試驗(yàn)動(dòng)物結(jié)腸小袋纖毛蟲檢測(cè)方法與防控技術(shù)研究

賀會(huì)利，謝永平*，龐彬輝，曾 飛

1.廣西獸醫(yī)研究所，南寧 530001；2.廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530001；3.廣西桂東公司，廣西 梧州 543100

靈長(zhǎng)類試驗(yàn)動(dòng)物是生命科學(xué)研究中的“活的試劑”，是人類健康與安全的“活的屏障”，是應(yīng)用于人體之前的“最后一道防線”。靈長(zhǎng)類試驗(yàn)動(dòng)物包括食蟹猴、獼猴等，經(jīng)過長(zhǎng)期試驗(yàn)對(duì)比后發(fā)現(xiàn)，食蟹猴的大腦結(jié)構(gòu)、生理功能、免疫系統(tǒng)以及基因與人類相似，且繁殖較快，體型較小，因此成為基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和應(yīng)用生物醫(yī)學(xué)研究中使用最廣泛的靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型[1]。中國(guó)養(yǎng)殖的試驗(yàn)猴以食蟹猴為主，約占產(chǎn)業(yè)總量的80%～85%，廣西地理氣候條件最適宜人工繁殖食蟹猴，是全國(guó)最大的食蟹猴養(yǎng)殖地區(qū)。2020 年突如其來的新冠肺炎疫情讓全球都面臨缺少食蟹猴做疫苗動(dòng)物試驗(yàn)的嚴(yán)峻問題，同時(shí)一些國(guó)家限制了食蟹猴的出口，導(dǎo)致試驗(yàn)動(dòng)物的數(shù)量不斷減少，這些因素加速了廣西食蟹猴養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展[2]。隨著試驗(yàn)猴集約化養(yǎng)殖程度的提高，各類危害試驗(yàn)猴的疾病也不斷增加，寄生蟲（如結(jié)腸小袋纖毛蟲）引起的食蟹猴疾病問題尤為突出[3-6]。

1 檢測(cè)方法

1.1 直接涂片法

在載玻片上滴加1 滴生理鹽水，用竹簽挑取少許新鮮糞便在生理鹽水中涂抹均勻，加蓋玻片后置光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.2 水洗沉淀集卵法

取被檢糞便10～15 g，加水20～30 mL 攪拌成混懸液，用孔徑0.25 mm 的銅篩過濾到100 mL 的三角燒杯中，置于10 mL 離心管，3 000 r/min 離心5 min，棄上清，留下沉淀物。向沉淀物加入蒸餾水充分?jǐn)嚢杌靹?，靜置30 min，倒去上清液，沉渣再加入蒸餾水，調(diào)勻，靜置30 min。重復(fù)3～4 次，直至上層液變清。最后倒去上清液，取沉渣涂片鏡檢。

1.3 盧氏碘液染色法

用吸管吸取量杯底部沉淀物1 滴，加盧氏碘液工作液1 滴，攪勻，蓋上蓋玻片后，在10×和40×光學(xué)顯微鏡下測(cè)量觀察。

1.4 分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)

運(yùn)用賀會(huì)利等[7]建立的PCR 技術(shù)，以及根據(jù)GenBank 中已經(jīng)發(fā)表的結(jié)腸小袋纖毛蟲18S rRNA序列，利用在線軟件http://primerexplorer.jp/e/設(shè)計(jì)引物建立LAMP 檢測(cè)技術(shù)（表1）。按照糞便基因組DNA 提取試劑盒說明進(jìn)行樣品DNA 提取，以此DNA 為模板，應(yīng)用上述LAMP 引物進(jìn)行擴(kuò)增，其體系（25 μL）如下：2×反應(yīng)緩沖液12.5 μL，Bst DNA聚合酶1 μL，引物各1 μL，DNA 模板2 μL，ddH2O5.5 μL，總反應(yīng)體系25 μL。瞬時(shí)離心混勻，用loopamp R實(shí)時(shí)濁度儀LA-320c 在63 ℃條件下對(duì)樣品進(jìn)行擴(kuò)增。

表1 LAMP 引物信息

2 防控措施

2.1 日常飼養(yǎng)管理

由于部分腸道寄生蟲直接利用水、土壤及食物進(jìn)行傳播，因此對(duì)于圈養(yǎng)的試驗(yàn)猴，防治結(jié)腸小袋纖毛蟲病最根本的措施就是對(duì)其生活環(huán)境進(jìn)行定期寄生蟲殺滅，對(duì)養(yǎng)殖場(chǎng)的水源、飼料等進(jìn)行嚴(yán)格的管理，最大限度地確?？梢詳z取到干凈的水源、青料等；飼養(yǎng)人員可以按照一定的比例在飼料中添加多種維生素，或者也可以在飲水中添加口服補(bǔ)液鹽，提升試驗(yàn)動(dòng)物的抵抗力。飼養(yǎng)人員要每天及時(shí)清除動(dòng)物糞便，并進(jìn)行無害化處理，保持動(dòng)物欄舍衛(wèi)生。同時(shí)提高對(duì)結(jié)腸小袋纖毛蟲病危害的認(rèn)識(shí)，增強(qiáng)公共衛(wèi)生意識(shí)，定期對(duì)養(yǎng)殖場(chǎng)工作人員進(jìn)行體檢，保障飼養(yǎng)人員、獸醫(yī)工作者及相關(guān)密切接觸人群的身體健康，避免人猴相互傳播。嚴(yán)禁在養(yǎng)殖場(chǎng)飼養(yǎng)貓和犬等其他動(dòng)物，以免相互傳播疾病。根據(jù)結(jié)腸小袋纖毛蟲病發(fā)病季節(jié)及流行特點(diǎn)，制訂科學(xué)合理的防治措施。每年春、秋兩季進(jìn)行全場(chǎng)檢測(cè)，并進(jìn)行預(yù)防性驅(qū)蟲。引種時(shí)必須對(duì)試驗(yàn)猴進(jìn)行逐只檢測(cè)各類寄生蟲及其他傳染病，并作隔離檢驗(yàn)，防止病原傳入。經(jīng)隔離檢驗(yàn)確認(rèn)健康后方可合群，避免結(jié)腸小袋纖毛蟲病的再次發(fā)生。加強(qiáng)疫情監(jiān)測(cè)，做到早發(fā)現(xiàn)、早隔離、早治療。

2.2 藥物治療

對(duì)于確診的試驗(yàn)動(dòng)物首先進(jìn)行隔離治療，選擇敏感藥物進(jìn)行治療。

1）隔離治療：根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，將發(fā)病嚴(yán)重的猴和檢測(cè)陽性的猴只進(jìn)行隔離治療，以便單獨(dú)護(hù)理，灌服甲硝唑、阿苯達(dá)唑片或自行研發(fā)的中藥驅(qū)蟲藥劑等敏感藥物；對(duì)腹瀉嚴(yán)重的猴只同時(shí)喂給電解質(zhì)多維，以便調(diào)節(jié)猴體電解質(zhì)平衡，防止因腹瀉脫水導(dǎo)致酸中毒。藥物治療5～7 d，病情好轉(zhuǎn)后停藥5 d，取樣檢測(cè)陰性后繼續(xù)觀察，定期檢測(cè)，治愈后反復(fù)3 次檢測(cè)均為陰性，健康后方可合群。

2）群體治療：應(yīng)用甲硝唑、阿苯達(dá)唑片或中藥驅(qū)蟲藥按比例與飼料混合飼喂全群猴，連用5 d，停藥5 d 后，取樣檢測(cè)陰性后繼續(xù)觀察，定期檢測(cè)。

3 討 論

3.1 結(jié)腸小袋纖毛蟲的特征及流行概況

長(zhǎng)期以來，人們對(duì)靈長(zhǎng)類試驗(yàn)動(dòng)物具有致病性的細(xì)菌和病毒研究較為重視，但對(duì)具有高度傳染性及致病性的腸道寄生蟲研究報(bào)道較少[8]。由寄生蟲感染引起的寄生蟲病一直是全球，特別是發(fā)展中國(guó)家普遍存在的公共衛(wèi)生問題，不僅阻礙經(jīng)濟(jì)發(fā)展，而且對(duì)人類的健康也造成了嚴(yán)重危害，目前尚無有效的寄生蟲病疫苗[9]。研究試驗(yàn)猴的發(fā)病情況表明，寄生蟲引起的消化系統(tǒng)疾病所占比例最大，結(jié)腸小袋纖毛蟲的感染率極高[10]。結(jié)腸小袋纖毛蟲(Balantidium coli，B.coli) 的整個(gè)發(fā)育的過程會(huì)有滋養(yǎng)體和包囊2 種階段。滋養(yǎng)體主要以橫二分裂法增殖，滋養(yǎng)體形態(tài)呈橢圓形或梨形，無色透明或淡灰略帶綠色，具有細(xì)胞口，全身披有短而整齊的纖毛，可借纖毛的擺動(dòng)迅速旋轉(zhuǎn)前進(jìn)，活蟲體極易變形，在不利的環(huán)境中形成包囊，包囊不易受環(huán)境壓力影響，可以在10%的福爾馬林中存活10 h 以上[11]，具有很強(qiáng)的感染能力，是病原體的傳播階段。目前已知的可感染包括人在內(nèi)的33 種動(dòng)物，如豬、猩猩、猴、馬、羊等均可感染，主要通過吞食被包囊污染的水護(hù)著食物導(dǎo)致感染，豬是主要的傳染源[12]。我國(guó)已有20 多個(gè)省市出現(xiàn)結(jié)腸小袋纖毛蟲感染，感染和分布有擴(kuò)大的趨勢(shì)。有研究發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)猴結(jié)腸小袋纖毛蟲的感染率為26.1%[13]。開放式的飼養(yǎng)條件下，試驗(yàn)動(dòng)物胃腸道的寄生蟲感染率更高。該種疾病主要危害幼猴，當(dāng)飼養(yǎng)密度加大時(shí)，猴群感染各類寄生蟲疾病的幾率極大地增加，同時(shí)由于寄生蟲具有一定的隱蔽性，當(dāng)猴群身體抵抗能力較強(qiáng)時(shí)，發(fā)病癥狀不是很明顯，在進(jìn)行臨床診治中易出現(xiàn)誤診，錯(cuò)過最佳的防控時(shí)機(jī)，因此給動(dòng)物帶來的危害必須重視。

3.2 結(jié)腸小袋纖毛蟲檢測(cè)技術(shù)

準(zhǔn)確而快速的診斷是防治寄生蟲病的重要環(huán)節(jié)，可以最大程度降低危害。傳統(tǒng)寄生蟲檢測(cè)包括形態(tài)學(xué)檢測(cè)、免疫學(xué)檢查等。形態(tài)學(xué)方法是寄生蟲病診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，采用顯微鏡或染色觀察寄生蟲蟲體或蟲卵等特有的形態(tài)及結(jié)構(gòu)，診斷出感染的寄生蟲種類，此方法對(duì)操作人員專業(yè)水平要求較高，常受雜質(zhì)影響較大，檢出率較低，對(duì)于大批量的樣品檢測(cè)，需要大量的人力物力，同時(shí)對(duì)操作人員身體健康影響較大，不適合寄生蟲病在現(xiàn)場(chǎng)上的快速診斷。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）和間接血凝試驗(yàn)（IHA）等免疫學(xué)檢測(cè)方法，具有易出現(xiàn)假陰性和假陽性的結(jié)果、不能區(qū)分是現(xiàn)癥感染還是既往感染、特異性和敏感性較差、不利于寄生蟲病的準(zhǔn)確檢測(cè)、成本費(fèi)用較高等缺點(diǎn)[14]。隨著分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)的不斷發(fā)展，以病原體特異性核酸片段為檢測(cè)對(duì)象的方法更加簡(jiǎn)便精確，在寄生蟲病的診斷方面有廣闊的應(yīng)用前景[15]。聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便、高效快捷等優(yōu)點(diǎn)[16]，可做到實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，快速檢測(cè)結(jié)腸小袋纖毛蟲。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技術(shù)具有操作簡(jiǎn)單、快速高效、高特異性、高靈敏度、低成本等優(yōu)點(diǎn)，已被應(yīng)用于血吸蟲、弓形蟲、球蟲[17-19]等寄生蟲的研究中，LAMP 技術(shù)是目前比較先進(jìn)的檢測(cè)方法，目前已應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室研究和快速臨床診斷。隨著科技的不斷發(fā)展，出現(xiàn)了許多新的檢測(cè)術(shù)，如：重組酶等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)包括重組酶聚合酶擴(kuò)增（recombinase polymerase amplification，RPA）技術(shù)以及重組酶介導(dǎo)擴(kuò)增(recombinase aided amplification，RAA)，在寄生蟲檢測(cè)方面得到了廣泛的開發(fā)與應(yīng)用，目前已經(jīng)應(yīng)用于原蟲、吸蟲、線蟲和其他原生動(dòng)物等寄生蟲檢測(cè)，RPA 技術(shù)比RAA 技術(shù)應(yīng)用更廣泛[20]。重組酶等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)填補(bǔ)了傳統(tǒng)培養(yǎng)和依賴溫變?cè)O(shè)備技術(shù)外的空缺，具有很大的應(yīng)用前景，但是由于靈敏度較高，容易造成假陽性結(jié)果，反應(yīng)過程中也容易產(chǎn)生非特異性條帶，引物容易形成二聚體，目前仍處于摸索階段[21]。宏基因組測(cè)序也在寄生蟲病診斷中得到應(yīng)用，該檢測(cè)方法具有無偏倚性、覆蓋度高，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，可靠，逐漸應(yīng)用于寄生蟲感染的檢測(cè)。但其應(yīng)用還存在一定的局限性和不足，如敏感性不足、基因組數(shù)據(jù)庫并不完善、成本較高、容易受外源DNA 干擾等[22]。綜上所述，目前應(yīng)用最廣泛，相對(duì)較成熟的是PCR 和LAMP 技術(shù)。

在寄生蟲的防控方面，首先應(yīng)從日常管理下手，加強(qiáng)養(yǎng)殖場(chǎng)所的消毒與糞便清理工作，控制適宜的溫度、濕度、光照及通風(fēng)，提供干凈的水和食物。其次針對(duì)本地區(qū)實(shí)際制訂出一套科學(xué)、合理的疾病綜合防制措施。最后是定期檢測(cè)，選擇有針對(duì)性的驅(qū)蟲藥物做好驅(qū)蟲工作，提高試驗(yàn)猴的數(shù)量、質(zhì)量及保證動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，防止疫情疫病的傳播，保障從業(yè)人員人身安全，促進(jìn)靈長(zhǎng)類試驗(yàn)動(dòng)物食蟹猴生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展。