添加補骨脂提取物的低敏處方糧對犬皮膚健康的影響

肖曉杰，丁明星，齊智利，胡曼麗，張 鑫*

1.贛南創(chuàng)新與轉化醫(yī)學研究院/ 心腦血管疾病防治教育部重點實驗室/ 贛南醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院/ 贛南醫(yī)學院，贛州 341000；2.華中農業(yè)大學動物醫(yī)學院，武漢 430070；3.華中農業(yè)大學動物科技學院，武漢 430070

作為人體最大的器官，皮膚是隔離宿主體內與外環(huán)境的第一道屏障，同時擁有豐富的免疫細胞網絡，對于維持機體內環(huán)境穩(wěn)態(tài)至關重要[1]。然而，皮膚問題已經給全球健康帶來了巨大負擔，皮膚病是造成非致命性損傷的重要原因之一[2]。作為人類伴侶的寵物，皮膚疾病也是頭號健康問題，其中寵物瘙癢及皮炎最常見。特應性皮炎（atopic dermatitis，AD）是一種由多因素誘導的慢性復發(fā)性和炎癥性皮膚病，臨床表現(xiàn)以瘙癢為主，研究發(fā)現(xiàn)寵物AD 的臨床、免疫學、組織學和病理學特征與人類相似[3]。隨著我國寵物數(shù)量井噴式增長，AD 在寵物犬中的發(fā)病趨勢不斷增加，寵主在寵物皮炎及瘙癢等疾病防治方面承受較大的經濟壓力，開發(fā)有效的寵物皮膚修復藥物和功能性食品具有重要的寵物臨床意義和社會意義[4]。本研究自主研發(fā)了一款含有天然植物成分的犬低敏處方糧，為探究其對犬皮炎的防治調理效果，采用2, 4-二硝基氯苯（dinitrochlorobenzene，DNCB）誘導建立犬AD 模型，探討低敏處方糧對犬AD 的功效。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

試驗動物為15 只健康比格犬，年齡為8～10 月齡，12 h 明暗交替飼養(yǎng)，自由飲水，溫度22～26 ℃適應性飼養(yǎng)1 個月。所有參加試驗的犬均應通過一般身體檢查和皮膚病學檢查，被判斷為健康且沒有接受任何可能影響結果的藥物治療。定期采集血液樣本進行評估，以確保犬的健康。所有的犬飼養(yǎng)在潔凈環(huán)境中，并且在致敏之前未出現(xiàn)過敏性皮炎的臨床癥狀。本試驗經贛南醫(yī)學院生物醫(yī)學研究倫理委員會審批通過，所有動物操作均符合贛南醫(yī)學院生物醫(yī)學倫理委員會的操作指南。

1.2 試 劑

補骨脂提取物（西安瑞林生物科技有限公司），DNCB（安耐吉化學），無水乙醇（國藥集團化學試劑有限公司），伊紅（BASO），蘇木素（谷歌生物）。對照組日糧為試驗犬全價配合糧，犬低敏處方糧由贛南創(chuàng)新與轉化醫(yī)學研究院和江西惠寵科技有限公司聯(lián)合研發(fā)。

1.3 儀 器

血液分析檢測儀（美國Abaxis），3110 全自動生化分析儀（日本，Hitachi），石蠟包埋機（德國Leica），脫水機（德國Leica），切片機（德國Leica），Micro 17R 高速離心機（美國Thermo）。

1.4 處方糧制備方法

低敏處方糧配方營養(yǎng)值確認流程：犬低敏處方糧的配方目標營養(yǎng)值設計參考國標《GB/T 31216-2014 全價寵物食品-犬糧》和美國飼料管理協(xié)會（AAFCO），針對寵物犬過敏機制和營養(yǎng)需求所制定；選擇低致敏性、高蛋白、低脂肪原料進行配方制作，嚴格控制原料種類，減少過敏原，并保證所有原料和添加劑符合《飼料原料目錄》《飼料添加劑目錄》規(guī)定。

試驗用犬低敏處方糧生產流程：使用粉碎機對大顆粒原料進行粉碎，過孔徑為0.25 mm 篩后按配方進行稱取，將物料加入混合機內攪拌均勻。調整膨化機的溫度、進料速度、轉刀速度，進行膨化制粒。將擠壓膨化后的顆粒物料放置于烘干機中，60～70 ℃的條件下干燥3～4 h，使其水分含量降至5%～10%。將干燥好的犬糧裝在真空包裝袋內，將真空時間調整為6 s，使用真空包裝機進行真空抽提包裝。

1.5 動物模型

15 只比格犬隨機分為3 組：對照組（n=5）、模型組（n=5）、補骨脂處方糧組（n=5）。所有犬每隔1 d在肩胛區(qū)皮膚中皮內接種 0.1 mL 0.1% DNCB，DNCB 用丙二酮溶解，共注射14 次。在完成最后1次注射2 周后，試驗犬在腹部區(qū)域的皮膚上接受貼斑試驗。犬腹部剃毛后，模型組及處方糧組犬進行5%的DNCB 乙醇貼片誘導皮炎模型，每只犬貼片8個，將貼片放置并固定于犬剃毛處，持續(xù)作用24 h，對照組貼8 片僅含無水乙醇的貼片。貼斑后，將處方糧組的犬糧更換為富含補骨脂的低敏處方糧，模型組和對照組繼續(xù)喂食普通日糧。對照組和模型組每天09:00、15:00 進行2 次飼喂，飼喂量如表1 所示，持續(xù)喂養(yǎng)4 周。試驗期間，記錄每日飲食量。

表1 犬每日飼喂量

1.6 評價指標

1）臨床檢查。在試驗前、貼斑前、試驗終點進行體重評價。貼斑試驗后每隔1 d 進行1 次臨床檢查，持續(xù)2 周。所有犬經過專業(yè)獸醫(yī)進行的嚴格臨床檢查，主要對皮膚炎性病變程度以及犬瘙癢程度進行評分[5]。每天1 次，對貼斑部位皮膚進行宏觀病變評分。四分制：0、1、2、3 分，所有觀察到的病變都被拍照并描述其位置、特征和嚴重程度。評分標準如下：0，無明顯反應；1 分，紅斑；2 分，紅斑、硬結或水腫（丘疹）；3 分，紅斑伴起泡或反應更嚴重。每天2 次，間隔6 h，觀察犬對瘙癢的行為表現(xiàn)，進行瘙癢程度評分，具體如下：0，沒有瘙癢；1～2 分，輕度瘙癢；3～4 分，中度瘙癢；5 分，持續(xù)而劇烈的瘙癢。

2）血液學分析。于0 周-24 h（貼斑試驗24 h后）和4 周（貼斑后4 周）采集血液進行血常規(guī)和血生化分析，血液樣本由惠康動物檢測（武漢）有限公司醫(yī)學檢驗實驗室檢測分析。

3）皮膚組織取材分析。0 周-24 h 和4 周取少量皮膚樣本，并對取材部位進行縫合。采集后立即將組織固定于10%福爾馬林中，用于后期H＆E 染色。

4）Q-PCR 試驗檢測炎癥因子表達。0 周-24 h和4 周取皮膚樣本，樣品液氮速凍后保存，用于RNA 提取及Q-PCR 檢測分析。設計犬的炎癥因子引物，分析處方糧組、模型組與對照組之間的基因表達差別，引物如下：白細胞介素6（IL-6），F(xiàn)：CTCCTGACCCAACCACAGAC R：TCCTGACCCAACCACAGAC R：GGAAATCCTCCAGACTCCGC；白細胞介素4 （IL-4），F(xiàn)：CCTCACAGCGAGAAACGACT，R：ATCTGCCGCAGTACAGTAGC；腫瘤壞死因子-α（Tnf-α）F：AAGAGCTCCCAAATGGCCTC，R：CTCAGCTTCGGGGTTTGCTA。

1.7 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計學方法

應用SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學比較，數(shù)據(jù)指標分析采用“平均值±標準差”表示，組間采用雙尾t檢驗或Wilcoxon 秩和檢驗進行統(tǒng)計分析，P＜0.05 認為具有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 低敏處方糧評價試驗流程

如圖1 所示，比格犬在接受0.1% DNCB 致敏后，模型組和處方糧組采用高濃度5% DNCB 進行貼斑誘導皮膚超敏反應，對照組只貼含對照溶劑的貼斑。貼斑后，對照組和模型組繼續(xù)喂食普通日糧，處方糧組更換飼料為補骨脂處方糧，直至試驗結束。

2.2 低敏處方糧成分含量

表2 為低敏處方糧各營養(yǎng)成分含量。

表2 低敏處方糧營養(yǎng)成分含量

2.3 低敏處方糧對犬皮炎模型的影響

1）低敏處方糧對皮炎模型犬體重的影響。在試驗前、貼斑前及終末時間點進行犬體重評價，結果發(fā)現(xiàn)對照組、模型組、處方糧組組間體重均一，且不同時間點動物體重穩(wěn)定，各組間無顯著差異（表3）。

表3 試驗動物體重 kg

2）低敏處方糧對犬皮炎模型血常規(guī)的影響。如表4，在試驗前后分析犬血常規(guī)，處方糧喂養(yǎng)對犬血液指標改變不顯著，也證實處方糧的安全性。

表4 0 周-24 h 與4 周各組血液學檢測結果

3）低敏處方糧對犬皮炎模型血生化的影響。由表5 可知，與對照組及模型組相比，處方糧組0 周和4 周時大部分血生化指標，特別是肝腎功能指標均未見明顯異常，結合整個試驗中的體重變化，說明低敏處方糧對犬的生理指標無顯著影響，進一步證實處方糧的安全性。

表5 0 周-24 h 和4 周各組血生化檢測結果

4）低敏處方糧對犬皮炎模型炎癥反應的影響。試驗犬在貼斑后24 h 開始出現(xiàn)皮膚紅腫、瘙癢等癥狀，且皮膚紅腫處在貼斑后7 d 出現(xiàn)皮膚皰疹、大量滲出物等嚴重皮炎現(xiàn)象，而后逐漸出現(xiàn)結痂的皮炎癥狀。同模型組相比，低敏處方糧組犬在連續(xù)喂食5～7 d 后皮炎表現(xiàn)減輕，具體評價指標為皮炎病變評分（圖2-a）以及皮膚瘙癢評分（圖2-b）明顯降低。

5）低敏處方糧對犬皮炎模型皮膚病理的影響。貼斑后24 h（0 周-24 h），與對照組相比，模型組與處方糧組皮膚出現(xiàn)病理結構改變，主要包括角質層不完整，顆粒層細胞排列不規(guī)則，真皮層炎性細胞浸潤，主要以淋巴細胞為主。貼斑后4 周，模型組犬皮膚角質層顯著增厚，表皮層增厚，炎性細胞浸潤較之前減輕，處方糧喂養(yǎng)4 周后真皮層增厚及炎癥細胞浸潤情況有所改善（圖3）。

6）低敏處方糧對犬皮炎模型炎癥基因表達的影響。如圖4 所示，與對照組比較，模型組犬皮膚組織中炎性因子的表達顯著升高，處方糧喂食4 周后IL-4、IL-6、TNFα等炎癥基因表達顯著下調，說明處方糧喂養(yǎng)能改善皮膚組織的炎癥反應，降低敏感性。

3 結 語

特應性皮炎（atopic dermatitis，AD）是一種由多因素誘導的慢性復發(fā)性和炎癥性皮膚病，臨床表現(xiàn)以瘙癢為主，AD 是人類和寵物皮膚病中最常見的疾病[6]。目前認為，犬AD 受遺傳和環(huán)境因素影響，是皮膚表皮屏障受損和對環(huán)境過敏原/抗原的異常免疫反應以及皮膚微生物組改變相互作用的結果[7]。犬AD 的進展與皮膚及循環(huán)淋巴細胞群的變化有關，在急性炎癥中，促炎因子能誘導Th2 細胞反應，在慢性反應時，可以觀察到CD4、CD8 細胞的改變而引起Th1/Th2 失衡[8]。當前，針對AD 往往采用包括皮膚屏障修復、抗炎、免疫治療在內的多模式治療，但相關治療方案仍缺少有力的科研論證[9]。已有證據(jù)表明，富含有必需氨基酸、益生菌、益生元、酶解蛋白成分等的膳食補充劑對犬AD 具有保護作用[10]。有證據(jù)表明，口服益生菌在AD 患者中能起到積極作用，揭示了腸道-皮膚軸的存在，為AD 的預防及治療提供思路[11]，提示飲食因素能夠改變腸道微生物群而增強皮膚健康[12]，為皮膚健康問題的保護、預防和治療提供了新思路。筆者所在課題組研發(fā)了一款低敏處方糧，原料上選擇低敏且經過水解的蛋白，降低食物過敏發(fā)生率；其次，營養(yǎng)組成上采用易消化蛋白、適宜脂肪、低纖維、高能量濃度，減少犬貓采食量，減輕腸道負擔；同時，添加不飽和脂肪酸，強化皮膚屏障，支持敏感犬貓的皮膚健康。在試驗過程中，模型組和處方糧組每只試驗犬的飼喂量都經過計算，保證滿足每只犬的每日靜止能量需求，在完全采食的情況下，模型組試驗犬體重稍有降低，可能是炎癥反應影響了腸胃功能。而處方糧組的犬體重未有下降，可能原因是試驗糧選用了易消化的水解蛋白，通過調整高能量密度降低了采食量和腸道負擔，并在此基礎上添加不飽和脂肪酸和B 族維生素強化了腸道屏障，因此，能在同樣滿足能量需求的情況下保持體重。

補骨脂（Psoralea corylifoliaLinn.）是豆科植物補骨脂的成熟果實，是中醫(yī)常用的藥材，具有抗炎、抗菌、抗腫瘤、抗風濕等活性，臨床上常用來治療白癜風、牛皮癬等皮膚疾病[13-14]。補骨脂中主要含有香豆素、單萜酚、黃酮、苯并呋喃類等活性成分，其中補骨脂素（psoralen）屬于其中的呋喃香豆素類化合物，能夠調節(jié)Th1/Th2 淋巴細胞平衡，促進TNF-α、IL-6、IL-1β 釋放，發(fā)揮顯著的抗炎和免疫調節(jié)作用[15]。補骨脂作為常用的飼料植物類添加物，廣泛用于獸用功能性飼料的開發(fā)[16]。本研究采用AD 犬模型，證實了含補骨脂低敏處方糧在長期喂食過程中對犬AD 的炎癥癥狀具有明顯的改善作用，提示基于營養(yǎng)學、抗炎、抗免疫等的食品開發(fā)具有較好的前景。