黃芩有效成分干預纖維化疾病研究進展

呂 鵬，劉曉明，李 芮

(1. 山東中醫(yī)藥大學，山東 濟南 250014；2. 山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，山東 濟南 250014)

纖維化可以影響任何器官，據報道，高達45%的死亡是由纖維化造成的[1]。但是目前缺乏有效的治療藥物，所以研發(fā)多組織器官的抗纖維化藥物具有重大意義。值得注意的是，雖然人們一直認為纖維化是一種持續(xù)發(fā)展和不可逆的過程，但臨床前模型和各種器官系統(tǒng)的臨床試驗都表明，纖維化是一個高度動態(tài)的過程[2]，這為多組織器官新藥的探索提供了有力的支撐。黃芩中的化學成分包括黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、木蝴蝶素A、白楊素等[3]，這些成分也存在于其他中藥中，具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化、保肝、免疫、抗心律失常以及神經元保護作用[4]。近年來，大量的研究表明黃芩中的多種有效成分具有抗多種臟器纖維化的作用，非常值得深入研究與開發(fā)。本文就黃芩有效成分干預纖維化的作用機制進行回顧和綜述。

1 抑制炎癥通路并建立抗炎微環(huán)境

炎癥參與組織再生和纖維化的發(fā)展，但炎癥既不是組織再生的前提，也不是纖維化的必然結果[5]。通常情況下，組織損傷誘發(fā)炎癥，通過招募和激活先天免疫系統(tǒng)和適應性免疫系統(tǒng)中的各種不同細胞類型參與纖維化進展。研究證實，黃芩的有效成分通過抑制細胞因子、炎癥因子和免疫細胞可以成功地發(fā)揮抗纖維化作用。但是，考慮到細胞存在于一個相互作用的網絡中，一組促纖維因子的抑制有可能引起另一組促纖維因子的上調，同一種促纖維因子可能同時具有抗炎和促進組織再生的作用，炎癥因子本身除了誘導成纖維細胞的激活，也會分泌膠原蛋白，并且，在特定的環(huán)境中，被抑制的炎癥通路可能同時具有促纖維化和抗纖維化的雙重功能[5]，所以對黃芩抑制炎癥通路，建立抗炎微環(huán)境的綜合作用進行綜合評估尤為重要。例如，有研究發(fā)現(xiàn)[6]，在博來霉素誘導的肺纖維化大鼠模型中，黃芩苷可以降低肺組織中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細胞介素-1β(IL-1β)含量，以及支氣管肺泡灌洗液中炎癥細胞數量，在野百合堿誘導的肺動脈高壓大鼠模型中，肺組織馬松染色也證實了黃芩苷可顯著抑制肺組織膠原纖維化，其藥理作用與炎癥反應有關[7]。

在所有黃芩通過調節(jié)炎癥反應發(fā)揮抗纖維化作用的機制研究中，與核因子κB(NF-κB)通路相關的研究最為豐富。NF-κB通路一直被認為是一種典型的促炎信號通路，其主要依據是NF-κB在促炎基因(包括細胞因子、趨化因子和黏附分子)表達中的作用。在黃芩苷對煙霧誘導的大鼠氣道炎癥發(fā)揮調節(jié)作用的機制研究中發(fā)現(xiàn)，黃芩苷可以抑制NF-κB及其下游靶蛋白纖溶酶原激活物抑制物(PAI-1)的表達，起到預防氣道纖維化的作用[8]。白楊素可逆轉Ⅱ型肺泡上皮細胞上皮間質轉化(EMT)，減輕大鼠肺纖維化，其機制可能與升高NF-κB抑制蛋白(IκB)磷酸化，抑制NF-κB/p65磷酸化和核轉移，從而下調Twist 1的表達有關[9]。在鏈脲佐菌素誘導的糖尿病小鼠模型中，黃芩苷修復微生物群可逆轉NF-κB信號通路的活化和糖尿病相關的肺纖維化[10]。此外，黃芩苷還被證實在心、腎、胰腺以及腹膜的纖維化中通過該通路發(fā)揮作用。如Wu等[11]的研究證實，黃芩苷作為清達顆粒的主要成分可以通過抑制NF-κB通路，改善心臟重構和炎癥反應。黃芩中的另一種主要成分白楊素也被發(fā)現(xiàn)對心肌梗死后梗死外周區(qū)具有抗纖維化的心肌保護作用，其機制可能是上調PPAR-γ，抑制NF-κB和AP1通路[12]。在腎間質纖維化中，黃芩苷可以通過microRNA-124/TLR4/NF-κB軸抑制糖尿病腎病小鼠模型的腎纖維化進程[13]，其中TLR4是miR-124的潛在靶點，microRNA-124通過調節(jié)TLR4信號通路抑制促炎細胞因子表達，促進抗炎因子表達[14]。漢黃芩素也可以通過抑制NF-κB信號通路改善糖尿病腎病腎臟炎癥和纖維化[15]。Fan等[16]還發(fā)現(xiàn)，黃芩苷通過抑制胰腺星狀細胞活化的TGF-β1/TGF-βR1/TAK1/NF-κB信號通路，減少單核細胞趨化因子(MCP-1)的分泌，進一步減少胰腺局部微環(huán)境中巨噬細胞和炎癥細胞的浸潤，從而改善慢性胰腺炎小鼠胰腺纖維化。對于腹膜纖維化模型，黃芩苷也表現(xiàn)出來抗纖維化作用,其機制可能與其抑制腫瘤壞死因子受體相關因子6(TRAF6)表達，調控NF-κB通路有關[17]。

2 誘導肌成纖維細胞的失活與清除

肌成纖維細胞是瘢痕形成細胞，最初被認為是成纖維細胞的最終分化狀態(tài)[18]，現(xiàn)在被理解為來自不同的祖細胞，由具有相似表型和功能的異質細胞群組成[19-20]。在纖維化進程中，肌成纖維細胞負責細胞外基質的過度合成、沉積和重塑。持續(xù)的肌成纖維細胞活動導致進行性組織纖維化，扭曲了正常組織結構，逐漸引發(fā)器官衰竭，最終導致死亡。針對肌成纖維細胞凋亡、重編程、自噬、衰老或恢復到靜止表型正在成為一種新的逆轉纖維化的治療策略[5，21]。

被激活的肝星狀細胞是分泌基質蛋白的肌成纖維細胞的主要細胞來源，是肝纖維化發(fā)生的主要驅動力，誘導星狀細胞恢復到失活、衰老、凋亡或被免疫細胞清除使精確抗纖維化治療成為可能[22]。相較于其他器官組織的纖維化研究，肝纖維化的課題研究者們基于這一思路開展了更多的實驗研究，發(fā)現(xiàn)黃芩的有效成分木蝴蝶素A和漢黃芩素可以誘導已經活化的肝星狀細胞凋亡[23-24]，而木蝴蝶素A還可以通過激活自噬來緩解肝星狀細胞的活化從而發(fā)揮抗纖維化作用[25]。

3 調節(jié)細胞外基質的沉積

細胞外基質(ECM)是一種高度動態(tài)的結構，由負責ECM降解的特定酶介導，如金屬蛋白酶(MMP)。ECM不斷地經歷受控的重塑，當其成分、結構、硬度等失調時，會出現(xiàn)多種病理狀況，纖維化是其中之一[26]。轉化生長因子-β(TGF-β)是這一進程的主要調節(jié)因子，可通過激活規(guī)范的(基于Smad的)和非規(guī)范的(非基于Smad的)信號通路誘導肌成纖維細胞活化，誘導EMT，導致細胞外基質過度產生，并且可以抑制細胞外基質的降解[27-29]。所以，MMP與其組織抑制劑(TIMPs)以及TGF-β是各種器官纖維化的促進劑和潛在靶點，在維持ECM穩(wěn)態(tài)方面起著關鍵作用[26，30-31]。

多項研究表明，黃芩苷能夠有效阻止TGF-β1誘導的人肺癌A549細胞上皮間質轉化進程，減少TGF-β1誘導的A549細胞外基質沉積，可能是治療肺纖維化的有效成分[32-33]。其與靶蛋白TGF-β1結合能夠抑制MMP-2、TIMP-2的表達,推延肺纖維化進程[34]。同時，黃芩中的黃芩素也被證明可以通過下調結締組織生長因子，減輕TGF- β1誘導的肺成纖維細胞I型膠原生成，從而發(fā)揮抗肺纖維化作用[35]。而在腎、肝、胰腺、腸等器官組織的纖維化中，黃芩的有效成分也被證實可以通過調節(jié)細胞外基質的沉積發(fā)揮抗纖維化作用，如黃芩苷可能通過低調節(jié)TGF-β1從而降低α-SMA的表達，延緩腎間質纖維化和肝纖維化[36-44]。白楊素也可以通過抑制TGF-β1誘導的EMT改善肺纖維化和腎纖維化[45-46]，還可以通過調節(jié)MMP/TIMP失衡和抑制膠原蛋白的產生減弱肝臟ECM積累，延緩肝纖維化進展[47]。在胰腺纖維化的小鼠模型中，黃芩苷也發(fā)揮了類似的作用，通過抑制TGF-β1/TAK-NF-κB信號通路的活化,調節(jié)MMP-1/TIMP-1的相對平衡,發(fā)揮了較好的抗胰腺纖維化的作用[48]。此外，在放射誘導的大鼠直腸纖維化模型中，黃芩苷被證明可以通過抑制EMT、隱窩細胞凋亡的激活與增殖的抑制、緊密連接屏障結構的損傷以及促炎因子表達的上調來緩解放射性輻射所致的腸纖維化損傷[49]。

黃芩的有效成分不僅可以作用于TGF-β1通路，對ECM相關的非典型TGF-β1通路[29]包括ERK、p38 MAPK、JNK和Wnt/β-catenin等也展現(xiàn)出了有效的靶向作用。如黃芩苷可以通過抑制Wnt3a/β-catenin信號通路和EMT相關蛋白的活化對博來霉素誘導的肺纖維化小鼠發(fā)揮保護作用[50]，還可以通過ERK/GSK3β信號通路減輕輻射誘導的原代Ⅱ型肺泡上皮的EMT進程[51]。它與溶菌酶結合則可以在抗炎的基礎上，通過轉化生長因子-β/Smad3途徑抑制細胞外基質的積累，通過胰島素樣生長因子-1/胰島素樣生長因子-1受體/p38絲裂原活化蛋白激酶途徑調節(jié)細胞增殖，重新激活自噬[52]。此外，黃芩素可以通過microRNA-29激活p38MAPK-JNK抑制細胞增殖和膠原沉積[53]，這些研究都證明了黃芩有效成分對細胞外基質的沉積具有有效的調節(jié)作用。

4 抗氧化應激

氧化應激主要由活性氧(ROS)參與，并對纖維化進程產生影響。在纖維化中，ROS促進成纖維細胞和肌成纖維細胞的激活和增殖，以自分泌方式激活TGF-β通路，因此，我們可以通過提高抗氧化機制來克服ROS增加所產生的問題，其中關鍵的機制包括谷胱甘肽、核因子E-2相關因子2(Nrf2)和缺氧誘導轉錄因子(HIF-1α)，這些機制可能是創(chuàng)新療法的最佳靶點[54]。

在近期的多項研究中，黃芩的有效成分被發(fā)現(xiàn)具有抗氧化作用。如黃芩苷在膽汁淤積性肝纖維化模型中，通過核易位增強Nrf2的激活，并誘導靶基因血紅素氧合酶-1(HO-1)和谷氨酸半胱氨酸連接酶(GCLM)以增強抗氧化防御[43]。Ignat等[55]則將白楊素(CHR)和環(huán)糊精(RAMEB)結合，并對不同配比的CHR - RAMEB復合物進行氧自由基吸收值、超氧化物歧化酶活性和谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)測定和比較，最終發(fā)現(xiàn)1∶2 CHR-RAMEB復合物在提高藥物溶解度的基礎上，還增加了氧自由基吸收值，提高了超氧化物岐化酶活性，與其他配比相比，1∶2 CHR-RAMEB復合物對谷胱甘肽過氧化物酶活性的刺激更高，可以推薦為治療肝纖維化的候選藥物。此外，研究者也發(fā)現(xiàn)木蝴蝶素A可以通過介導的ROS消除，抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路，抑制抗炎活性，誘導自噬激活[56]，并且，木蝴蝶素A還可以通過下調YAP/HIF-1α信號通路來抑制肝纖維化中的血管新生[57]，通過抑制乳酸脫氫酶A(LDH-A)抑制氧糖酵解可減少星狀細胞收縮，減輕肝纖維化[58]，被視作是黃芩中具有抗氧化活性的有效成分。

5 緩解內質網應激

大量的遺傳和環(huán)境損害阻礙了細胞正確折疊，降低了翻譯后修改內質網(ERs)中的蛋白分泌和跨膜的能力，導致該細胞器中錯誤折疊的蛋白質的堆積，稱為內質網應激[59]。內質網應激既能誘導葡萄糖調節(jié)蛋白GRP78 、GRP94等內質網分子伴侶表達而產生保護效應 ,亦能獨立地誘導內源性細胞凋亡，最終影響應激細胞的轉歸,如適應、損傷或凋亡[60]。

雖然內質網應激與纖維化疾病的關系尚在探索，但許多實驗研究已經證明黃芩苷具有減少內質網應激的作用，可以對纖維化疾病有延緩或者預防作用。近幾年對黃芩苷通過減少內質網應激發(fā)揮抗纖維化作用的研究多集中在心肌纖維化中，雖然黃芩苷對腎性高血壓的降壓效果存有爭議，但是赫連曼等[61]與Dai等[62]的實驗均證明，黃芩苷可以使肌細胞糖調節(jié)蛋白GRP78、GRP94、CHOP、caspase-3的表達及細胞凋亡明顯降低，抑制心肌纖維化和心室重構。

6 小 結

任何器官的疾病損傷都會觸發(fā)一系列復雜的細胞和分子反應，最終導致組織器官纖維化。不同組織器官的纖維化改變有著類似的致病途徑，包括四個主要階段，首先是由器官的原發(fā)損傷所驅動的反應的啟動。第二階段是效應細胞的激活，第三階段是細胞外基質的形成，這兩個階段都與第四階段重疊，在此期間細胞外基質的動態(tài)沉積(和降解不足)促進了纖維化的進展，最終導致器官衰竭[63]。在這些活動中已經出現(xiàn)了特定的細胞成分，包括成纖維細胞、肌成纖維細胞、上皮組織來源的細胞(上皮向間充質轉化)。此外，核心分子通路也是至關重要的，例如，TGF-β通路在幾乎所有類型的纖維化中都是重要的。目前有關纖維化的細胞和分子研究已非常深入，但臨床仍缺乏有效的治療方法。研究者們對黃芩抗纖維化機制進行的研究具有重要意義。一方面，研究結果證明了黃芩有效成分治療纖維化疾病的關鍵機制：①抑制炎癥通路并建立抗炎微環(huán)境;②誘導肌成纖維細胞的失活與清除;③調節(jié)細胞外基質的沉積;④抗氧化應激;⑤緩解內質網應激等。另一方面，也佐證了不同纖維化疾病有著類似的致病機制，為新藥研發(fā)奠定研究基礎。但是目前黃芩有效成分干預纖維化仍停留在動物或者體外細胞的實驗研究階段，鮮有臨床轉化的報道，現(xiàn)有的實驗研究也存在著造模方法不統(tǒng)一，單通路研究不系統(tǒng)等問題。因此，作為潛力巨大的抗多組織器官纖維化藥物，黃芩有效成分：黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、木蝴蝶素A、白楊素的抗纖維化研究有待于進一步加強。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。