生物發(fā)光成像技術(shù)在腫瘤細(xì)胞活體可視化研究中的應(yīng)用研究進(jìn)展

陳 丹，王文靜，王慶雅，曾 鋆，詹勇華

(西安電子科技大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院分子與神經(jīng)影像教育部工程研究中心，陜西 西安 710126)

1 生物發(fā)光成像技術(shù)在活體可視化研究中的應(yīng)用進(jìn)展

生物發(fā)光成像技術(shù)(Bioluminescence Imaging，BLI)是一種可以在活體內(nèi)利用生物光信號(hào)關(guān)聯(lián)特定生理或病理細(xì)胞活動(dòng)，實(shí)時(shí)跟蹤監(jiān)測(cè)細(xì)胞、蛋白質(zhì)甚至基因動(dòng)態(tài)變化的分子成像技術(shù)。采用這種非侵入式技術(shù)可以在同一動(dòng)物、同一空間和時(shí)間條件下定量細(xì)胞進(jìn)程，檢測(cè)動(dòng)物體內(nèi)生物大分子的動(dòng)態(tài)變化[1]。

小動(dòng)物活體BLI通常采用熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)。將熒光素酶報(bào)告基因置于目標(biāo)基因啟動(dòng)子的控制之下，是構(gòu)建熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)常采用的方法。利用組織特異性甚至活性嚴(yán)格依賴于某個(gè)特定蛋白的啟動(dòng)子，可以在小動(dòng)物體內(nèi)根據(jù)熒光素酶的表達(dá)情況追蹤某一細(xì)胞進(jìn)程或跟蹤該特定蛋白的轉(zhuǎn)錄活性。另一種方法是克隆熒光素酶基因的cDNA到靶基因位點(diǎn)上。與上述方法不同，這種方法可以做到可視化靶基因的表達(dá)，而不是其蛋白活性的變化。這兩種方法都可以實(shí)現(xiàn)活體內(nèi)生物學(xué)進(jìn)程的實(shí)時(shí)無(wú)創(chuàng)成像。此外，成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列(CRISPR)/CRISPR 相關(guān)蛋白(Cas)技術(shù)的出現(xiàn)為熒光素酶基因插入到目的基因位點(diǎn)提供了更簡(jiǎn)便的方法。到目前為止，通過(guò)BLI進(jìn)行細(xì)胞活動(dòng)研究的小動(dòng)物模型中，使用最多的是小鼠模型。近幾年，也開(kāi)始出現(xiàn)斑馬魚(yú)模型的BLI研究報(bào)道。

螢火蟲(chóng)熒光素酶在熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)中應(yīng)用最為廣泛，它是一種熱不穩(wěn)定酶，半衰期約為2 h，可用于生物過(guò)程的動(dòng)力學(xué)研究[2]。表達(dá)螢火蟲(chóng)熒光素酶的器官和細(xì)胞攝入底物熒光素時(shí)，熒光素酶可以利用ATP作為能量來(lái)源，在氧氣存在的情況下催化熒光素發(fā)生氧化反應(yīng)形成氧化熒光素，同時(shí)發(fā)出生物熒光。而且，動(dòng)物體本身不會(huì)產(chǎn)生熒光素，需要依靠外源攝入才能引起熒光素酶的催化反應(yīng)，所以熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)在動(dòng)物體內(nèi)沒(méi)有背景干擾，具有極佳的信噪比。在小鼠模型中，外源熒光素可以通過(guò)腹腔注射的方式進(jìn)入體內(nèi)并迅速分布全身，甚至穿過(guò)包括胎盤(pán)在內(nèi)的血液組織屏障[2-3]。對(duì)于斑馬魚(yú)模型而言，熒光素通過(guò)腹腔注射或溶解在斑馬魚(yú)活動(dòng)的水體中，都可以達(dá)到理想的效果[4]。除了螢火蟲(chóng)熒光素酶外，還有許多其他熒光素酶也可以作為報(bào)告系統(tǒng)應(yīng)用于活體BLI。這些熒光素酶來(lái)源不同，催化底物也不盡相同，有D-熒光素、腔腸素和腔腸素類(lèi)似物furimazine[2]。被麻醉的動(dòng)物在吸收了外源熒光素酶底物后，放置在不透光的暗盒中，當(dāng)動(dòng)物體內(nèi)熒光素酶催化底物并產(chǎn)生生物發(fā)光反應(yīng)時(shí)，安裝在暗盒中的電荷耦合設(shè)備成像系統(tǒng)(CCD)將捕捉熒光素酶反應(yīng)中產(chǎn)生的光信號(hào)，通過(guò)計(jì)算機(jī)采集圖像數(shù)據(jù)，分析軟件將電子信號(hào)轉(zhuǎn)換成數(shù)值，并最終形成圖像。最開(kāi)始，大多數(shù)此類(lèi)設(shè)備只可以生成二維圖像結(jié)果，直到三維漫射發(fā)光斷層成像(DLIT)設(shè)備被開(kāi)發(fā)出來(lái)。DLIT設(shè)備考慮了光在組織中的散射和吸收，并可進(jìn)行光源的3D位置和亮度的估算，從而獲得檢測(cè)動(dòng)物的3D圖像結(jié)果[1-2]。

BLI技術(shù)的靈敏度受許多參數(shù)的影響，其中一個(gè)關(guān)鍵的影響因素是動(dòng)物體內(nèi)熒光素酶標(biāo)記細(xì)胞的深度。熒光素酶催化底物產(chǎn)生的光雖然具有較強(qiáng)的穿透能力，能夠穿透小型動(dòng)物模型的組織，但是有研究發(fā)現(xiàn)每多1 cm的組織深度，光強(qiáng)就會(huì)降低10倍。Signore等[1]還發(fā)現(xiàn)小鼠體表毛皮上的色素沉著也會(huì)降低生物發(fā)光值，不過(guò)采用去除體表毛發(fā)或者選取白化小鼠品系的方式，可以減小這一誤差。而對(duì)于斑馬魚(yú)模型而言，由于其體型小而無(wú)毛，與其他動(dòng)物相比更有利于體內(nèi)生物發(fā)光穿透組織到達(dá)皮膚表面。此外，BLI技術(shù)的靈敏度還受到調(diào)控?zé)晒馑孛副磉_(dá)的啟動(dòng)子活性強(qiáng)度和細(xì)胞轉(zhuǎn)基因效率的影響。不僅如此，成像系統(tǒng)中所使用的CCD相機(jī)也是調(diào)節(jié)靈敏度的一個(gè)重要變量。

從倫理學(xué)角度來(lái)看，活體小動(dòng)物BLI采用了非侵入式成像的方法，可以在不傷害和犧牲小動(dòng)物的情況下達(dá)到實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，并極大程度上減少了所需實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的數(shù)量。

2 BLI轉(zhuǎn)基因小鼠模型應(yīng)用進(jìn)展

作為一種功能強(qiáng)大的無(wú)創(chuàng)分子影像技術(shù)，BLI技術(shù)可以在活體生理環(huán)境中監(jiān)測(cè)單個(gè)生物大分子的行為。在過(guò)去的十年里，這項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用已經(jīng)從對(duì)解剖結(jié)構(gòu)的靜態(tài)觀察擴(kuò)展到對(duì)分子事件的動(dòng)態(tài)分析。在腫瘤研究中，BLI與腫瘤模型相結(jié)合，為實(shí)時(shí)追蹤腫瘤進(jìn)展相關(guān)的分子事件提供了新方法。利用BLI技術(shù)，可以在轉(zhuǎn)基因腫瘤小鼠模型中可視化腫瘤的生長(zhǎng)和腫瘤相關(guān)的細(xì)胞活動(dòng)，如腫瘤增殖、存活和侵襲以及細(xì)胞炎癥和免疫反應(yīng)。這些基于熒光素酶成像的轉(zhuǎn)基因小鼠模型(GEMM)不僅可以用于示蹤活體內(nèi)生理和病理過(guò)程，還可以檢測(cè)抗腫瘤化合物的治療效果。

2.1 顯示細(xì)胞生長(zhǎng)的報(bào)告基因小鼠模型 細(xì)胞周期的異常往往會(huì)導(dǎo)致腫瘤的形成與發(fā)展，與細(xì)胞增殖調(diào)控有關(guān)的生物大分子的可視化動(dòng)態(tài)分析無(wú)疑可以幫助大家更好地理解細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中的各種活動(dòng)。2012年Goeman等[5]報(bào)道了一個(gè)真核生物核因子(NF-Y)依賴性啟動(dòng)子調(diào)控的熒光素酶報(bào)告基因GEMM，該模型中每個(gè)處于細(xì)胞周期中的細(xì)胞都會(huì)表達(dá)熒光素酶，結(jié)合BLI技術(shù)既可以觀察到小鼠體內(nèi)正常的細(xì)胞增殖區(qū)域，也可以觀察到肝損傷后細(xì)胞再生過(guò)程中NF-Y的活性。這項(xiàng)研究也表明此類(lèi)小鼠模型可用于研究參與細(xì)胞增殖的基因功能和疾病發(fā)病機(jī)制中的異常增殖過(guò)程。它們也將有助于開(kāi)發(fā)新的抗增殖和促增殖藥物，用于評(píng)估藥物在靶組織和非靶組織中的效果。此外，該研究團(tuán)隊(duì)也已經(jīng)成功地將這一可跟蹤細(xì)胞增殖的小鼠模型運(yùn)用于長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)小分子藥物在骨髓和脾臟細(xì)胞增殖過(guò)程中的效果[5-6]。

為了監(jiān)測(cè)細(xì)胞衰老和惡性轉(zhuǎn)化的早期階段，由p16INK4a蛋白編碼基因和熒光素酶報(bào)告基因組成的多種轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)被構(gòu)建出來(lái)[7-9]。p16INK4a屬于細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶的抑制蛋白，對(duì)細(xì)胞周期蛋白復(fù)合物的活性起負(fù)調(diào)控作用。除此之外，p16INK4a還可促進(jìn)細(xì)胞衰老以應(yīng)對(duì)諸如癌基因激活這樣的應(yīng)激情況。最早相關(guān)的報(bào)道是構(gòu)建了一種表達(dá)人類(lèi)完整的p16Ink4a和熒光素酶融合蛋白的GEMM[7]。隨后，Baker等[8]構(gòu)建了由2617 bp的p16INK4a蛋白編碼基因啟動(dòng)子片段調(diào)控的熒光素酶報(bào)告基因GEMM。之后又將熒光素酶基因靶向敲入到內(nèi)源性p16INK4a蛋白翻譯的起始位點(diǎn)，使熒光素酶基因位于p16INK4a蛋白編碼基因的開(kāi)放閱讀框內(nèi)，并且保留了已知的順式調(diào)節(jié)元件[9]。以上三個(gè)轉(zhuǎn)基因報(bào)告系統(tǒng)都能夠監(jiān)測(cè)衰老和腫瘤發(fā)生的早期階段。此外，熒光素酶基因敲入p16INK4a的GEMM還被用來(lái)研究環(huán)境因素對(duì)衰老的影響[10]。

2007年Ohtani等[11]建立了由p21蛋白編碼基因部分啟動(dòng)子片段調(diào)控的熒光素酶報(bào)告基因GEMM，用來(lái)檢測(cè)基因毒性應(yīng)激下細(xì)胞周期在時(shí)間和空間上的變化。在此之后，Tinkum和Mcmahon等[12-13]采用基因敲入技術(shù)，將熒光素酶置于內(nèi)源性p21蛋白編碼基因啟動(dòng)子的控制之下，從而構(gòu)建了GEMM。Tinkum等[12]還通過(guò)p53基因缺陷小鼠與該GEMM進(jìn)行雜交，證實(shí)p53是p21蛋白編碼基因的啟動(dòng)子誘導(dǎo)熒光表達(dá)所必需的。事實(shí)上，這兩組研究表明外源性和內(nèi)源性p21蛋白編碼基因的啟動(dòng)子都受到p53的調(diào)控[11-12]，這使得這兩種模型不僅能在體內(nèi)監(jiān)測(cè)p21Cip1活性，也能監(jiān)測(cè)p53的激活。

p53蛋白是細(xì)胞應(yīng)激時(shí)中止細(xì)胞周期進(jìn)程的關(guān)鍵因子。利用p53依賴性的mdm2和Puma啟動(dòng)子調(diào)控?zé)晒馑孛富?，可以?gòu)建兩種用于監(jiān)測(cè)p53轉(zhuǎn)錄活性的報(bào)告基因GEMMs[14-15]。鑒于p53在正常細(xì)胞和細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中都有著重要作用，p53報(bào)告基因GEMM也將成為幫助藥物研發(fā)領(lǐng)域研究者們預(yù)測(cè)、追蹤和表征藥物不良反應(yīng)的有力工具。

2.2 示蹤腫瘤相關(guān)炎癥和免疫反應(yīng)的小鼠模型 2002年，Carlsen等將核因子-κB(NF-κB)反應(yīng)元件插入到熒光素酶基因的上游調(diào)控區(qū)域并建立了GEMM。NF-κB轉(zhuǎn)錄因子在眾多生理和病理過(guò)程的炎癥反應(yīng)中都起著關(guān)鍵的調(diào)控作用[2，16]，這使得由NF-κB反應(yīng)元件誘導(dǎo)的熒光素酶報(bào)告基因GEMM可以作為示蹤活體內(nèi)炎癥反應(yīng)的理想工具。利用這一模型可以實(shí)現(xiàn)體內(nèi)很多組織促炎反應(yīng)和抗炎反應(yīng)的成像研究，如胰島B細(xì)胞和心臟移植、心肌梗死、大腸桿菌性乳腺炎等[2]。最近，有報(bào)道構(gòu)建過(guò)表達(dá)腫瘤壞死因子(TNF-α)和由NF-κB反應(yīng)元件驅(qū)動(dòng)熒光素酶的GEMM[17]，生物發(fā)光成像顯示過(guò)表達(dá)TNF-α可有效激活小鼠模型中NF-κB熒光素酶表達(dá)，從而為篩選靶向TNF-α/NF-κB信號(hào)通路來(lái)治療炎癥和多種自身免疫疾病的潛在藥物提供評(píng)估工具。早在2006年，Ishikawa等[18]將熒光素酶基因敲入內(nèi)源性環(huán)氧合酶2編碼基因的起始位點(diǎn)，構(gòu)建了兩種GEMM來(lái)監(jiān)測(cè)慢性和急性炎癥反應(yīng)。除此之外，也有學(xué)者利用其它參與炎癥反應(yīng)相關(guān)過(guò)程的基因，用它們的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)熒光素酶報(bào)告基因并構(gòu)建GEMM，如Smad3/4依賴性啟動(dòng)子、人IL-1β、CXCL8、nestin和NFκb2。2015年，Hayashi等[19]將熒光素酶基因整合到帶有人白細(xì)胞介素6基因序列的細(xì)菌人工染色體上，構(gòu)建了一種可以敏感地監(jiān)測(cè)炎癥反應(yīng)的GEMM。但是上述這些GEMM都是用于監(jiān)測(cè)全身各種健康或受損組織中的炎癥反應(yīng)，未能在腫瘤相關(guān)炎癥研究中發(fā)揮作用。

關(guān)于可視化腫瘤相關(guān)炎癥反應(yīng)的研究相對(duì)較少。Rauch等[20]選擇了兩種GEMM的雜交后代作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛠?lái)研究自發(fā)性淋巴瘤。兩種GEMM雜交的后代小鼠可自發(fā)產(chǎn)生白血病和淋巴瘤，利用BLI可追蹤其體內(nèi)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化相關(guān)的炎癥反應(yīng)信號(hào)，有助于研究與腫瘤發(fā)生有關(guān)的炎癥步驟。利用這一模型，該研究團(tuán)隊(duì)還證實(shí)了炎癥刺激可以引發(fā)淋巴腫瘤[21]。

盡管富有挑戰(zhàn)性，科學(xué)家們也依然在不斷努力嘗試構(gòu)建各種可視化GEMM來(lái)觀察體內(nèi)免疫反應(yīng)的相關(guān)過(guò)程。2018年，Szyska等[22]選擇活化T細(xì)胞核因子(NFAT)編碼基因啟動(dòng)子調(diào)控的螢火蟲(chóng)熒光素酶基因以及組成性啟動(dòng)子調(diào)控的海腎熒光素酶基因構(gòu)建了雙報(bào)告基因GEMM。該模型可以用來(lái)監(jiān)測(cè)腫瘤引起的T細(xì)胞激活，并進(jìn)行相關(guān)的動(dòng)態(tài)分析。利用叉狀頭/翅膀狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子P3(Foxp3)蛋白編碼基因的啟動(dòng)子控制熒光素酶和白喉毒素受體基因，從而構(gòu)建的GEMM也是一種免疫反應(yīng)的可視化模型[23]。還有一種用于免疫反應(yīng)的可視化GEMM，是利用人T細(xì)胞表面抗原CD4編碼基因連接熒光素酶報(bào)告基因構(gòu)建而成的[24]，也可以作為研究腫瘤免疫學(xué)的有力工具。

3 腫瘤細(xì)胞活體可視化研究進(jìn)展

基因工程小鼠腫瘤模型是研究腫瘤發(fā)生相關(guān)分子機(jī)制的有力工具。結(jié)合非侵入性的BLI技術(shù)，攜帶生物成像報(bào)告系統(tǒng)和人類(lèi)腫瘤的GEMM可以用來(lái)觀察特定的腫瘤細(xì)胞進(jìn)程和被標(biāo)記的分子事件，為腫瘤早期檢測(cè)以及認(rèn)識(shí)腫瘤起源、免疫系統(tǒng)作用、腫瘤血管生成、腫瘤侵襲和腫瘤治療等相關(guān)研究提供幫助。近年來(lái)，許多研究利用BLI技術(shù)監(jiān)測(cè)GEMM體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)。這些GEMM能夠模擬高死亡率腫瘤進(jìn)程，包括腦癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌和肝癌等[2，25]。

2002年，Vooijs等[25]首次構(gòu)建了腫瘤發(fā)光小鼠模型，用來(lái)研究腦垂體腫瘤的發(fā)生。他們利用攜帶條件突變型Rb蛋白等位基因的小鼠和在垂體特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下表達(dá)Cre重組酶和熒光素酶的小鼠雜交。雜交后代小鼠產(chǎn)生的垂體腫瘤攜帶熒光標(biāo)記，有助于開(kāi)發(fā)靶向Rb通路的防癌抗癌藥物。隨后，又有研究團(tuán)隊(duì)利用調(diào)控細(xì)胞周期和凋亡的相關(guān)轉(zhuǎn)錄激活因子E2F1的啟動(dòng)子-熒光素酶轉(zhuǎn)基因(Ef-Luc)小鼠與人膠質(zhì)瘤GEMM雜交，建立少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤模型，通過(guò)BLI技術(shù)實(shí)時(shí)觀察少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤的發(fā)展[26]。

采用前列腺特異性啟動(dòng)子構(gòu)建的熒光素酶GEMM可以用來(lái)監(jiān)測(cè)前列腺惡性腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移。2006年，Lyons等在誘導(dǎo)形成的小鼠前列腺增生和腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移模型的基礎(chǔ)上，利用前列腺上皮細(xì)胞特異性表達(dá)的抗原(PSA)編碼基因的啟動(dòng)子調(diào)控?zé)晒馑孛富虮磉_(dá)，實(shí)現(xiàn)了長(zhǎng)期追蹤雄激素阻斷對(duì)前列腺腫瘤生長(zhǎng)的影響[27]。同年，Seethammagari等[28]利用PSA啟動(dòng)子調(diào)控?zé)晒馑孛笜?gòu)建了可以用來(lái)監(jiān)測(cè)前列腺腫瘤發(fā)光以及腫瘤轉(zhuǎn)移的GEMM。2017年，有報(bào)道將共表達(dá)表觀遺傳調(diào)控因子的核心成分(EZH2)蛋白-熒光素酶小鼠與攜帶Probasin-Cre系統(tǒng)的小鼠雜交，獲得EZH2蛋白與熒光素酶在前列腺特異性表達(dá)的GEMM，可長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)前列腺腫瘤的生長(zhǎng)和潛在轉(zhuǎn)移[29]。

熒光素酶GEMM也為肝臟和淋巴腫瘤研究提供了新方法。2011年，Lu等[30]利用內(nèi)源性甲胎蛋白(AFP)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)胸腺嘧啶激酶和熒光素酶報(bào)告基因，構(gòu)建了基因敲入小鼠。同年，Park等[31]也報(bào)道了一種利用AFP啟動(dòng)子調(diào)控?zé)晒馑孛副磉_(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠。這兩種小鼠模型都可以通過(guò)BLI技術(shù)監(jiān)測(cè)化學(xué)誘導(dǎo)產(chǎn)生的肝癌[30-31]。還有研究者采用Cre重組酶介導(dǎo)的基因敲除技術(shù)構(gòu)建特殊的熒光素酶小鼠模型，其肝臟腫瘤中可檢測(cè)到生物發(fā)光信號(hào)[32]。通過(guò)BLI技術(shù)，也可實(shí)現(xiàn)胰腺T細(xì)胞腫瘤和B細(xì)胞淋巴瘤的無(wú)創(chuàng)監(jiān)測(cè)，觀測(cè)位于淋巴結(jié)和肝的腫瘤轉(zhuǎn)移[33-34]。

在胰管腺癌(PDAC)的基因研究和病理研究中同樣使用到了熒光素酶標(biāo)記的GEMM。Manni和他的研究團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了兩種小鼠模型，其中熒光素酶報(bào)告基因會(huì)在增殖細(xì)胞中表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)在活體內(nèi)可視化PDAC的增殖過(guò)程，為長(zhǎng)期跟蹤PDAC的發(fā)生和發(fā)展提供了直觀的可視化的研究方法[35]。

為了可視化追蹤活體腫瘤中小分子化合物，2014年Zhong等[36]利用他莫昔芬誘導(dǎo)Cre重組酶系統(tǒng)，構(gòu)建了在上皮細(xì)胞中致癌基因和熒光素酶基因共表達(dá)的口腔腫瘤小鼠模型，可用于監(jiān)測(cè)口腔腫瘤的發(fā)展，模擬臨床上小分子和圖像引導(dǎo)放射治療的反應(yīng)。

在乳腺癌可視化和活體監(jiān)測(cè)研究中，BLI技術(shù)也應(yīng)用廣泛。2012年，有報(bào)道利用MMTV啟動(dòng)子調(diào)控?zé)晒馑孛负投嗔霾《局行蚑抗原在乳腺中表達(dá)并構(gòu)建GEMM，實(shí)現(xiàn)了乳腺腫瘤進(jìn)程的可視化研究[37]。Δ16HER2基因是人表皮生長(zhǎng)因子受體2(HER-2)編碼基因的剪接變異體，在小鼠模型中采用MMTV啟動(dòng)子調(diào)控?zé)晒馑孛负挺?6HER2基因的表達(dá)，可監(jiān)測(cè)活體內(nèi)Δ16HER2基因介導(dǎo)的乳腺腫瘤的發(fā)生，探索Δ16HER2的功能[38]。此外，也有研究團(tuán)隊(duì)利用實(shí)體腫瘤往往形成乏氧微環(huán)境的特點(diǎn)，開(kāi)發(fā)出能夠?qū)Ψρ鯀^(qū)域進(jìn)行響應(yīng)成像的GEMM。隨后，利用這一小鼠模型與乳腺腫瘤轉(zhuǎn)基因小鼠雜交，實(shí)現(xiàn)在數(shù)周內(nèi)對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)進(jìn)行縱向跟蹤，評(píng)價(jià)藥物治療的效果[39]。與之同時(shí)，Jia等[40]報(bào)道了一種可監(jiān)測(cè)乳腺腫瘤早期發(fā)生過(guò)程中人源端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(TERT)編碼基因表達(dá)水平的熒光素酶GEMM。早在2003年，《Nature Medicine》上開(kāi)創(chuàng)性地報(bào)道了使用未產(chǎn)生性激素的幼鼠和去除卵巢的成年小鼠構(gòu)建的熒光素酶GEMM，該模型中熒光素酶報(bào)告基因的表達(dá)受到雌激素受體反應(yīng)元件的調(diào)控，可用于觀測(cè)雌激素受體活性在乳腺癌惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化[3]。2016年，Vantaggiato等[41]利用上述小鼠模型誘導(dǎo)散發(fā)性乳腺癌，結(jié)合BLI技術(shù)從腫瘤早期階段到觸診階段對(duì)雌激素受體的活性進(jìn)行成像追蹤。

如今，一些融合型GEMM也被應(yīng)用于BLI成像，如Vegfr3小鼠模型，這一類(lèi)小鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)入了內(nèi)源性血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體3(VEGFR3)基因啟動(dòng)子調(diào)控的EGFP-熒光素酶融合蛋白，誘發(fā)該小鼠形成乳頭狀瘤，便可跟蹤監(jiān)測(cè)乳突淋瘤誘導(dǎo)淋巴管的生成。此外，荷蘭的研究團(tuán)隊(duì)為了通過(guò)BLI技術(shù)觀測(cè)自發(fā)形成的腫瘤負(fù)荷，構(gòu)建了一種廣泛表達(dá)的條件性熒光素酶轉(zhuǎn)基因小鼠模型，隨后利用該小鼠與在肺上皮細(xì)胞中表達(dá)條件性致癌基因并可誘發(fā)非小細(xì)胞肺癌的轉(zhuǎn)基因小鼠雜交，最終實(shí)現(xiàn)了無(wú)創(chuàng)示蹤活體內(nèi)肺癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程[2]。

4 斑馬魚(yú)模型在基因表達(dá)實(shí)時(shí)成像研究中的應(yīng)用進(jìn)展

人們發(fā)現(xiàn)盡管人類(lèi)和斑馬魚(yú)的進(jìn)化分歧發(fā)生在4.5億年前，但兩者在控制信號(hào)傳導(dǎo)、增殖、分化、凋亡等相關(guān)分子信號(hào)通路上仍然高度保守。因此，在細(xì)胞培養(yǎng)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)和人類(lèi)臨床試驗(yàn)之間，也有研究采用斑馬魚(yú)模型來(lái)探索惡性疾病的治療效果。因斑馬魚(yú)胚胎具有光學(xué)透明的特性，常用綠色熒光蛋白標(biāo)記并在其整個(gè)胚胎中分析缺陷或病理表型，研究疾病的發(fā)展過(guò)程[2]。而等到斑馬魚(yú)成年后，會(huì)逐漸失去這一特性，從內(nèi)部器官發(fā)出的熒光信號(hào)會(huì)在穿透表皮時(shí)被削弱，影響觀察，使得在成年斑馬魚(yú)中檢測(cè)熒光蛋白變得比較困難。如果采用BLI技術(shù)，由于不需要外部光源，背景噪聲信號(hào)弱，熒光素酶反應(yīng)的發(fā)射光波長(zhǎng)也足以穿透成年斑馬魚(yú)的所有組織，則可以克服這一困難。

不過(guò)與小鼠模型相比，利用BLI技術(shù)構(gòu)建的熒光素酶轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)模型依然很少。2013年，Chen等[4]首次實(shí)現(xiàn)了轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)的體內(nèi)生物發(fā)光成像，其構(gòu)建的心肌細(xì)胞分化因子(cmlc2)啟動(dòng)子調(diào)控的熒光素酶斑馬魚(yú)轉(zhuǎn)基因模型還可以用來(lái)估測(cè)內(nèi)臟和心臟中的肌肉量，縱向追蹤損傷后的心臟再生。還有研究在泛素啟動(dòng)子調(diào)控?zé)晒馑孛溉沓上竦陌唏R魚(yú)轉(zhuǎn)基因模型中提取帶Luc標(biāo)記的成年斑馬魚(yú)造血干細(xì)胞，再將其移植到普通斑馬魚(yú)品系中。隨后，通過(guò)BLI技術(shù)非侵入性地跟蹤斑馬魚(yú)中移植的造血干細(xì)胞，觀察其植入和歸巢過(guò)程，從而篩選增強(qiáng)細(xì)胞歸巢能力的小分子化合物[42]。此外，利用NF-κB啟動(dòng)子片段驅(qū)動(dòng)熒光素酶和GFP蛋白編碼基因，構(gòu)建雙向報(bào)告基因斑馬魚(yú)模型，可以實(shí)現(xiàn)體內(nèi)外NF-κB轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)變化的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)[2]。目前，BLI技術(shù)主要還是應(yīng)用于斑馬魚(yú)異種移植瘤模型中，通過(guò)用熒光素酶標(biāo)記的癌細(xì)胞來(lái)跟蹤體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)，評(píng)估抗腫瘤和抗血管生成化合物的療效[43]。

5 熒光素酶成像缺點(diǎn)

如前所述，BLI在臨床前研究應(yīng)用中具備許多優(yōu)勢(shì)，但是在分析成像結(jié)果上該技術(shù)仍存在一定局限性。首先，BLI只能進(jìn)行半定量研究，無(wú)法做到絕對(duì)定量，難以規(guī)范化和標(biāo)準(zhǔn)化。生物發(fā)光信號(hào)值也并不完全與細(xì)胞數(shù)量成正比，熒光素酶與底物反應(yīng)的各個(gè)步驟都可能受到內(nèi)源性和外源性因素的影響，導(dǎo)致誤差的產(chǎn)生，甚至在不同的細(xì)胞或組織內(nèi)熒光素酶、熒光素以及ATP等輔助因子的數(shù)量都存在著差異[44]。其次，不同種熒光素酶的半衰期和穩(wěn)定性介于幾小時(shí)至幾天之間，使用分泌型熒光素酶時(shí)，血液和尿液的某些循環(huán)成分也會(huì)影響到酶的穩(wěn)定性[45]。再加上動(dòng)物體內(nèi)表達(dá)熒光素酶細(xì)胞的深度和位置都會(huì)影響B(tài)LI信號(hào)的采集，導(dǎo)致目前BLI技術(shù)的應(yīng)用僅僅局限于小型動(dòng)物。此外，底物的給藥途徑也是影響B(tài)LI成像效果的關(guān)鍵因素之一。研究發(fā)現(xiàn)靜脈和腹腔注射后底物在動(dòng)物體內(nèi)的生物分布狀態(tài)不同，靜脈注射使底物在組織間分布更均勻，而腹腔注射則可延長(zhǎng)器官攝取底物的時(shí)間[46]。

在動(dòng)物體內(nèi)，熒光信號(hào)的淬滅是由色素分子(如血紅蛋白)介導(dǎo)的，并且與信號(hào)源的深度有關(guān)。動(dòng)物的毛發(fā)和皮膚也會(huì)分散和衰減熒光信號(hào)，尤其是黑色皮毛。實(shí)驗(yàn)證實(shí)與白鼠相比，黑鼠發(fā)射出的熒光信號(hào)更低[47]。還有一點(diǎn)，雖然BLI技術(shù)由于動(dòng)物熒光背景低而具有高靈敏度，但有的底物，如腔腸素，在不存在酶的情況下其自生發(fā)出的光又會(huì)增加熒光背景[2]。

6 結(jié) 語(yǔ)

腫瘤作為一種全身性的疾病，早在一個(gè)多世紀(jì)以前就已經(jīng)被人類(lèi)關(guān)注，并開(kāi)展了廣泛的研究。近十年來(lái)，對(duì)于腫瘤發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中宿主體內(nèi)大環(huán)境的調(diào)控機(jī)制逐漸受到眾多學(xué)者的重視。例如，一些新出現(xiàn)的證據(jù)強(qiáng)調(diào)了腫瘤進(jìn)展過(guò)程中宿主體內(nèi)造血功能的時(shí)空激活和免疫反應(yīng)[48-49]。事實(shí)上，腫瘤組織和淋巴通路之間也有著極其復(fù)雜的相互作用。在管腔乳腺癌(LBC)細(xì)胞存在下的體內(nèi)環(huán)境會(huì)促進(jìn)一些原本為惰性的腫瘤細(xì)胞彌散性生長(zhǎng)。LBC還會(huì)分泌激活骨髓間充質(zhì)細(xì)胞(BMC)的細(xì)胞因子，由此產(chǎn)生的級(jí)聯(lián)反應(yīng)進(jìn)一步促進(jìn)了腺癌的生長(zhǎng)，而使用阿司匹林等抗炎化合物可以抑制BMC的激活，阻斷該級(jí)聯(lián)反應(yīng)。這些研究說(shuō)明宿主體內(nèi)系統(tǒng)大環(huán)境在腫瘤進(jìn)展中起重要作用[49]。然而，系統(tǒng)大環(huán)境與腫瘤組織靶點(diǎn)之間通路的作用方式尚未被闡明，仍有一些重要的問(wèn)題亟待解答，對(duì)這一方面的研究也需要建立一系列可以實(shí)時(shí)跟蹤腫瘤進(jìn)展的相關(guān)模型。

BLI技術(shù)與報(bào)告基因動(dòng)物模型的出現(xiàn)徹底改變了包括腫瘤在內(nèi)的生物進(jìn)程的研究方式。通過(guò)活體無(wú)創(chuàng)監(jiān)測(cè)生物發(fā)光信號(hào)，可以在目標(biāo)器官上或是整個(gè)動(dòng)物體內(nèi)實(shí)現(xiàn)生物大分子的可視化研究，實(shí)時(shí)顯示分子事件。該模型的非侵入性成像，可以幫助追蹤單個(gè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體從胚胎到成年的生理進(jìn)程事件，并進(jìn)行腫瘤進(jìn)展和藥物反應(yīng)的縱向研究，從而大大減少了每個(gè)實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)所需的動(dòng)物數(shù)量。BLI技術(shù)與報(bào)告基因動(dòng)物模型也可以呈現(xiàn)出由于個(gè)體之間的差異而導(dǎo)致的實(shí)驗(yàn)結(jié)果變化。迄今為止，BLI技術(shù)與報(bào)告基因動(dòng)物模型已經(jīng)在腫瘤基礎(chǔ)和應(yīng)用研究領(lǐng)域取得了重要成果，相信在未來(lái)它們將能夠更廣泛地應(yīng)用于腫瘤轉(zhuǎn)化、藥物開(kāi)發(fā)和毒理學(xué)等研究和應(yīng)用領(lǐng)域。