針刺治療弱視的相關(guān)蛋白質(zhì)分子研究進(jìn)展

牛野，魏麗娟，王富春

弱視是在視覺(jué)發(fā)育敏感期由于斜視、屈光參差、形覺(jué)剝奪等原因?qū)е碌目臻g視覺(jué)不良綜合征[1]，斜視性弱視和屈光參差性弱視的動(dòng)眼神經(jīng)功能更差[2]，而形覺(jué)剝奪性弱視是視皮層功能障礙[3]，也是兒童單眼視力減退的主要原因，被認(rèn)為是最常見(jiàn)的一種成年后持續(xù)性單方面視力障礙的原因[4]，嚴(yán)重影響兒童視覺(jué)的健康發(fā)展。蛋白質(zhì)磷酸化是生物體內(nèi)最重要的一種蛋白質(zhì)翻譯后修飾，應(yīng)用蛋白質(zhì)修飾開(kāi)展針刺治療弱視的效應(yīng)機(jī)制研究日益受到重視，本文分析針刺、弱視與相關(guān)蛋白質(zhì)磷酸化之間的關(guān)系，認(rèn)為針刺在蛋白質(zhì)組學(xué)方面的作用是未來(lái)研究弱視的重要突破口和發(fā)展方向，同時(shí)也為臨床針刺治療弱視提供思路。

1 弱視研究進(jìn)展及針刺治療優(yōu)勢(shì)

《弱視眼科臨床指南（2017 年）》[5]指出：“形覺(jué)剝奪性弱視是由于屈光間質(zhì)混濁、上瞼下垂等形覺(jué)剝奪性因素造成的弱視，可為單眼或雙眼，單眼形覺(jué)剝奪性弱視較雙眼弱視后果更為嚴(yán)重?！睋?jù)各國(guó)統(tǒng)計(jì)資料顯示，其發(fā)病率大約在1%～4%[6-7]，并且被認(rèn)為是成年后持續(xù)性單側(cè)視覺(jué)障礙的最常見(jiàn)原因之一[4]。

弱視是一種視覺(jué)皮層障礙，其中視皮層的可塑性與神經(jīng)元的突觸有著密切的聯(lián)系[7-8]，相關(guān)因子通過(guò)對(duì)神經(jīng)元突觸的干預(yù)從而完成視覺(jué)系統(tǒng)可塑性的調(diào)控。相關(guān)因子包括神經(jīng)遞質(zhì)[9-10]、眼優(yōu)勢(shì)柱調(diào)節(jié)激酶[11]、細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）等。目前國(guó)際治療弱視的方法主要為“壓抑療法”和“遮蓋療法”[12]，針灸是中醫(yī)學(xué)的一部分，作為弱視的潛在治療方法備受關(guān)注。相關(guān)研究[13]已經(jīng)證明，針灸能通過(guò)刺激視覺(jué)相關(guān)穴位來(lái)改善血流和誘導(dǎo)視皮層功能，針刺干預(yù)可以調(diào)節(jié)視中樞的神經(jīng)遞質(zhì)[14]，神經(jīng)元的核膜、線粒體、突觸形態(tài)結(jié)構(gòu)逐漸恢復(fù)，同時(shí)可以改變腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brian derived neurotrophic factor，BDNF）[15-16]，從而達(dá)到改善視皮層可塑性的目的。本研究通過(guò)搜索近年來(lái)針刺治療弱視效果的相關(guān)文獻(xiàn)，分析得出針刺在治療弱視方面具有良好的效果[17]，基因方面以N-甲基-D-天門(mén)冬氨酸受體（N-methyl-D-aspartate receptor，NMDAR）信使核糖核酸（messenger ribonucleic acid，mRNA）、即刻早期基因（immediate early genes，IEGs）c-fos 表達(dá)為主，蛋白方面以神經(jīng)生長(zhǎng)蛋白-43（growth associated protein-43，GAP43） 為主，蛋白酶方面以神經(jīng)元型一氧化氮合酶（neuronal nitric oxide synthase，nNOS）為主的針灸干預(yù)效果顯著[18-20]。

2 弱視與磷酸化翻譯后修飾蛋白質(zhì)組學(xué)

近年來(lái)，隨著蛋白質(zhì)組學(xué)的出現(xiàn)及其分析技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，使研究者開(kāi)展弱視相關(guān)蛋白質(zhì)組學(xué)的研究成為了現(xiàn)實(shí)，神經(jīng)活性被證明可以誘導(dǎo)組蛋白的翻譯后修飾[21-22]，RUIZ-PERERA L 等[23]通過(guò)對(duì)單眼剝奪弱視小鼠模型進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)分析，識(shí)別出弱視中24 個(gè)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，主要為肌動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白2、抑制蛋白2、鈣調(diào)素、翻譯控制的腫瘤蛋白（translationally-controlled tumor protein，TCTP）、蛋白酶體亞基α2 型等，以此為治療的突破口進(jìn)行機(jī)制研究。CHWANGW和WOODMA 等[24-25]研究發(fā)現(xiàn)體外激活細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶/絲裂原活化蛋白激酶 （extracellular signal regulated kinases/mitogen-activated protein kinases，ERK/MAPK）顯著增加海馬CA1 區(qū)組蛋白H3 磷酸化，組蛋白H3 的Ser10和Lys9 的組合磷酸化與可塑性相關(guān)基因的活性基因轉(zhuǎn)錄相關(guān)，同時(shí)CROSIO C 等[26]發(fā)現(xiàn)重置晝夜節(jié)律刺激會(huì)導(dǎo)致視交叉上核H3 磷酸化，在不同的大腦結(jié)構(gòu)中發(fā)生改變，而神經(jīng)系統(tǒng)中染色質(zhì)重塑對(duì)組蛋白H3 的磷酸化起著至關(guān)重要的作用。SANANBENESI F 等[27-28]觀察到了經(jīng)驗(yàn)依賴(lài)性絲氨酸/蘇氨酸激酶磷酸化和細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶的磷酸化，其改變影響了神經(jīng)系統(tǒng)的可塑性。通過(guò)篩選形覺(jué)剝奪弱視的特異性標(biāo)志物，明確弱視治療靶點(diǎn)以及判斷其病情的發(fā)展情況，進(jìn)一步地深入了解了弱視的發(fā)病機(jī)制，為其診斷、治療和預(yù)后帶來(lái)新思路[29]。

2.1 弱視與nNOS 的磷酸化

視皮層神經(jīng)元的可塑性對(duì)于弱視的治愈至關(guān)重要[30-33]。神經(jīng)元相互作用和視皮層可塑性持續(xù)改變的關(guān)鍵是突觸發(fā)生了分子變化，一氧化氮（nitric oxide，NO）在突觸后神經(jīng)元中作為無(wú)機(jī)小分子是神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞間的信使分子，參與神經(jīng)系統(tǒng)的信息傳遞、神經(jīng)發(fā)育，促進(jìn)L-谷氨酸和γ-氨基丁酸（γaminobutyric acid，GABA）經(jīng)典神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，從而影響突觸的可塑性[34-40]，經(jīng)研究[41]發(fā)現(xiàn)突觸后NO 的產(chǎn)生不但影響突觸的可塑性，同時(shí)對(duì)神經(jīng)元的死亡也產(chǎn)生重要影響，而NMDAR 的信號(hào)傳導(dǎo)在突觸可塑性和細(xì)胞死亡機(jī)制中也起著重要作用，通過(guò)NMDAR 刺激神經(jīng)型nNOS 產(chǎn)生NO[42-45]，這個(gè)過(guò)程要激活nNOS 的活性。

RAMEAU GA 等[46-47]驗(yàn)證了谷氨酸刺激神經(jīng)元對(duì)nNOS磷酸化的影響，通過(guò)蛋白激酶B 快速誘導(dǎo)絲氨酸1412 的位點(diǎn)蛋白（S1412）和短暫的NMDAR 依賴(lài)性磷酸化，然后通過(guò)鈣調(diào)蛋白依賴(lài)性激酶II（calcium/calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ，CaMKII）誘導(dǎo)絲氨酸847的位點(diǎn)蛋 白（S847）持續(xù)磷酸化[48]，證明了蛋白激酶B 磷酸化S1412 蛋白是NMDAR激活nNOS 的必要條件。這些發(fā)現(xiàn)[49-51]表明NMDAR 誘導(dǎo)的一系列調(diào)控nNOS 磷酸化在nNOS 活體控制中起著關(guān)鍵作用。

α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸受體（α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isox-azolepropionic acid receptor，AMPAR）蛋白磷酸化在神經(jīng)元可塑性中同樣發(fā)揮重要作用[52]，AMPAR 是離子型谷氨酸受體中重要的亞型，AMPAR 由4 種亞單位組成，GluR1 至GluR4 或GluRA 至GluRD，AMPAR 的數(shù)量及對(duì)Ca2+的通透性最終影響突觸的強(qiáng)度，Ca2+通過(guò)NMDAR 流入，從而導(dǎo)致CaMKII 活化，CaMKII 對(duì)神經(jīng)元突觸的長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)（long-term potentiation，LTP）至關(guān)重要，通過(guò)各種蛋白質(zhì)磷酸化參與突觸傳遞。LTP 的誘導(dǎo)增加了CaMKII 對(duì)GluR1 的磷酸化，AMPAR 的磷酸化和調(diào)節(jié)在LTP 期間發(fā)生的突觸功效中起著重要作用[53]，AMPAR 磷酸化促進(jìn)NMDAR依賴(lài)性磷酸化，從而間接調(diào)控nNOS 磷酸化。

2.2 弱視與GAP43 的磷酸化

GAP43 是與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、再生、神經(jīng)突觸連接重建及可塑性密切相關(guān)的一種特異性磷酸蛋白。由于其在引導(dǎo)軸突生長(zhǎng)和調(diào)節(jié)軸突形成新的連接上起非常關(guān)鍵作用，因此被認(rèn)為是神經(jīng)元發(fā)育、軸突再生、突觸重建的可塑性分子標(biāo)志[54-55]。在突觸后的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中，蛋白激酶C （protein kinase C，PKC）磷酸化的花生四烯酸（arachidonic acid，AA）激活多種底物，包括GAP43[56]，已知其通過(guò)調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白動(dòng)力學(xué)促進(jìn)神經(jīng)元生長(zhǎng)[57-58]，在體外研究中，當(dāng)PKC 磷酸化時(shí)，GAP43 通過(guò)增加聚合來(lái)調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白絲的長(zhǎng)度，從而調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜枝干的發(fā)育。在細(xì)胞水平上，GAP43 在稱(chēng)為脂筏的特定區(qū)域控制肌動(dòng)蛋白，GAP43 及其磷酸化在視覺(jué)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和可塑性過(guò)程中起重要作用[59-60]。

2.3 弱視與c-fos 的蛋白表達(dá)

c-fos 是一種即刻早期基因，具有被刺激誘導(dǎo)快速短暫表達(dá)的特性，其產(chǎn)物蛋白的表達(dá)水平可以反映視皮質(zhì)神經(jīng)元突觸可塑性程度[61-62]，同時(shí)c-fos 也參與細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化。陳劍等[63]通過(guò)免疫組織化學(xué)法，觀察單眼斜視大鼠視覺(jué)發(fā)育敏感期內(nèi)視皮質(zhì)神經(jīng)元c-fos 蛋白的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)弱視大鼠通過(guò)光等外界條件刺激后，c-fos 蛋白的表達(dá)明顯增多，從而可知斜視導(dǎo)致的弱視大鼠視覺(jué)發(fā)育敏感期內(nèi)視皮質(zhì)仍然存在一定的可塑性。王今樂(lè)等[64]通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)檢測(cè)單眼剝奪弱視貓視皮質(zhì)神經(jīng)元c-fos 的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在單眼剝奪關(guān)鍵期的c-fos 表達(dá)明顯降低，通過(guò)相關(guān)研究證實(shí)c-fos的表達(dá)是神經(jīng)元突觸可塑性的重要標(biāo)志。

3 針刺與弱視的蛋白質(zhì)組學(xué)

隨著質(zhì)譜技術(shù)的不斷發(fā)展，越來(lái)越多的蛋白質(zhì)翻譯后修飾類(lèi)型被鑒定出來(lái)。蛋白質(zhì)翻譯后修飾在不同的生物過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[30]，如細(xì)胞調(diào)節(jié)分化和有機(jī)體發(fā)育等，且與弱視相關(guān)的蛋白質(zhì)能以不同方式進(jìn)行修飾，如乙酰化、甲基化和磷酸化，磷酸化常見(jiàn)的修飾是調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的功能和定位[31]。周丹[65]研究針刺對(duì)形覺(jué)剝奪弱視模型大鼠蛋白質(zhì)的影響，選出差異表達(dá)蛋白3 種，并認(rèn)為“開(kāi)導(dǎo)補(bǔ)益”針刺法治療形覺(jué)剝奪弱視優(yōu)于開(kāi)導(dǎo)組及補(bǔ)益組，機(jī)制可能與多種蛋白的表達(dá)變化有關(guān)。上述研究從蛋白質(zhì)組的整體變化揭示針灸防治弱視的分子基礎(chǔ)，對(duì)闡明針灸治療弱視的現(xiàn)代生物學(xué)機(jī)制具有較好的參考和指導(dǎo)意義[66]。

3.1 針刺與nNOS 的表達(dá)

nNOS 在神經(jīng)元突觸的可塑性方面起著重要作用[67]，已在臨床治療兒童視力損傷得到證實(shí)[68]。沈非兒等[69]使用電針刺激大鼠的百會(huì)穴和印堂穴，發(fā)現(xiàn)可以降低模型組大鼠海馬區(qū)nNOS 的表達(dá)，影響突觸的可塑性從而實(shí)現(xiàn)對(duì)抑郁的改善。胡英華[70]研究發(fā)現(xiàn)在視覺(jué)剝奪早期，針刺能夠促進(jìn)視皮質(zhì)和外側(cè)膝狀體nNOS 表達(dá)，其表達(dá)量的變化在不同程度上促進(jìn)了視覺(jué)系統(tǒng)的發(fā)育，從而改善整個(gè)視覺(jué)系統(tǒng)的功能。何峰等[71]發(fā)現(xiàn)老齡組大鼠海馬CA1 區(qū)的神經(jīng)元型nNOS 較幼年和成年組表達(dá)水平均降低，提示老齡期nNOS 表達(dá)下降可能是導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶能力下降的原因之一。程為平等[72]通過(guò)針刺百會(huì)穴和大椎穴發(fā)現(xiàn)其能抑制nNOS 的激活，從而減輕其對(duì)海馬神經(jīng)元的毒性作用，達(dá)到抑制神經(jīng)元凋亡的目的。以上可以看出nNOS 對(duì)神經(jīng)元突觸可塑性至關(guān)重要，而神經(jīng)元突觸可塑性不但影響視皮層功能進(jìn)而最終導(dǎo)致弱視，還會(huì)影響海馬區(qū)，造成抑郁和老年癡呆的發(fā)生，通過(guò)針刺干預(yù)nNOS 的表達(dá)，可以達(dá)到治療疾病的目的。

3.2 針刺與GAP43 的表達(dá)

GAP43 是神經(jīng)元發(fā)育和突觸可塑性的內(nèi)在因素，林棟[73]采用針刺干預(yù)缺氧缺血大鼠模型，發(fā)現(xiàn)損傷后在應(yīng)激情況下會(huì)出現(xiàn)GAP43 的高表達(dá)，通過(guò)針刺干預(yù)后會(huì)有效降低GAP43 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量。孫迎春和陳英輝等[74-75]通過(guò)電針刺激脊髓損傷大鼠，發(fā)現(xiàn)GAP43 是神經(jīng)元生長(zhǎng)期的內(nèi)在決定因子，標(biāo)志著神經(jīng)的再生，突觸的形成。梁佳[76]通過(guò)電針治療慢性應(yīng)激抑郁大鼠，發(fā)現(xiàn)電針可以上調(diào)海馬組織GAP43 的表達(dá)水平，從而促進(jìn)海馬神經(jīng)元再生、減少海馬神經(jīng)元凋亡。綜上所述，GAP43 在神經(jīng)元發(fā)育和突觸可塑性的重塑過(guò)程中發(fā)揮重要作用，無(wú)論是腦癱、抑郁還是弱視等疾病中GAP43 表達(dá)的改變對(duì)疾病均起著一定的作用，而通過(guò)針刺干預(yù)，可以調(diào)節(jié)相應(yīng)動(dòng)物模型GAP43 的表達(dá)，從而提高神經(jīng)元的發(fā)育和突觸重塑性。

3.3 針刺與c-fos 的表達(dá)

c-fos 作為一種即刻早期基因，是神經(jīng)元突觸可塑性的重要標(biāo)志。研究[77]發(fā)現(xiàn)，對(duì)腦缺血再灌流大鼠進(jìn)行電針干預(yù)治療后，其病灶側(cè)額葉、頂葉皮層和海馬區(qū)的c-fos 表達(dá)明顯增多，減少了神經(jīng)元的變性壞死，改善了神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙。相似的是，覃波等[78]應(yīng)用電針干預(yù)腦梗死模型大鼠，發(fā)現(xiàn)其患側(cè)海馬區(qū)c-fos 表達(dá)和神經(jīng)元數(shù)量明顯增多，提示通過(guò)電針刺激可以增加c-fos 的表達(dá)，修復(fù)神經(jīng)元數(shù)量，達(dá)到改善機(jī)體神經(jīng)系統(tǒng)功能的目的。

4 小結(jié)

弱視的治療在蛋白質(zhì)修飾過(guò)程中是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，視皮層中主要因子nNOS、GAP43 和c-fos 均對(duì)神經(jīng)元的突觸可塑性有著重要作用。通過(guò)整理近幾年的相關(guān)文獻(xiàn)可以發(fā)現(xiàn)，通過(guò)針灸干預(yù)后的nNOS、GAP43 和c-fos 表達(dá)均有不同程度的改變，同時(shí)對(duì)神經(jīng)元的突觸可塑性也產(chǎn)生的一定的修復(fù)作用。但是目前尚不明確針灸治療弱視的機(jī)制和分子通路，因此需要進(jìn)一步研究針灸干預(yù)后相關(guān)表達(dá)蛋白變化和其磷酸化修飾的改變，為針灸干預(yù)預(yù)防弱視及定向治療弱視提供理論支持。