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    葉酸-磁雙靶向多功能納米分子探針用于視網膜母細胞瘤體外多模態(tài)成像的研究

    2022-12-09 08:35:18鄭文笛鄒宏密武明星
    國際眼科雜志 2022年12期
    關鍵詞:光聲葉酸探針

    李 醒,鄭文笛,鄒宏密,武明星

    0引言

    視網膜母細胞瘤[1-2](retinoblastoma,RB)是嬰幼兒常見的眼內惡性腫瘤,其中多數患者(85%)來自于低收入和中等收入國家。在這些地區(qū),患者最常見的臨床表現包括白瞳癥、斜視和眼球突出,發(fā)現時已有近半數患者有眼外腫瘤,甚至發(fā)生遠處轉移[3],發(fā)展到晚期患者不得不面臨眼球摘除的風險,這為患者及其家庭的心理健康和生活質量帶來了嚴重負擔[4-5]。因此,早期診斷和治療是控制RB的關鍵。分子影像技術的發(fā)展為早期診斷RB提供了新的方向,為了更好地滿足醫(yī)學多樣化和個性化需求,靶向多模態(tài)顯像的分子探針成為了研究熱點[6-7]。

    以Fe3O4為核心的超順磁性氧化鐵納米粒子(SPION),能夠在外加磁場下向靶組織聚集[8],結合配體修飾型主動靶向探針,有望進一步提升探針的靶向性能[9]。研究發(fā)現,SPION能夠吸收近紅外光進行光成像,并且能夠作為磁共振成像(MRI)的陰性對比劑使用[10-11]。將SPION與液態(tài)氟碳(perfluorohexane,PFH)共同組裝成相變型納米分子探針,在激光作用下會發(fā)生液氣相變,從而增強超聲顯像[12]。葉酸是一種水溶性維生素,將其修飾納米粒上,可以和RB細胞上的受體通過受體-配體介導作用特異性結合。阿霉素[13](adriamycin,ADM)作為廣譜化療藥物,通過藥物遞送系統,在光觸發(fā)下治療眼內疾病很有潛力。本研究擬制備一種新型的、高靶向性的納米級多模態(tài)造影劑,以葉酸(folic acid,FA)、Fe3O4為雙重靶向,載PFH、ADM的相變型多功能脂質體納米粒(FA-PFH-Fe3O4@ADM),研究其靶向視網膜母細胞瘤Y79細胞及體外超聲/光聲/MRI三模態(tài)成像能力,通過分子影像技術,為早期、高效、精準診斷RB提供新的思路。

    1材料和方法

    1.1材料

    1.1.1主要材料二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC,瑞禧生物、LP-R4-057),葉酸修飾磷脂酰乙醇胺(DSPE-PEG2000-FA,瑞禧生物、R-0043),膽固醇(瑞禧生物、117298),全氟己烷(PFH,STREM、09-6072),葉酸(Sigma、R010338),鹽酸阿霉素(ADM,阿拉丁、D107159),超順磁性氧化鐵(SPION,瑞禧生物、R-C1002),三氯甲烷(上海生化),DAPI染色液(碧云天、AR1176),CCK-8試劑盒(同仁化學、CK04),人視網膜母細胞瘤細胞(Y79,上海斯信生物科技有限公司),RPMI1640培養(yǎng)基(Gibco、C11875500BT)。

    1.1.2主要儀器旋轉蒸發(fā)儀(亞榮),超聲波聲振儀(Sonics),低溫離心機(Eppendorf),馬爾文粒徑分析儀(Malvern),紫外分光光度計(島津UV2600),電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(ICP-OES)(Agilent 720ES);紅外成像儀(Fotric 226),808nm激光儀(FC808-2W-MM,西安中川光電科技有限公司),振動樣品磁強計(VSM)(LakeShore 7404型),多功能酶標儀(BioTek),Vevo Laser光聲成像系統(Visual Sonics),磁共振成像系統(SIEMENS),激光共聚焦顯微鏡(Andor2000)。

    1.2方法

    1.2.1FA-PFH-Fe3O4@ADM納米粒的制備納米粒采用雙乳化法制備,按照5∶2∶2比例稱取DPPC、DSPE-PEG2000-FA、膽固醇共5mg,溶于6mL三氯甲烷中。旋轉蒸發(fā)2h,得到白色薄膜,使用2mL PBS充分水化脂膜備用。稱取ADM 1mg于100μL PBS中溶解,加入200μL SPION,100μL PFH,冰浴下進行第1次超聲乳化(功率:35%;時間:1min,5s,5s),再加入水化液進行第2次超聲乳化(功率:40%;時間:3min,5s,5s)。低溫離心3次(8000r/min,5min),即可得到FA-PFH-Fe3O4@ADM納米粒乳液。制備過程中,使用DSPE-PEG2000替代DSPE-PEG2000-FA即可得到PFH-Fe3O4@ADM納米粒,不加入SPION即可得到FA-PFH@ADM納米粒。

    1.2.2FA-PFH-Fe3O4@ADM納米粒的基本特征檢測觀察納米粒乳液的性狀,稀釋后分別于光鏡、透射電鏡下觀察納米粒的形態(tài),使用馬爾文粒徑分析儀分析其粒徑、電位分布情況。分別使用紫外分光光度計及ICP-OES檢測納米粒,根據以下公式:包封率(%)=[(m加入試劑-m上清液中試劑)/m加入試劑] ×100%;載藥量(%)=[(m加入試劑-m上清液中試劑)/m納米粒] ×100%,計算納米粒中ADM及Fe的包封率和載藥量。VSM檢測納米粒的磁性能,并給納米粒施加磁場,觀察其順磁性能。

    1.2.3細胞培養(yǎng)及細胞毒性檢測使用含20%胎牛血清、1%青/鏈霉素雙抗的RPMI1640培養(yǎng)基,在5%CO2,37℃的恒溫孵箱中培養(yǎng)Y79細胞。傳代4次后,取對數生長期細胞接種于96孔板(1×104細胞/孔),加入不同濃度的FA-PFH-Fe3O4@ADM納米粒共同孵育24h。離心除去培養(yǎng)基,每孔加入10% CCK-8試劑100μL,繼續(xù)孵育1h,用酶標儀檢測各孔在450nm處的吸光度,各組細胞存活率根據以下公式計算:細胞存活率(%)=(實驗組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)×100%。

    1.2.4FA-PFH-Fe3O4@ADM納米粒的光熱效應及光致相變能力檢測將納米粒分為PBS組、FA-PFH@ADM組、不同濃度(0.156、0.313、0.625、1.25mg/mL)FA-PFH-Fe3O4@ADM組,置于96孔板中,使用808nm激光(2W/cm2)輻照5min,并記錄其升溫情況。取0.625mg/mL的納米粒于96孔板中,使用不同功率(1.0、1.5、2.0、2.5W/cm2)808nm激光輻照5min,并記錄其升溫情況。在升溫過程中,使用光學顯微鏡觀察納米粒微氣泡產生情況,探索納米粒發(fā)生相變條件。

    1.2.5FA-PFH-Fe3O4@ADM納米粒體外靶向性取對數生長期的Y79細胞接種于6孔板,分為對照組、非靶向組、單葉酸靶組、單磁靶組、葉酸-磁雙靶組。對照組不加入納米粒,非靶向組及單磁靶組加入PFH-Fe3O4@ADM納米粒(0.625mg/mL),單葉酸靶組及葉酸-磁雙靶組加入FA-PFH-Fe3O4@ADM納米粒(0.625mg/mL),并于單磁靶組和葉酸-磁雙靶組的孔板側放約4T磁鐵1枚,靠近磁鐵側的細胞視為磁靶區(qū)域內的細胞。細胞與納米粒共同孵育1h,離心除去未吞噬的納米粒,使用4%多聚甲醛固定細胞,DAPI染色液染色細胞核,通過激光共聚焦顯微鏡觀察各組細胞吞噬情況,并進行流式細胞學檢測進行定量分析。

    1.2.6FA-PFH-Fe3O4@ADM納米粒體外超聲/光聲/MRI三模態(tài)成像將1.25mg/mL FA-PFH-Fe3O4@ADM納米粒置于4%的凝膠孔洞模型中,使用808nm激光儀(2W/cm2)分別作用0、1、2、3、5min,再使用光聲成像儀的B模式和造影模式分別記錄其超聲圖像并讀取相應聲強值。將FA-PFH-Fe3O4@ADM納米粒配制為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL五個不同濃度,取200μL于3%的凝膠孔洞模型中,于光聲成像儀上檢測各濃度的光聲圖像并讀取相應光聲信號值。將H2O和不同濃度(0.025、0.05、0.1、0.2、0.4mg/mL)FA-PFH-Fe3O4@ADM納米粒置于2mL圓底離心管中,使用磁共振成像系統檢測其T2像的磁共振圖像,并讀取計算相應T2信號值。

    2結果

    2.1FA-PFH-Fe3O4@ADM納米粒的基本特征FA-PFH-Fe3O4@ADM納米粒制備成功,呈棕紅色乳液,鏡下可見其為大小均勻、分散性好的球形結構(圖1A),馬爾文粒徑分析儀檢測其分布為單峰,粒徑為338.6±2.20nm(圖1B),電位為-26.6±0.62mV。紫外分光光度法檢測ADM的回歸方程為:y=0.01474x+0.04893(x表示ADM溶液濃度,y表示吸光度),R2=0.9975(圖1C),ADM的包封率為(41.76±4.12)%,載藥量為(6.96±0.69)%。ICP-OES檢測Fe的回歸方程為:y=17183.6480x-46.8579(x表示標準Fe溶液濃度,y表示響應強度),R2=1.0000(圖1C),Fe的包封率為(59.06±13.63)%,載藥量為(7.13±1.65)%。VSM檢測納米粒具有超順磁性,并觀察到納米粒能夠在磁場下定向聚集(圖1D)。

    圖1 FA-PFH-Fe3O4@ADM納米粒的基本特征 A:納米粒乳液及光鏡和透射電鏡下觀察情況;B:納米粒粒徑分布圖;C:ADM及Fe檢測的標準曲線;D:納米粒的磁滯曲線及磁性能觀察圖。

    2.2FA-PFH-Fe3O4@ADM納米粒的細胞毒性CCK-8實驗結果顯示,不同濃度(0、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6mg/mL FA-PFH-Fe3O4@ADM)組細胞存活率分別為(1.00±0.00)%、(0.96±0.12)%、(0.94±0.06)%、(0.95±0.16)%、(0.88±0.06)%、(0.87±0.11)%,各組細胞存活率均較高,即使在高濃度下,細胞存活率也能達到85%以上,且各組細胞存活率差異無統計學意義(F=0.80,P>0.05),證明納米粒的生物安全性良好。

    2.3FA-PFH-Fe3O4@ADM納米粒的光熱效應及光致相變能力體外光熱實驗顯示,FA-PFH-Fe3O4@ADM納米??梢栽?08nm激光輻照下產生光熱效應,且升溫速度和最高溫度與納米粒的濃度及激光功率呈正相關(圖2A~D)。激光輻照后,顯微鏡下觀察納米??梢园l(fā)生液氣相變,生成微氣泡(圖2E)。

    圖2 FA-PFH-Fe3O4@ADM納米粒的光熱效應及光致相變能力 A:不同濃度納米粒在808nm激光輻照(2W/cm2)下的升溫曲線;B:不同濃度納米粒在808nm激光輻照(2W/cm2)下的升溫圖;C:納米粒(0.625mg/mL)在不同功率808nm激光輻照下的升溫曲線;D:納米粒(0.625mg/mL)在不同功率808nm激光輻照下的升溫圖;E:相變前后納米粒光鏡下觀察結果。

    2.4FA-PFH-Fe3O4@ADM納米粒體外靶向性激光共聚焦顯微鏡下,ADM呈紅色熒光,Y79細胞核DAPI染色呈藍色熒光。對照組和非靶向組細胞中幾乎不可見納米粒,單葉酸靶組和單磁靶組細胞中可見部分納米粒,葉酸-磁雙靶組細胞中可見大量納米粒(圖3A)。流式細胞學檢測結果顯示,非靶向組、單葉酸靶組、單磁靶組、葉酸-磁雙靶組吞噬率分別為(6.99±0.16)%、(43.36±5.91)%、(28.58±3.23)%、(86.19±0.55)%,差異有統計學意義(F=196.3,P<0.05,圖3B),與激光共聚焦顯微鏡所示結果一致。

    圖3 FA-PFH-Fe3O4@ADM納米粒體外靶向性 A:激光共聚焦顯微鏡觀察各組細胞吞噬納米粒情況;B:流式細胞學檢測各組細胞吞噬納米粒情況,bP<0.01 vs 非靶向組。

    2.5FA-PFH-Fe3O4@ADM納米粒體外超聲/光聲/MRI三模態(tài)成像體外超聲成像結果顯示,FA-PFH-Fe3O4@ADM納米粒在808nm激光輻射后,超聲信號明顯增強,且在B模式和造影模式下,平均聲強值與激光輻照時間均呈明顯正相關(R2=0.9812、0.9426,圖4A)。體外光聲成像結果顯示,FA-PFH-Fe3O4@ADM納米粒有明顯的光聲成像能力,其平均光聲信號值與納米粒濃度呈明顯正相關(R2=0.9721,圖4B)。體外MRI結果顯示,隨著納米粒濃度的增加,其平均信號值逐漸降低,呈明顯負相關(R2=0.9905,圖4C),FA-PFH-Fe3O4@ADM納米粒r2值為43.73mM-1S-1。

    圖4 FA-PFH-Fe3O4@ADM納米粒體外超聲/光聲/MRI三模態(tài)成像 A:納米粒在B模式和造影模式下經808nm激光激發(fā)不同時間后體外超聲成像圖及聲強分析;B:不同濃度納米粒體外光聲成像圖及光聲信號分析;C:不同濃度納米粒體外MRI圖及信號分析。

    3討論

    臨床上通常使用眼底檢查、眼部B超、MRI檢查、熒光素眼底血管造影等手段確診RB,但這些檢查往往難以查明早期病變,從而延誤治療[14]。因此,目前仍然急需能夠在出現明顯可見的形態(tài)學改變之前,及早發(fā)現RB的診斷方法。近年來,分子成像技術逐漸被運用到各類惡性腫瘤的研究中[15-16],其可視化、靶向、無創(chuàng)等優(yōu)點在RB的早期診療上很有發(fā)展前景。基于臨床上的迫切需求,本研究結合分子影像學技術構建了一種新型多功能納米分子探針FA-PFH-Fe3O4@ADM,其作為載體可以將藥物遞送至靶部位,進行無創(chuàng)、實時、精細顯像。本研究成功使用雙乳化法,以生物相容性好、易載藥、易修飾的脂質體[17]作為載體,制備了雙靶向多模態(tài)成像分子探針。

    高效的靶向性是分子探針發(fā)揮效用的基礎,本研究制備的FA-PFH-Fe3O4@ADM納米粒平均粒徑僅338.6±2.20nm,可以穿過血管內皮細胞到達腫瘤部位,通過實體瘤的高通透性和滯留效應被動聚集于腫瘤組織,但其作用能力有限。主動靶向作用能使納米粒更高效地聚集于目標組織,其中配體-受體介導的主動靶向及磁靶向是近年研究的熱點。葉酸受體在多種惡性腫瘤高表達[18],具有葉酸靶向功能的納米粒已成功應用于多種惡性腫瘤的診療,Wu等[19]制備的葉酸靶向納米分子探針可通過與RB細胞表面的葉酸受體結合,特異性地聚集于RB細胞周圍。但由于特異性受體具有飽和效應及腫瘤微環(huán)境的阻礙,導致配體修飾型主動靶向探針的靶向能力受到一定限制。磁靶向是一種新型主動靶向模式,Suciu等[20]發(fā)現SPION作為磁靶,在外加磁場的作用下會聚集在作用部位,并且具有穩(wěn)定、高效、低毒的特點?;谝陨涎芯?,結合本課題組前期對葉酸-磁雙靶向納米粒的探索[21],本研究將配體-受體介導的分子靶向的特異性與磁靶向的高效性相結合,構建了雙靶向分子探針。尋靶實驗驗證了FA-PFH-Fe3O4@ADM納米粒的雙重靶向性能,葉酸-磁雙靶組視網膜母細胞瘤Y79細胞吞噬納米粒的數量約為單葉酸靶組和單磁靶組的2~3倍,實現了探針在Y79細胞內的高效聚集。

    目前,分子成像技術包括超聲、電子計算機斷層掃描(CT)、熒光、MRI、單光子發(fā)射計算機斷層掃描儀/正電子發(fā)射計算機斷層掃描(SPECT/PET)等,單一成像技術難以滿足臨床多樣化的需求,集其中多種成像優(yōu)勢于一體的多模態(tài)造影劑是研究的熱點。Xiao等[22]制備的以PFH為內核的相變型納米超聲分子,能夠通過近紅外激光的激發(fā),發(fā)生光致相變,將PFH由液態(tài)轉變成氣態(tài),即液氣相變,從而增強超聲顯影,實現了腫瘤的早期診斷。光聲成像是一種新型的成像方式,通過物質吸收光產生超聲信號,具有高對比度和分辨率。MRI是臨床常用的RB診斷方式,SPION作為美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)認證用于腫瘤的磁共振顯像劑,可以準確提供腫瘤及其周邊組織信息。Sivakumar等[23]設計的靶向納米復合材料中,SPION既可以通過吸收近紅外光進行光聲成像,也可以通過對T2像的負性增強來進行磁共振成像。結合以上研究,本研究制備的FA-PFH-Fe3O4@ADM納米粒在體外通過激光激發(fā)可增強超聲/光聲成像,且以SPION作為T2對比劑增強了磁共振成像,實現了實時全面精準的成像。

    此外,Dolatkhah等[24]制備了GO-SPION-MTX納米復合材料,其中SPION在近紅外光的作用下具有光熱轉換能力,可以對乳腺癌進行光熱治療。本研究探究了在808nm激光作用下FA-PFH-Fe3O4@ADM的光熱性能,證明納米粒有進行光熱治療的潛力。與此同時,隨著納米粒溫度升高,PFH發(fā)生液氣相變,有利于化療藥物的釋放。由此可見,FA-PFH-Fe3O4@ADM納米粒具有激光作用下治療RB的潛力,但其治療效果和作用機制還有待進一步研究。

    綜上所述,本研究成功制備了葉酸靶向聯合磁靶向、包裹ADM的相變型納米粒(FA-PFH-Fe3O4@ADM),在優(yōu)化的葉酸-磁雙靶作用下,納米粒在視網膜母細胞瘤Y79細胞內大量聚集,并進行了體外超聲/光聲/MRI三模態(tài)顯像,實現了體外精準靶向及顯像,為RB的早期診斷帶來了新的希望。與此同時,FA-PFH-Fe3O4@ADM納米粒具有光熱效應并能在激光下發(fā)生光致相變,為進一步的光熱聯合化療奠定了基礎。

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