骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療骨科疾病研究進(jìn)展

梁朝鑫,周安遠(yuǎn),王 偉,周 游,戈 超,高莉鵬, 李興勇,張 琨,雷 云,楊 淵

(1．廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧530200；2．廣西醫(yī)科大學(xué)，廣西 南寧530021； 3．廣西骨傷醫(yī)院，廣西 南寧530012；4．廣西醫(yī)大開元埌東醫(yī)院，廣西 南寧530028)

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是一種具有良好的多向分化和自我更新能力的多能干細(xì)胞。在1976年Friedenstein等[1]首次從骨髓中提取出BMSCs。由于其具有取材方便且易于分離培養(yǎng)、擴(kuò)增等特點(diǎn)，使其在骨與軟組織治療方面起到了日益廣泛的作用。近年來，有關(guān)BMSCs的研究得到了擴(kuò)展，特別在治療骨科疾病方面中的應(yīng)用越來越廣泛，由于其發(fā)揮的臨床效果顯著，目前已用于多種骨科疾病的替代療法。本文結(jié)合近年國內(nèi)外BMSCs的相關(guān)臨床研究，就BMSCs的分離與鑒定、生物特性，及其對骨缺損、股骨頭壞死、骨關(guān)節(jié)炎、脊髓損傷、修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨和椎間盤等方面的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，旨在為臨床治療骨科疾病提供參考。

1 BMSCs的分離方法與鑒定

目前，對于BMSCs體外分離培養(yǎng)的方法主要有全骨髓貼壁法、密度梯度離心法、免疫磁珠法、組織消化法等，每種方法都存在各自的優(yōu)劣。迄今為止，常用的方法是密度梯度離心法[2]。密度梯度離心法是依據(jù)顆粒的不同密度和直徑引起的沉降速度的不同，在離心作用下各顆粒以一定的速度沉降，進(jìn)而在不同的密度梯度區(qū)域上形成區(qū)帶的原理，分離出不同密度的細(xì)胞[3]。有研究顯示，密度梯度離心法能夠有效分離出BMSCs，并發(fā)現(xiàn)密度在1.067～1.070 g/ml之間的介質(zhì)分離出的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞明顯增多，因此在使用不同密度的介質(zhì)進(jìn)行分離具有重要意義[4]。此方法具有操作簡便、耗費(fèi)低廉等的優(yōu)勢，可在選擇合適的密度介質(zhì)后進(jìn)行分離更容易獲得較高純度BMSCs。

由于BMSCs缺乏特異性表面標(biāo)志物，目前對于BMSCs的鑒定方法尚未得到統(tǒng)一，最常用的方法是使用流式細(xì)胞術(shù)對其進(jìn)行鑒定。流式細(xì)胞術(shù)鑒定發(fā)現(xiàn)BMSCs對CD44、CD73、CD90表面標(biāo)志物表達(dá)陽性，且陽性率均達(dá)到90%以上，而造血干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD34、CD45表達(dá)陰性[5]。流式細(xì)胞術(shù)具有靈敏度高、精度高、多參數(shù)等特點(diǎn)，因此應(yīng)用在BMSCs鑒定方面得到了進(jìn)一步推廣。

2 BMSCs的生物學(xué)特性

BMSCs可在自身中提取，取材方便且來源充足，由于其具有多向分化和自我增殖的特點(diǎn)，大量研究證明BMSCs有向成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等方向分化的潛能。骨科疾病的治療中，BMSCs發(fā)揮出了自身的特性，給在臨床上骨與軟組織的修復(fù)帶來更佳的治療方式。BMSCs在骨與組織修復(fù)中的主要特性：①BMSCs具有強(qiáng)大的增殖能力和多向分化的特性：在適宜的體內(nèi)或體外環(huán)境下，BMSCs有向成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞等多種細(xì)胞分化的能力[6-7]。②BMSCs具有分泌多種內(nèi)分泌因子的潛能：產(chǎn)生的內(nèi)分泌因子參與到組織中的增殖、凋亡、免疫調(diào)節(jié)和血管生成等過程中，促進(jìn)損傷區(qū)域的恢復(fù)，引起免疫系統(tǒng)的反應(yīng)，從而起到保護(hù)其他細(xì)胞免于凋亡的作用[8]。

3 BMSCs在治療骨科疾病的應(yīng)用

隨著近年來許多研究顯示出BMSCs的治療優(yōu)勢，結(jié)合其獨(dú)特的生物學(xué)特性，越來越多的研究者將其運(yùn)用到治療骨科疾病過程中。在基礎(chǔ)和臨床研究中運(yùn)用BMSCs治療骨缺損、股骨頭壞死、骨關(guān)節(jié)炎、脊髓損傷及修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨和椎間盤等方面獲得了廣泛重視，并廣泛運(yùn)用在各種組織修復(fù)和再生醫(yī)學(xué)的臨床決策中。對此，國內(nèi)外對使用BMSCs治療骨與軟組織損傷做了大量的研究。

3.1 治療骨缺損 由骨折或骨腫瘤切除等因素引起的骨缺損一直是創(chuàng)傷骨科面臨的重大難題，常使用自體骨移植或骨搬運(yùn)術(shù)的方式治療。因?yàn)橹补切g(shù)可用的骨量有限，而骨搬運(yùn)術(shù)又需要很長的時間來治療，因此需要利用BMSCs分化為成骨細(xì)胞的能力，以達(dá)到治療骨缺損的目的[9]。研究顯示，BMSCs可以成功誘導(dǎo)新骨的形成，并且具有良好的安全性[10]。一項研究發(fā)現(xiàn)共同培養(yǎng)的BMSCs和內(nèi)皮祖細(xì)胞不僅加速骨缺損的修復(fù)，還促進(jìn)了支架上血管和骨骼的形成[11]。BMSCs可能顯著提高了骨誘導(dǎo)支架的骨再生能力[12]。Lawrence等[13]通過研究分析了各種支架材料的細(xì)胞整合、活力和獲得的BMSCs的分化能力對治療骨缺損療效，發(fā)現(xiàn)BMSCs對頭部組織和骨科再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域產(chǎn)生積極影響。Dina等在36只雙下肢脛骨缺損的大鼠中，各在左脛骨缺損接受富含血小板的纖維蛋白(PRF)，右脛骨接受加載在殼聚糖支架上的BMSCs，結(jié)果顯示BMSCs和PRF雖都能有效治愈大鼠脛骨模型中誘導(dǎo)的骨缺損，但BMSCs的愈合效果更佳，在所有時間點(diǎn)都表現(xiàn)出比PRF更高的平均鈣和磷重量百分比。一項隨機(jī)對照實(shí)驗(yàn)將絲素蛋白/殼聚糖/納米羥基磷灰石(SF/CS/nHA)和BMSCs三維支架修復(fù)兔長節(jié)段性骨缺損，發(fā)現(xiàn)載有BMSCs的SF/CS/nHA支架在修復(fù)橈骨節(jié)段性缺損取得很好的治療效果，均優(yōu)于其他治療組[14]。雖然擁有大量將BMSCs運(yùn)用在治療骨缺損的基礎(chǔ)研究，并且大多取得良好的療效，但在臨床上運(yùn)用BMSCs治療骨缺損的研究數(shù)量和研究樣本量仍需要進(jìn)一步擴(kuò)大，以更好的證實(shí)BMSCs的治療機(jī)制。

3.2 治療股骨頭壞死 股骨頭壞死是一種發(fā)病機(jī)制不明確、病因復(fù)雜的進(jìn)行性疾病，常導(dǎo)致髖部疼痛和功能障礙，其發(fā)病的原因可分為創(chuàng)傷性與非創(chuàng)傷性，創(chuàng)傷性股骨頭壞死一般由于外力作用使傳送營養(yǎng)到股骨頭的血管遭到破壞，非創(chuàng)傷性股骨頭壞死常見大量使用激素或長期飲酒導(dǎo)致血液循環(huán)受阻而發(fā)病。一項將BMSCs和內(nèi)皮祖細(xì)胞聯(lián)合移植治療類固醇誘導(dǎo)的兔股骨頭壞死的研究中顯示，3D支架中聯(lián)合移植BMSCs和內(nèi)皮祖細(xì)胞促進(jìn)了成骨和血管生成同時減少脂肪生成，達(dá)到修復(fù)股骨頭壞死的效果[15]。Mardones等[16]通過核心減壓和植入BMSCs治療股骨頭壞死，隨訪19～54個月后，發(fā)現(xiàn)所有患者的疼痛強(qiáng)度均明顯減輕，且髖關(guān)節(jié)功能得到明顯改善。一項臨床隨機(jī)對照研究，將100例患者隨機(jī)分配為BMSCs治療或核心減壓治療,術(shù)后60個月，53例接受BMSCs治療的髖關(guān)節(jié)中只有2例病情加重并接受血管化骨移植，而核心減壓治療除去失訪的7例患者，在治療的44個髖關(guān)節(jié)中出現(xiàn)了10個髖關(guān)節(jié)病情加重，后期均行血管化植骨或全髖關(guān)節(jié)置換術(shù)治療，證實(shí)了BMSCs在治療股骨頭壞死方面有效地延遲或避免了進(jìn)行髖關(guān)節(jié)置換[17]。一項納入了14項研究，涉及540例患者的薈萃分析顯示，髓芯減壓聯(lián)合自體BMSCs具有更好的鎮(zhèn)痛作用和臨床療效，并可更有效地延緩股骨頭塌陷[18]。通過既往大量的基礎(chǔ)和臨床試驗(yàn)使用BMSCs運(yùn)用在治療股骨頭壞死的研究，又隨著近些年臨床治療數(shù)量的不斷增加和臨床上的可靠療效，值得相信BMSCs是治療股骨頭壞死的有效方法。但其在臨床的應(yīng)用也面臨著諸多挑戰(zhàn)，如患者的選擇、標(biāo)準(zhǔn)化程序、安全性評估以及移植細(xì)胞的生長情況等[19]。所以未來仍需做進(jìn)一步探索，尋找解決最適宜的移植方法、移植細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞來源等問題，從而更好地在臨床上應(yīng)用BMSCs治療股骨頭壞死。

3.3 治療骨關(guān)節(jié)炎 骨關(guān)節(jié)炎是一種隨著年齡的增長，患病率隨之增長的退行性疾病，可由創(chuàng)傷、遺傳、發(fā)育等因素誘發(fā)。研究[20]表明，關(guān)節(jié)內(nèi)注射BMSCs明顯改善了患者的疼痛、功能和生活質(zhì)量，可有效治療膝骨關(guān)節(jié)炎。一項臨床隨機(jī)對照研究，將30例膝骨性關(guān)節(jié)炎患者隨機(jī)分配，對照組予以關(guān)節(jié)內(nèi)注射透明質(zhì)酸，兩個治療組分別予以透明質(zhì)酸與10×106或100×106培養(yǎng)的自體BMSCs,通過隨訪12個月發(fā)現(xiàn)使用BMSCs的治療組在VAS和WOMAC評分均優(yōu)于對照組，驗(yàn)證了關(guān)節(jié)內(nèi)注射BMSCs是改善膝骨關(guān)節(jié)炎功能安全可行的方法[21]。Chahal等[22]發(fā)現(xiàn)BMSCs在治療膝骨關(guān)節(jié)炎同時可減少滑膜炎和軟骨退化的發(fā)生。雖然有諸多的研究支持BMSCs在治療膝骨關(guān)節(jié)炎的有效性，但對于注射的最佳方式與位置仍存在疑慮。對此，Hernigou等[23]將60例雙側(cè)膝骨關(guān)節(jié)炎患者予以左右膝分別在軟骨下骨或關(guān)節(jié)內(nèi)注射BMSCs，通過兩年的隨訪發(fā)現(xiàn)對于軟骨下骨治療組的60個膝關(guān)節(jié)中有12(20%)例接受了關(guān)節(jié)置換術(shù)，而關(guān)節(jié)內(nèi)治療組的60個膝關(guān)節(jié)中有42(70%)例選擇了關(guān)節(jié)置換術(shù)，表明了在膝關(guān)節(jié)軟骨下骨植入BMSCs的療效更好，且更有效地推遲關(guān)節(jié)置換術(shù)的發(fā)生。當(dāng)前，BMSCs治療骨關(guān)節(jié)炎的研究，已從基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)慢慢向臨床研究過渡，值得肯定的是其在治療膝骨關(guān)節(jié)炎發(fā)揮了良好的療效，但對于臨床上骨關(guān)節(jié)炎分期的治療、治療效果的持久性和不同體質(zhì)的適應(yīng)性等問題仍需進(jìn)一步研究和思考。

3.4 治療脊髓損傷 脊髓損傷是一種發(fā)病率高、致死致殘率高的疾病。它可由挫傷、割傷、壓迫或直接的暴力破壞等創(chuàng)傷因素引起的，并且破壞了神經(jīng)元通路[24]。目前，急性脊髓損傷的治療方式主要有藥物治療和手術(shù)減壓，隨著對BMSCs研究不斷深入，用于治療脊髓損傷的研究也日益增加。一項采用左T9脊髓半切術(shù)建立大鼠脊髓損傷模型的研究顯示，BMSCs與堿性成纖維細(xì)胞生長因子聯(lián)合移植可有效修復(fù)大鼠脊髓損傷[25]。Wang等[26]發(fā)現(xiàn)BMSCs可能通過調(diào)節(jié)抗氧化信號通路，進(jìn)而過表達(dá)的miR-200a或si-Keap1的促進(jìn)了大鼠脊髓損傷后運(yùn)動功能的恢復(fù)，同時降低丙二醛(MDA)水平，增加超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)活性和核因子E-2-相關(guān)因子2(Nrf2)表達(dá)及其下游血紅素加氧酶1(HO-1)、NADPH醌氧化還原酶(NQO1)、谷氨酸半胱氨酸連接酶催化亞基(GCLC)蛋白表達(dá)。研究[27]發(fā)現(xiàn)，BMSCs衍生的外泌體可通過激活自噬，減弱神經(jīng)元凋亡，促進(jìn)脊髓損傷的大鼠功能行為的恢復(fù)。Mo等[28]采用Allen沖擊器建立T10脊髓損傷模型中，實(shí)驗(yàn)組和對照組分別在蛛網(wǎng)膜下腔以注射方式給予BMSCs和PBS，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組Nestin和NeuN表達(dá)明顯升高，GFAP表達(dá)明顯降低，實(shí)驗(yàn)組的神經(jīng)營養(yǎng)因子水平高于對照組，表明了BMSCs可通過調(diào)節(jié)移植的細(xì)胞因子，提高神經(jīng)細(xì)胞的存活和再生能力，并促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)。對此，BMSCs促進(jìn)脊髓損傷功能恢復(fù)的作用機(jī)制可能與其的神經(jīng)營養(yǎng)、免疫抑制、代替功能和促進(jìn)軸突再生有關(guān)[29]。因此認(rèn)為BMSCs可改善脊髓損傷癥狀，促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)。

3.5 修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨與椎間盤 關(guān)節(jié)軟骨的損傷可導(dǎo)致關(guān)節(jié)疼痛、畸形和功能障礙，由于軟骨缺乏神經(jīng)和血管，所以當(dāng)軟骨損傷時自身的自愈能力非常有限。劉軍政等[30]發(fā)現(xiàn)高表達(dá)的miR-193b、miR-34a、miR-30a、miR-130b、miR-152、miR-99a、miR-90a和低表達(dá)的miR-424、miR-135共同參與了大鼠BMSCs軟骨分化的調(diào)節(jié)過程。而人體中的miRNA比大鼠要復(fù)雜，且相互之間也有相互調(diào)節(jié)的能力。研究[31]發(fā)現(xiàn)，BMSCs在體內(nèi)植入時具有形成骨和軟骨組織的能力。Araki等[32]在18只獼猴的36個膝關(guān)節(jié)中造模成膝關(guān)節(jié)全層骨軟骨缺損，隨機(jī)分為不予藥物的干預(yù)空白組、僅植入膠原凝膠的凝膠組和植入含有BMSCs 的膠原凝膠的BMSCs組，24周后結(jié)果顯示，凝膠組雖顯示出大部分富含軟骨的修復(fù)組織覆蓋缺損，而BMSCs組盡管產(chǎn)生的新軟骨量較少，但軟骨表面規(guī)則且質(zhì)量更好，與鄰近的軟骨無縫整合，并重建了軟骨下骨。一項使用源于BMSCs的三維無支架自體構(gòu)建體植入兔膝關(guān)節(jié)的骨軟骨缺損處的研究，在1年內(nèi)實(shí)現(xiàn)了骨和軟骨同步再生，同時證明了此方法具有修復(fù)骨和軟骨缺損的潛力[33]。由于BMCSs移植在修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損方面的有用性已在基礎(chǔ)研究的猴和兔的模型中得到證實(shí)，對此在臨床上也做了這方面的研究。在一項臨床研究[34]中通過同種異體的BMSCs與自體軟骨細(xì)胞的組合，以刺激組織的再生，并顯著改善了患者膝關(guān)節(jié)癥狀和軟骨缺損的狀態(tài)。Yong等[35]在一項含有80例接受軟骨修復(fù)手術(shù)和伴隨高位脛骨截骨術(shù)的患者的臨床研究中，比較了單獨(dú)植入BMSCs的MSC組和與同種異體軟骨一起植入BMSCs的MSC-AC組的效果，通過MSC組平均27.3個月和MSC-AC組平均27.8個月的最終隨訪顯示MSC-AC組在軟骨再生方面優(yōu)于MSC 組，并具有更好的臨床效果。因此，對于BMSCs在修復(fù)軟骨方面的應(yīng)用，可認(rèn)為配合BMSCs的植入可能會取得更佳的療效。

椎間盤退變是一種常見的疾病。研究[36]發(fā)現(xiàn)，將自體BMSCs注射到髓核區(qū)具有可行性和安全性，并明顯緩解了疼痛和改善生活質(zhì)量。BMSCs可以通過激活A(yù)KT和ERK信號來減弱內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，且防止髓核細(xì)胞死亡并改善了椎間盤退變[37]。Pettine等[38]通過分析了大約1mlBMSCs的總有核細(xì)胞(TNC)含量、集落形成單位-成纖維細(xì)胞(CFU-F)頻率、分化潛能和表型特征發(fā)現(xiàn)雖然通過BMSCs治療后患者的癥狀均得到了不同程度的緩解，但接受超過2000 CFU-F/ml的患者的殘疾指數(shù)(ODI)和視覺模擬量表(VAS)降低速度更快，幅度更大。相對于自體BMSCs注射治療，Noriega等[39]將24 例診斷為腰椎間盤退變且對保守治療效果不佳的慢性背痛患者隨機(jī)分為兩組，實(shí)驗(yàn)組在局麻下通過椎間盤內(nèi)注射同種異體BMSCs，而對照組接受麻醉劑對椎旁肌肉組織的假浸潤，實(shí)驗(yàn)組在BMSCs移植后3個月，VAS和ODI均顯著減輕，并在6個月和12個月時保持改善，且在所有時間點(diǎn)均優(yōu)于對照組，進(jìn)以證明了同種異體BMSCs可能是治療退行性椎間盤疾病的有效替代方法，并且比自體BMSCs治療更方便，具有可行性與安全性。不管是自體BMSCs還是同種異體BMSCs，在修復(fù)椎間盤退變中均顯示出積極的作用，可減輕患者的疼痛、降低殘疾率。

4 結(jié) 語

綜上所述，目前BMSCs在骨科領(lǐng)域的研究越來越受重視，但在臨床方面的應(yīng)用仍相對較少。由于BMSCs獲取方便且安全性高，其具有的多向分化和分泌內(nèi)分泌因子的潛能，使其在治療骨科疾病中取得顯著的療效，這為骨科醫(yī)生提供了一個良好的治療方案。但其在骨缺損、股骨頭壞死等方面的作用機(jī)制尚未明確，對移植的細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞來源的不同、載體的選擇等問題導(dǎo)致療效的不確定性仍未解決。雖然在基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)中擁有大量的研究表明BMSCs對骨與軟組織損傷治療中發(fā)揮可靠的作用，但還需要在大型動物模型和臨床中進(jìn)一步研究也需要更長的隨訪時間，對BMSCs的治療進(jìn)行評估和優(yōu)化以確定其的作用機(jī)制。隨著再生醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展，我們可以相信BMSCs未來能夠在骨與軟組織損傷疾病為人們提供更多的選擇和幫助，推動骨與軟組織損傷治療水平的發(fā)展。