基于TLR4/NF-κB信號通路探討綠原酸對糖尿病腎病大鼠腎組織炎癥和凋亡的影響

張文靜,徐新禹

(1. 朝陽市中心醫(yī)院，遼寧 朝陽 122000;2. 四川大學(xué)華西臨床醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610000)

糖尿病腎病是糖尿病嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一，也是引起糖尿病患者死亡的重要原因之一。該病發(fā)病特點(diǎn)是腎小球血管受損、硬化，臨床以尿蛋白排泄量增加為主要特征，其治療主要是基于血壓和血糖的控制，尚無有效的治療策略[1-2]。目前研究認(rèn)為，氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、糖脂代謝功能障礙、血流動力學(xué)異常及細(xì)胞凋亡等多種因素參與糖尿病腎病的發(fā)生和發(fā)展，其中腎組織的持續(xù)炎癥反應(yīng)及高糖引起的腎組織細(xì)胞凋亡是糖尿病腎病發(fā)展的重要病理生理基礎(chǔ)[3-5]。因此，探究糖尿病腎病腎組織炎癥及細(xì)胞凋亡的發(fā)生機(jī)制，對于防治糖尿病腎病具有重要的臨床意義。綠原酸是一種中草藥提取物，主要存在于金銀花、山楂、杜仲和菊花等中藥中，已被證明具有顯著的抗炎、抗氧化、抗菌和免疫調(diào)節(jié)作用[6-7]。朱超等[8]報(bào)道，綠原酸可通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)而減輕糖尿病氧化性腎損傷，對糖尿病腎病具有一定治療作用。本研究旨在觀察綠原酸對糖尿病腎病大鼠腎功能、腎組織炎癥和細(xì)胞凋亡的影響，并探討其可能作用機(jī)制，為尋找綠原酸治療糖尿病腎病的作用靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物 SPF級健康雄性SD大鼠60只， 8周齡，體重(220±30 )g，購自大連醫(yī)科大學(xué)，動物合格證號：SCXK(遼)2018-0003。在室溫(23±2)℃、相對濕度50%～70 %、自然光照環(huán)境中飼養(yǎng)。動物處置符合相關(guān)倫理要求。

1.2試劑 綠原酸(純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司)；鏈脲佐菌素[STZ，純度≥98 %，翌圣生物科技(上海)股份有限公司]；過碘酸-雪夫氏(PAS)染色試劑盒、HE染色試劑盒、TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、RIPA緩沖液、BCA蛋白檢測試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)研究所)；大鼠血肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)、尿蛋白定量、空腹血糖(FPG)檢測試劑盒(南京建成生物科技有限公司)；白細(xì)胞介素-6(IL-6)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測試劑盒(上海江萊生物科技有限公司)；兔抗B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)、淋巴細(xì)胞瘤-2相關(guān)蛋白X(Bax)、Cleaved-caspase-3、Toll樣受體4(TLR4)、核轉(zhuǎn)錄因子-κB p65(NF-κB p65)、磷酸化NF-κB p65(p-NF-κB p65)、IκBα、p-IκBα抗體和鼠抗β-肌動蛋白(β-actin)抗體、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG、HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG(美國Abcam公司)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法 60只大鼠飼養(yǎng)1周適應(yīng)環(huán)境后，隨機(jī)分為正常組、模型組、綠原酸低劑量組、綠原酸中劑量組、綠原酸高劑量組、二甲雙胍組，每組10只。除正常組腹腔注射檸檬酸鈉緩沖液外，其他各組大鼠腹腔注射50 mg/kg STZ(檸檬酸鈉緩沖液稀釋)建立糖尿病模型，連續(xù)注射5 d，最后一次注射72 h后采用尾靜脈針刺取血的方法檢測大鼠FPG水平，F(xiàn)PG>11.1 mmol/L表示糖尿病模型建立成功。此后定期檢測大鼠FPG和24 h尿蛋白，持續(xù)出現(xiàn)蛋白尿的大鼠為糖尿病腎病造模成功。造模成功后第2天，綠原酸低、中、高劑量組大鼠分別灌胃30 mg/kg、60 mg/kg、120 mg/kg 的綠原酸，二甲雙胍組大鼠灌胃200 mg/kg的二甲雙胍，正常組和模型組大鼠灌胃同等劑量的生理鹽水，均1次/d，連續(xù)灌胃8周。

1.4檢測指標(biāo)及方法

1.4.1腎功能指標(biāo)和FPG水平 末次灌胃12 h后，收集大鼠24 h尿液用于檢測24 h 尿蛋白定量；采集大鼠眼球血，以3 000 r/min離心10min，分離血清，保存于-20 ℃冰箱，采用全自動生化分析儀檢測SCr和BUN水平，血糖儀檢測FPG。

1.4.2腎組織HE染色病理形態(tài) 采血結(jié)束后處死大鼠，取腎組織，用預(yù)冷的生理鹽水洗滌，將左腎置于4 %多聚甲醛中固定24 h，依次蒸餾水浸泡、石蠟包埋、二甲苯透明、梯度酒精脫水，制成5 μm厚度的石蠟切片，取石蠟切片進(jìn)行脫蠟、水化，用蘇木精染色5 min，PBS洗滌后，在1%鹽酸酒精中分化，伊紅溶液中染色30 s，梯度酒精脫水，透明處理后，中性樹膠密封，在光學(xué)顯微鏡下觀察組織病理變化。

1.4.3腎組織PAS染色形態(tài) 取大鼠腎組織石蠟切片，二甲苯脫蠟、蒸餾水沖洗，1.5%高碘酸處理25 min，用蒸餾水反復(fù)洗滌，PAS染色30 min，流水沖洗至顯出紅色，蘇木素復(fù)染5 min，流水沖洗，脫水、透明、封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察染色結(jié)果，PAS染色陽性顯示為紫紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)色。

1.4.4血清炎癥因子水平 -20 ℃冰箱中取出各組大鼠血清，嚴(yán)格參照大鼠ELISA試劑盒說明書檢測血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平。

1.4.5腎組織細(xì)胞凋亡情況 取大鼠腎組織石蠟切片，常規(guī)脫蠟、脫水，按照試劑盒說明書進(jìn)行TUNEL染色，光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡情況，凋亡細(xì)胞呈褐色，計(jì)算細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)。AI=凋亡細(xì)胞數(shù)目/細(xì)胞總數(shù)目×100%。

1.4.6腎組織中凋亡蛋白和TLR4/NF-κB信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況 采用Western blot 法檢測：取-80 ℃保存的大鼠右腎組織，用含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液裂解提取總蛋白質(zhì)，使用BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度，取定量蛋白上樣至SDS-PAGE凝膠電泳上，分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，在室溫下用5%脫脂奶粉封閉2 h后，將膜與1∶1 000比例稀釋的一抗(TLR4、p-NF-κB p65、NF-κB p65、p-IκBα、IκBα、Bcl-2、Bax、Cleaved-caspase-3和β-actin)在4 ℃條件下孵育過夜，洗滌膜后，將膜與HRP結(jié)合的二抗在室溫下孵育2 h，使用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光試劑顯影，以生物光譜凝膠成像系統(tǒng)分析圖像，β-actin作為內(nèi)參蛋白對照條帶進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化目的蛋白。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠腎功能指標(biāo)和FPG水平比較 模型組大鼠24 h 尿蛋白定量、SCr、BUN、FPG水平均明顯高于正常組(P均<0.05)；綠原酸各劑量組和二甲雙胍組大鼠24 h 尿蛋白定量、SCr、BUN、FPG水平均明顯低于模型組(P均<0.05)，且綠原酸高劑量組、二甲雙胍組各指標(biāo)水平均明顯低于綠原酸低劑量組和綠原酸中劑量組(P均<0.05)。見表1。

表1 正常組和糖尿病腎病各組大鼠腎功能指標(biāo)和FPG比較

2.2各組大鼠腎組織病理形態(tài)學(xué)表現(xiàn) HE染色和PAS染色顯示，正常組大鼠腎小球大小、形態(tài)正常，結(jié)構(gòu)完整、清晰，腎小管上皮細(xì)胞排列規(guī)則，無細(xì)胞壞死及炎性細(xì)胞浸潤；模型組大鼠腎小球體積增大，基底膜擴(kuò)張?jiān)龊?，腎小管結(jié)構(gòu)紊亂，發(fā)生空泡樣變性，存在較多炎性細(xì)胞浸潤；與模型組比較，綠原酸各劑量組和二甲雙胍組大鼠腎小球體積減小，腎小球基底膜增厚和腎小管空泡樣變性得到不同程度改善，炎性細(xì)胞浸潤減少，其中綠原酸高劑量組和二甲雙胍組大鼠腎組織病理改變更輕。見圖1。

圖1 正常組和糖尿病腎病各組大鼠腎組織病理形態(tài)學(xué)表現(xiàn)

2.3各組大鼠血清炎癥因子水平比較 模型組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平均明顯高于正常組(P均<0.05)；綠原酸各劑量組和二甲雙胍組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平均明顯低于模型組(P均<0.05)，且綠原酸高劑量組和二甲雙胍組各指標(biāo)水平均明顯低于綠原酸低劑量組和綠原酸中劑量組(P均<0.05)。見表2。

2.4各組大鼠腎組織細(xì)胞凋亡情況 TUNEL染色顯示，模型組大鼠腎組織細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，AI為(35.61±1.79)%，明顯高于正常組的(2.83±0.53)%(P<0.05)；綠原酸各劑量組和二甲雙胍組大鼠腎組織細(xì)胞凋亡減少，AI分別為(26.38±1.45)%、(19.47±1.26)%、(10.35±1.02)%、(8.47±0.78)%，均明顯低于模型組(P均<0.05)，且綠原酸高劑量組和二甲雙胍組大鼠腎組織細(xì)胞凋亡更少，AI均明顯低于綠原酸低劑量組和綠原酸中劑量組(P均<0.05)。見圖2。

圖2 正常組和糖尿病腎病各組大鼠腎組織細(xì)胞凋亡情況(TUNEL染色法，×400)

2.5各組大鼠腎組織凋亡蛋白與TLR4/NF-κB信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況 與正常組比較，模型組大鼠腎組織中Bcl-2蛋白相對表達(dá)量明顯降低(P均<0.05)，Bax、Cleaved-caspase-3、TLR4蛋白相對表達(dá)量和p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-IκBα/IκBα均明顯升高(P均<0.05)；與模型組比較，綠原酸各劑量組和二甲雙胍組大鼠腎組織中Bcl-2蛋白相對表達(dá)量均明顯升高(P均<0.05)，Bax、Cleaved-caspase-3、TLR4蛋白相對表達(dá)量和p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-IκBα/IκBα均明顯降低(P均<0.05)；與綠原酸低劑量組和綠原酸中劑量組比較，綠原酸高劑量組和二甲雙胍組大鼠腎組織中Bcl-2蛋白相對表達(dá)量均更高(P均<0.05)，Bax、Cleaved-caspase-3、TLR4蛋白相對表達(dá)量和p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-IκBα/IκBα均更低(P均<0.05)。見圖3和圖4。

圖3 正常組和糖尿病腎病各組大鼠腎組織中凋亡蛋白表達(dá)情況

圖4 正常組和糖尿病腎病各組大鼠腎組織TLR4/ NF-κB信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況

3 討 論

糖尿病腎病是全球慢性腎病的主要原因，目前臨床上尚無治療該病的有效藥物。近年來，隨著中醫(yī)藥現(xiàn)代化的快速發(fā)展，中醫(yī)藥辨證療法逐漸應(yīng)用于糖尿病腎病的治療，并被證實(shí)具有良好的療效[9]。綠原酸是一種由咖啡酸與奎尼酸形成的苯丙素類物質(zhì)，屬于多種中草藥的主要有效成分之一，其具有抗氧化、抗凋亡、降糖、降脂、心血管保護(hù)等多種生物學(xué)效應(yīng)[10]。Bhandarkar等[11]研究表明綠原酸可減輕大鼠高碳水化合物、高脂肪飲食引起的心血管、肝臟和代謝變化。Liu等[12]研究發(fā)現(xiàn)綠原酸能夠通過調(diào)控氧化應(yīng)激相關(guān)Nrf2通路對腦缺血/再灌注損傷大鼠發(fā)揮保護(hù)作用。Gao等[13]研究認(rèn)為綠原酸可通過調(diào)節(jié)MAPK/ERK/JNK途徑改善右旋糖酐鈉誘導(dǎo)的小鼠潰瘍性結(jié)腸炎。Kong等[14]研究發(fā)現(xiàn)綠原酸可通過Sirt1介導(dǎo)的氧化還原和線粒體功能抑制百草枯誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)采用腹腔注射STZ的方法建立糖尿病腎病大鼠模型，結(jié)果顯示模型組大鼠FPG水平顯著升高，腎功能顯著下降，腎臟組織存在明顯的損傷和炎性細(xì)胞浸潤；綠原酸各劑量組和二甲雙胍組大鼠FPG水平顯著降低，腎功能和腎組織損傷明顯改善，且綠原酸干預(yù)效果隨劑量增加而增強(qiáng)。提示綠原酸對糖尿病腎病具有一定的緩解作用，這與其他學(xué)者的研究結(jié)果相印證[15-16]。

高糖介導(dǎo)的腎臟慢性炎癥反應(yīng)是糖尿病腎病發(fā)病機(jī)制的重要組成部分，糖尿病腎病發(fā)生、發(fā)展過程中過度表達(dá)的炎癥因子也是促進(jìn)腎纖維化、導(dǎo)致腎衰竭的主要因素[17]。多項(xiàng)研究報(bào)道，IL-1β、IL-6、TNF-α等炎性因子在糖尿病腎病大鼠腎臟中表達(dá)增加，而下調(diào)上述炎性因子的表達(dá)可減輕糖尿病腎病大鼠的炎癥反應(yīng)[18-19]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平顯著升高，綠原酸各劑量組和二甲雙胍組大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平顯著降低。該結(jié)果與Bao等[20]研究結(jié)果一致，提示綠原酸可通過降低IL-1β、IL-6、TNF-α水平抑制糖尿病腎病大鼠炎癥反應(yīng)。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞在分化和發(fā)育過程中由多種基因調(diào)控發(fā)生的自發(fā)性死亡方式，能被各種病理因素觸發(fā)。在糖尿病腎病中，高血糖引發(fā)的腎細(xì)胞凋亡是糖尿病腎病的主要病理特征，腎細(xì)胞凋亡進(jìn)一步引起腎小管間質(zhì)纖維化和腎小球硬化[21]。Yi等[22]報(bào)道，綠原酸可通過抑制凋亡蛋白Caspase-3蛋白表達(dá)及Bax/Bcl-2蛋白的比值抑制玉米赤霉烯酮誘導(dǎo)的卵巢顆粒細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)中，綠原酸各劑量組和二甲雙胍組大鼠腎組織細(xì)胞凋亡及腎組織中Bax和Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)較模型組明顯減少，腎組織中Bcl-2蛋白表達(dá)較模型組明顯增加，表明綠原酸可通過調(diào)控凋亡蛋白表達(dá)而抑制腎細(xì)胞凋亡。

Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)是天然免疫系統(tǒng)中一類保守的模式識別受體，在外界病原體刺激下可激活下游炎癥信號通路。TLR4是TLRs家族中的重要成員，在炎癥反應(yīng)發(fā)生過程中起著關(guān)鍵性作用。NF-κB作為TLR4信號通路的下游效應(yīng)因子，在正常生理?xiàng)l件下以無活性的NF-κB p65和p50等構(gòu)成的異源二聚體與抑制性蛋白IκBα結(jié)合，而在病理?xiàng)l件下，IκB激酶能夠使IκBα特異磷酸化，促使NF-κB p65轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核中，導(dǎo)致機(jī)體釋放炎癥因子而引發(fā)炎癥反應(yīng)。有研究報(bào)道，TLR4/NF-κB信號通路在急性腎損傷、慢性腎臟疾病中發(fā)揮重要作用[23-24]。Ye等[25]研究提示，綠原酸能夠通過抑制TLR4/NF-κB通路減輕脂多糖誘導(dǎo)的急性腎損傷。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，綠原酸和二甲雙胍可有效下調(diào)糖尿病腎病大鼠腎組織中TLR4蛋白表達(dá)，抑制NF-κB p65和IκBα磷酸化。提示綠原酸可能通過抑制TLR4/NF-κB信號通路保護(hù)糖尿病腎病大鼠腎功能。

綜上所述，綠原酸可通過減輕腎組織炎癥和調(diào)控凋亡蛋白表達(dá)而抑制腎細(xì)胞凋亡，保護(hù)糖尿病腎病大鼠腎功能，其內(nèi)在機(jī)制可能與調(diào)控TLR4/NF-κB信號通路有關(guān)，為綠原酸治療糖尿病腎病提供了新的潛在靶點(diǎn)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。