微小RNA-10a聯(lián)合甲胎蛋白、糖類抗原50、糖類抗原19-9檢測在結(jié)直腸腺癌早期診斷中的價(jià)值

趙 旭，仝 聰，李 毅，閻立昆

(陜西省人民醫(yī)院普外一科，陜西 西安 710068)

結(jié)直腸癌為消化系統(tǒng)常見惡性腫瘤，以腺癌居多。近年研究[1]發(fā)現(xiàn)，隨著我國人民生活方式及飲食習(xí)慣的改變，結(jié)直腸腺癌患病率呈逐年升高趨勢。結(jié)直腸腺癌預(yù)后與病理分期密切相關(guān)，流行病學(xué)調(diào)查[2]顯示，早期結(jié)直腸腺癌可治愈，5年生存率高達(dá)90%，晚期結(jié)直腸腺癌5年生存率不足10%，故及時(shí)診斷早期結(jié)直腸腺癌有其必要性。目前，診斷結(jié)直腸腺癌的金標(biāo)準(zhǔn)仍為病理學(xué)檢查，但該方法為有創(chuàng)性操作，不能作為篩查項(xiàng)目在臨床普及[3]。血清腫瘤標(biāo)志物在近年惡性腫瘤篩查中發(fā)揮了重要作用，其中甲胎蛋白(Alpha fetoprotein，AFP)、糖類抗原50(Carbohydrate antigen 50，CA50)、糖類抗原19-9(Carbohydrate antigen 19-9，CA199)等均與消化道惡性腫瘤發(fā)生和發(fā)展相關(guān)，但也缺乏足夠的靈敏度及特異度[4]。微小RNA(microRNA)是一種非編碼RNA，可調(diào)控細(xì)胞生長、增殖、分化及凋亡。microRNA-10a為microRNA家族中的一種，有研究[5]指出其在消化系統(tǒng)惡性腫瘤中高表達(dá)，且參與腫瘤的發(fā)生及發(fā)展。但目前microRNA-10a與消化系統(tǒng)惡性腫瘤的關(guān)系多集中于體外實(shí)驗(yàn)，是否能作為早期結(jié)直腸腺癌的篩查指標(biāo)則較少報(bào)道?；诖?，本研究對(duì)早期結(jié)直腸腺癌患者和結(jié)直腸良性病變者的臨床資料進(jìn)行比較，評(píng)估上述指標(biāo)及其聯(lián)合檢測對(duì)早期結(jié)直腸腺癌的診斷價(jià)值。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 回顧性分析2017年1月至2020年1月我院收治的108例早期結(jié)直腸腺癌患者臨床資料(結(jié)直腸腺癌組)。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)病理學(xué)確診，且分期符合《中國早期結(jié)直腸癌及癌前病變篩查與診治共識(shí)意見》[6]制定的早期標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他惡性腫瘤；既往有放化療等抗腫瘤治療史；伴免疫系統(tǒng)疾病、血液系統(tǒng)疾病或急慢性感染。經(jīng)傾向性得分匹配法收集與結(jié)直腸腺癌組性別、年齡、病變部位1∶1匹配的108例結(jié)直腸良性病變者臨床資料(良性組)。良性組與結(jié)直腸腺癌組排除標(biāo)準(zhǔn)一致。

1.2 檢測方法 收集兩組患者入院次日清晨空腹靜脈血5 ml，經(jīng)3000 r/min離心10 min，獲得血清樣本。向500 μl血清標(biāo)本中加入等體積裂解液MZ(批號(hào)：161119、190128，德國QIAGEN公司)，經(jīng)渦旋震蕩、靜置、離心、水相轉(zhuǎn)移等操作后，提取血清RNA，采用Nanodrop超微量分光光度計(jì)(美國Thermo Scientific公司)檢測230、260、280 nm處吸光度，在OD260/OD280為1.8～2.0且OD260/OD230>2.0時(shí)視為提取RNA成功，不符合要求者重新取樣檢測。采用基于莖-環(huán)引物的實(shí)時(shí)定量PCR(Stem-Loop RT-qPCR)法引入靶向特異性反轉(zhuǎn)錄物，引物序列為5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTGCACTGGATACGACCAC-

AAATT-3’，該反轉(zhuǎn)錄引物與成熟microRNA結(jié)合形成復(fù)合體，并向microRNA 5’末端延伸，獲得較長的反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增子，接著行RT-PCR，正向引物序列為5’-TGCGGTACCCTGTAGATCCG-3’，反向引物序列為5’-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3’，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性15 s，65 ℃退火15 s，72 ℃延伸32 s，共40個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min，溶解曲線分析溫度為60～95 ℃。采用相對(duì)法定量分析microRNA-10a表達(dá)水平，試劑由日本TAKARA BIO公司生產(chǎn)，儀器購自美國Bio- Rad公司。采用電化學(xué)發(fā)光法檢測血清AFP、CA50、CA199水平，試劑盒儀器均購自德國羅氏公司。

2 結(jié) 果

2.1 兩組患者一般資料比較 見表1。兩組患者性別、年齡、病變部位比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。

表1 兩組患者一般資料比較

2.2 兩組患者血清microRNA-10a、AFP、CA50、CA199水平比較 見表2。結(jié)直腸腺癌組血清microRNA-10a、 AFP、CA50、CA199水平顯著高于良性組(均P<0.05)。

表2 兩組患者血清microRNA-10a、AFP、CA50、CA199水平比較

2.3 血清microRNA-10a、AFP、CA50、CA199及其聯(lián)合檢測對(duì)早期結(jié)直腸腺癌診斷價(jià)值分析 見表3(圖1)。經(jīng)ROC曲線分析，血清microRNA-10a、AFP、CA50、CA199對(duì)早期結(jié)直腸腺癌均有較高診斷價(jià)值，且四項(xiàng)聯(lián)合檢測診斷價(jià)值更高。

表3 血清microRNA-10a、AFP、CA50、CA199及其聯(lián)合檢測對(duì)早期結(jié)直腸腺癌診斷價(jià)值

圖1 血清microRNA-10a、AFP、CA50、CA199及其聯(lián)合檢測診斷早期結(jié)直腸腺癌ROC曲線

3 討 論

惡性腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)對(duì)提升治愈率及生存率至關(guān)重要，腫瘤早期篩查工作也在臨床逐漸開展[7]。血清腫瘤標(biāo)志物具有檢測簡便、普及度較高等優(yōu)點(diǎn)，成為腫瘤早期篩查的主要檢測項(xiàng)目[8]。其中，AFP為肝臟合成分泌的糖蛋白，是原發(fā)性肝癌的公認(rèn)標(biāo)志物[9]。近年研究[10]也發(fā)現(xiàn)，AFP在頭頸部、消化道惡性腫瘤中高表達(dá)，對(duì)輔助診斷其他惡性腫瘤也有利。CA50也是一種廣譜腫瘤標(biāo)志物，在糖基化酶被激活、細(xì)胞表面糖基結(jié)構(gòu)改變時(shí)生成，可高表達(dá)于結(jié)直腸癌等消化道惡性腫瘤[11]。CA199為黏蛋白型糖類蛋白腫瘤標(biāo)志物，對(duì)腺癌敏感，在胰腺癌、結(jié)直腸癌中均高表達(dá)[12]。本研究也發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸腺癌組血清AFP、CA50、CA199水平均顯著高于良性組，提示血清AFP、CA50、CA199對(duì)輔助診斷早期結(jié)直腸腺癌有利。不僅如此，血清AFP、CA50、CA199對(duì)早期結(jié)直腸腺癌均有較高診斷價(jià)值，其截?cái)嘀捣謩e為6.74 ng/ml、23.80 U/ml、27.80 U/ml，也表明3項(xiàng)腫瘤標(biāo)志物可用于早期結(jié)直腸腺癌的臨床篩查。需要注意的是，AFP、CA50、CA199檢測值還受檢測方法及試劑廠家等因素的影響，上述截?cái)嘀祪H供臨床參考。此外，上述廣譜腫瘤標(biāo)志物在篩查結(jié)直腸腺癌的靈敏度及特異度仍不高，還需與其他標(biāo)志物聯(lián)合檢測，以提高診斷價(jià)值[13]。

microRNA為非編碼RNA，在RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體的引導(dǎo)下可對(duì)靶mRNA進(jìn)行降解或翻譯抑制，發(fā)揮對(duì)靶基因表達(dá)的調(diào)控作用，參與細(xì)胞生長、增殖、分化、凋亡等一系列生理病理過程，故microRNA表達(dá)水平的失?？烧T發(fā)腫瘤等疾病[14]。Chen等[15]指出，異常表達(dá)的microRNA可經(jīng)細(xì)胞周期、程序性細(xì)胞死亡、侵襲及血管生成等反應(yīng)，調(diào)控腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移。因此，microRNA的表達(dá)水平在惡性腫瘤診斷、治療及預(yù)后判斷中的應(yīng)用效果成為國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)[16-17]。microRNA-10a為近年發(fā)現(xiàn)的在原發(fā)性肝癌、膀胱癌等惡性腫瘤中表達(dá)異常的一種microRNA，可參與造血細(xì)胞分化及腫瘤細(xì)胞發(fā)生發(fā)展、免疫調(diào)節(jié)等生理病理過程[18]。Luo等[19]也指出，可能受作用基因位點(diǎn)或信號(hào)傳導(dǎo)途徑不同等因素影響，microRNA-10a在不同惡性腫瘤中表達(dá)水平不一，可作為多種惡性腫瘤篩查的敏感指標(biāo)。研究[20]發(fā)現(xiàn)，microRNA-10a在急性髓樣白血病中高表達(dá)，但在慢性髓樣白血病中低表達(dá)，并通過調(diào)控粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子2的分泌加速細(xì)胞增殖。Yan等[21]研究發(fā)現(xiàn)，microRNA-10a在膀胱癌、胰腺癌中高表達(dá)，在食管癌、乳腺癌中低表達(dá)，因此microRNA-10a在各惡性腫瘤中發(fā)揮的效應(yīng)不同。然而，低于microRNA-10a在結(jié)直腸癌中的表達(dá)水平，相關(guān)報(bào)道較少。對(duì)此，本研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸腺癌組血清microRNA-10a表達(dá)水平顯著高于良性組，且血清microRNA-10a對(duì)早期結(jié)直腸腺癌有較高診斷價(jià)值。這也說明，通過Stem-Loop RT-qPCR技術(shù)檢測血清microRNA-10a相對(duì)表達(dá)量能輔助篩查早期結(jié)直腸腺癌。然而，Stem-Loop RT-qPCR技術(shù)要求較高，且對(duì)提取的RNA質(zhì)量有要求，基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)尚無此檢測項(xiàng)目，在臨床推廣及普及度方面不及上述廣譜腫瘤標(biāo)志物，也是microRNA-10a作為篩查指標(biāo)的缺陷[22-23]。本研究還發(fā)現(xiàn)，血清microRNA-10a與AFP、CA50、CA199聯(lián)合檢測對(duì)早期結(jié)直腸腺癌診斷價(jià)值更高，提示結(jié)直腸腺癌的發(fā)生、發(fā)展與多條信號(hào)通路相關(guān)，單一血清學(xué)檢測在判斷早期結(jié)直腸腺癌時(shí)仍然存在不足，應(yīng)結(jié)合多項(xiàng)指標(biāo)共同評(píng)估，以避免漏診，提高診斷準(zhǔn)確率，盡可能地篩查出早期結(jié)直腸腺癌患者。Liu等[24]還發(fā)現(xiàn)，microRNA-10a表達(dá)量與惡性腫瘤惡性程度關(guān)系密切，其表達(dá)量與食管鱗狀細(xì)胞癌分化程度具有顯著相關(guān)性，對(duì)預(yù)測患者預(yù)后有利，故推測microRNA-10a表達(dá)量可能還與結(jié)直腸腺癌臨床特征有關(guān)。

綜上所述，血清microRNA-10a及腫瘤標(biāo)志物AFP、CA50、CA199均能輔助臨床診斷早期結(jié)直腸腺癌，但四項(xiàng)聯(lián)合檢測診斷價(jià)值更高，有望納入直腸腺癌的常規(guī)篩查項(xiàng)目。但由于本研究為回顧性分析，收集資料有限，僅納入了早期結(jié)直腸腺癌患者，為評(píng)估m(xù)icroRNA-10a表達(dá)水平與結(jié)直腸腺癌分期、分化程度等臨床特征的關(guān)系，還需后續(xù)采用大樣本量進(jìn)一步分析。