋提取方式進(jìn)行提取，考察渦旋時(shí)間分別為2 min、5 min、10 min、15 min、20 min、30 min對樣品回收率的影響。渦旋時(shí)間對回收率的影響見圖2。由圖2可知，隨著渦旋時(shí)間在2～10 min內(nèi)的延長，3種防腐劑的平均回收率呈明顯增加趨勢；當(dāng)渦旋時(shí)間＞10 min后，平均回收率增加趨勢較為平緩。當(dāng)渦旋時(shí)間為10 min時(shí)，山梨酸、脫氫乙酸及苯甲酸的提取率分別為91.2%、98.3%、101.0%。因此，選擇渦旋時(shí)間10 min。

圖2 渦旋時(shí)間對回收率的影響Fig.2 Effect of vortex time on recovery rate

2.1.3 萃取溶劑的選擇

選擇正己烷、乙酸乙酯、石油醚、乙醚、二氯甲烷5種溶劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，在其他條件不變的前提下，考察用不同萃取溶劑對回收率的影響。萃取溶劑對平均回收率的影響見圖3。由圖3可知，當(dāng)選擇乙酸乙酯作為萃取溶劑時(shí)，3種防腐劑的平均回收率較高，提取效果最佳，山梨酸、脫氫乙酸、苯甲酸3種防腐劑的平均回收率分別為89.0%、96.2%、104.5%。因此，選擇乙酸乙酯作為萃取溶劑。

圖3 萃取溶劑對回收率的影響Fig.3 Effect of extraction agents on recovery rate

2.2 分散固相萃取劑的凈化效果

沙拉醬是一種高脂肪食物，每100 g傳統(tǒng)沙拉醬脂肪含量在50 g以上[2]。因此，在凈化步驟中著重針對脂肪進(jìn)行除雜，選擇C18與無水硫酸鎂各200 mg組合成分散固相萃取劑，對萃取溶液進(jìn)行凈化，考察其凈化效果。加入分散固相萃取劑前后的樣品總離子流色譜圖見圖4。由圖4可知，加入分散固相萃取劑后，樣品總離子流色譜圖的背景干擾明顯要小于未經(jīng)凈化的樣品，整體基線也更加平穩(wěn)。實(shí)驗(yàn)過程中也未發(fā)現(xiàn)分散固相萃取劑對3種防腐劑的回收率有影響（3種防腐劑回收率均在85%～105%范圍內(nèi)）。為了保護(hù)氣相系統(tǒng)的潔凈度和降低樣品背景的干擾，故選擇加入分散固相萃取劑作為凈化步驟。

圖4 加入分散固相萃取劑前（A）、后（B）的樣品總離子流色譜圖Fig.4 Total ion chromatogram of the samples of before (A) and after (B) adding dispersant

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 方法的線性回歸方程、檢出限與定量限

3種防腐劑的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限見表2。由表2可知，3種防腐劑在質(zhì)量濃度0.001～0.100mg/L范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2≥0.999。在稱樣量為1.00 g時(shí)進(jìn)行低濃度加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，以目標(biāo)峰高等于3倍基線噪音為檢出限，目標(biāo)峰等于10倍基線噪音為定量限進(jìn)行計(jì)算，方法的檢出限為0.002～0.010 mg/kg；方法的定量限為0.006～0.030 mg/kg。3種防腐劑的檢出限與定量限均遠(yuǎn)低于國標(biāo)方法，說明本方法具有一定優(yōu)越性。

表2 3種防腐劑的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 2 Linear regression equation,correlation coefficient,detection limit and quantification limit of 3 preservatives

2.3.2 加標(biāo)回收率和精密度試驗(yàn)

以不含防腐劑的沙拉醬作為空白樣品進(jìn)行加標(biāo)回收率試驗(yàn)，分別準(zhǔn)確加入0.05 mg/kg、0.10 mg/kg、0.50 mg/kg 3個水平濃度的3種防腐劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照方法1.3.2進(jìn)行前處理，每個添加水平做6次重復(fù)試驗(yàn)，計(jì)算其加標(biāo)回收率、精密度試驗(yàn)結(jié)果相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard de viation，RSD），結(jié)果見表3。由表3可知，空白沙拉醬中3種防腐劑不同加標(biāo)水平下的平均回收率和RSD范圍分別為88.6%～104.8%、2.0%～5.3%，符合GB/T 27404—2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測》要求。結(jié)果表明，本方法具有良好的準(zhǔn)確度和精密度，能滿足日常檢測的要求。

表3 3種防腐劑的加標(biāo)回收率及精密度試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of spiked recovery and precision tests of 3 preservatives

2.4 實(shí)際樣品檢測中該方法與國標(biāo)方法的比較

將該方法運(yùn)用到從市場隨機(jī)購買回來的38份樣品中進(jìn)行檢測。結(jié)合GB 2760—2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》判定，樣品的實(shí)際檢出情況為：山梨酸檢出率為63.1%；脫氫乙酸的檢出率為8.8%；苯甲酸檢出率為21.1%，沒有不合格樣品。選取3種防腐劑均為陽性的一份樣品，采用本方法與國標(biāo)方法進(jìn)行比較，試驗(yàn)結(jié)果見表4。由表4可知，采用本方法檢測的山梨酸、脫氫乙酸、苯甲酸的實(shí)測值分別為0.135 g/kg、0.127 g/kg、0.158 g/kg，采用國標(biāo)方法檢測的這3種防腐劑的實(shí)測值分別為0.129 g/kg、0.122 g/kg、0.147 g/kg，說明本方法與國標(biāo)方法的試驗(yàn)結(jié)果無明顯差異，采用本方法檢測的這3種防腐劑的RSD分別為3.4%、2.9%、3.7%，國標(biāo)方法檢測的這3種防腐劑的RSD分別為4.1%、2.8%、4.5%，該方法的RSD在一定程度上優(yōu)于國標(biāo)方法。該方法的檢測效率具有一定優(yōu)勢，僅需要一次簡單的前處理，一臺儀器，便能同時(shí)準(zhǔn)確地對3種防腐劑進(jìn)行定量。

表4 本方法與國標(biāo)方法檢測結(jié)果的比較（n=6）Table 4 Comparison of determination results of the method with national standard method (n=6)

3 結(jié)論

本研究采用分散固相萃取結(jié)合氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法對沙拉醬中的山梨酸、脫氫乙酸和苯甲酸進(jìn)行測定。針對沙拉醬是一種高脂肪食物，最佳前處理?xiàng)l件為加入10 mL水、2.5 mL硫酸鋅溶液和4 mL氫氧化鈉溶液渦旋處理10 min后加水定容至20 mL，于4 000 r/min離心5 min，準(zhǔn)確吸取10 mL上清液于50 mL離心管中，加入0.5 mL鹽酸溶液（1∶1）酸化，加入乙酸乙酯渦旋2 min后4 000 r/min離心5 min，移取2 mL上清液于裝有分散固相萃取劑（C18和無水硫酸鎂各200 mg）的試管中渦旋1 min，取上清液過0.22 μm微孔濾膜，待測。在此優(yōu)化前處理?xiàng)l件下，3種防腐劑在質(zhì)量濃度0.001～0.100 mg/L線性范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2均＞0.999，平均加標(biāo)回收率為88.6%～104.8%，精密度試驗(yàn)結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為2.0%～5.3%，方法檢出限為0.002～0.010 mg/kg，定量限為0.006～0.030 mg/kg。該方法對比國標(biāo)方法，靈敏度更高、定性準(zhǔn)確、所需儀器更單一、抗干擾能力更強(qiáng)，可以滿足沙拉醬中多種防腐劑的檢測需求。