三明治肝細胞培養(yǎng)模型及其在中藥肝毒性評價中的應用△

唐茵茹，黃芝瑛，汪祺，文海若，馬雙成

1.中山大學 藥學院，廣東 廣州 510006；2.中國食品藥品檢定研究院，北京 100050

中藥在我國的使用歷史可以追溯到幾千年前，現(xiàn)今仍然被廣泛用于臨床治療。國務院辦公廳于2019 年發(fā)布《關于促進中醫(yī)藥傳承創(chuàng)新發(fā)展的意見》，從國家層面扶持和促進中醫(yī)藥行業(yè)的傳承與發(fā)展。可以預見中藥的研究及應用規(guī)模將進一步擴大。與此同時，越來越多的中藥被報道具有潛在的肝毒性，引起社會廣泛重視。其中，藥物引起的肝臟損傷是新藥臨床試驗和上市后被撤回的主要原因之一，因此在藥物研發(fā)階段檢測和評估藥物的肝毒性一直是制藥行業(yè)和監(jiān)管機構重點關注的問題[1]。研究數(shù)據(jù)表明，2012—2014 年我國發(fā)生的藥源性肝損傷事件中有26.81%是由中藥引起[2]。其毒性機制包括氧化應激、線粒體損傷和凋亡、膽汁淤積、脂肪變性、產(chǎn)生毒性代謝產(chǎn)物等。此外，藥物間相互作用也是導致肝臟損傷的重要原因。例如，黃芩中的吡啶生物堿和二萜類成分就是典型的通過肝細胞色素P450（CYP）3A4 代謝產(chǎn)生的肝毒素，可通過上調(diào)CYP3A4 活性加劇不良反應[3]。此外，麻黃、雷公藤、何首烏、川楝子、補骨脂、半夏等都是常見的具有肝毒性的中藥[4]。因此，在中藥的開發(fā)與研究過程中，明確其不良反應及機制并探索安全劑量，從而增強中藥使用的安全性，將有助于中醫(yī)藥事業(yè)的傳承與發(fā)展，有利于中醫(yī)藥獲得國際的認可。

目前公認的藥物臨床前安全性評價是以實驗動物模型為主，然而整體動物實驗大多耗時長且費用較高。自1980 年起，為提高動物福利，歐洲多國先后頒布動物保護法，提倡實行“3R”原則，即替代（replacement）、減少（reduction）和優(yōu)化（refinement），減少實驗動物的使用[5]。這也推進了許多體外毒理學預測模型的開發(fā)和應用。中藥具有多成分、多靶點、多效用的特點，不同成分間可能存在相互作用，其引起肝臟損傷所涉及的靶點主要包括代謝酶、核受體、轉(zhuǎn)運蛋白、活性氧（ROS）/核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）等介導的信號通路，給中藥肝毒性及安全性評價造成諸多困難[4]。因此，建立能高效篩選中藥中肝毒性成分和評價中藥對肝細胞綜合作用的體外模型尤為重要。其中，三明治肝細胞培養(yǎng)（sandwich-cultured hepatocytes，SCH）模型是當前應用較為廣泛的研究藥物肝膽轉(zhuǎn)運和膽汁淤積的體外模型。該模型將肝細胞置于2 層膠原中，以三明治夾心的結構進行培養(yǎng)，能達到模擬體內(nèi)生長條件、重建肝細胞極性的目的。Dunn 等[6]研究表明，SCH 模型中大鼠原代肝細胞的細胞形態(tài)和白蛋白分泌功能可維持42 d。本文將對SCH 模型培養(yǎng)的特點、方法及近年來其在中藥肝毒性評價中的應用進行綜述，并就其與其他體外肝毒性評價模型相比較的優(yōu)勢、不足及今后改良的方向進行探討。

1 SCH模型的特點

肝細胞是有6～8個面的多角形細胞，其中每個肝細胞表面均由膽管側膜面、血竇面和肝細胞面3個功能面組成[7]。研究表明，SCH模型能較長時間地保持肝細胞的形態(tài)和活力、重建肝細胞的極性、模擬肝臟的結構和功能。SCH 模型可表達鈉離子-?；悄懰峁厕D(zhuǎn)運多肽（Na+-dependent taurocholic cotrans-porting polypeptide，NTCP）、有機陰離子轉(zhuǎn)運蛋白（organic anion transporter，OAT）、有機陰離子轉(zhuǎn)運多肽（organic anion transporting polypeptide，OATP）、P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）、多藥耐藥性蛋白1（multidrug resistance protein 1，MDR1）、多藥耐藥相關蛋白（multidrug resistance-associated protein，MRP）、膽鹽輸出泵（bile salt export pump，BSEP）、乳腺癌耐藥蛋白（breast cancer resistance protein，BCRP）等轉(zhuǎn)運體及CYP 酶、磺基轉(zhuǎn)移酶等藥物代謝酶，亦可持續(xù)分泌尿素、白蛋白、膽汁酸等肝特異性蛋白和有機物（圖1）[8-10]。大鼠原代肝細胞經(jīng)三明治夾心培養(yǎng)后第4 天即可形成廣泛的膽小管網(wǎng)絡和基底外側結構域，且至少能維持2～3 周[11]。因此，SCH 模型常用于預測藥物的肝膽轉(zhuǎn)運與膽汁排泄、藥物相互作用、膽汁淤積等研究中[12]。

2 三明治肝細胞培養(yǎng)體系的制備

2.1 肝細胞的分離

原代肝細胞的分離方法主要分為非灌流法和灌流法。前者操作簡便，但獲取的肝細胞數(shù)量較少且成活率低；后者則需要特殊的灌流裝置，所分離細胞的純度和活性均明顯優(yōu)于非灌流法[13]。其中Seglen 兩步灌流法是目前常用的原代肝細胞分離方法，首先用含陽離子螯合劑、不含鈣離子和鎂離子的D-Hank′s 溶液灌注肝組織，將肝組織中血液完全排出；接著用含鈣離子和膠原酶的Hank′s 溶液繼續(xù)灌注，以消化周圍組織；最后撕去肝臟包膜并收集細胞懸液[14]。

2.2 肝細胞的培養(yǎng)

分離得到的肝細胞可接種于預先包被肝細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的培養(yǎng)板中，待其貼壁后吸除培養(yǎng)基，并用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗去未貼壁的細胞，再鋪上第2 層ECM，即可構成三明治培養(yǎng)體系。ECM 除可以為肝細胞提供結構性支持外，還可調(diào)節(jié)細胞增殖、分化和遷移，影響MRP2、BSEP的表達和活性。常用的ECM 為Ⅰ型膠原和Matrige Ⅰ?，前者由大鼠尾部肌腱中提取獲得，后者是由小鼠肉瘤細胞分泌的含有黏連蛋白和Ⅳ膠原的復合蛋白混合物。與Ⅰ型鼠尾膠原相比，使用Matrige Ⅰ?的肝細胞更容易聚集，形成更廣泛的膽小管網(wǎng)絡。此外，Matrige Ⅰ?的操作簡便，更適合于高通量篩選[12,15]。

肝細胞接種的密度對細胞的形態(tài)和細胞間接觸至關重要。人和大鼠原代細胞最佳的接種密度分別為1.8×105、1.5×105個/cm2。細胞密度過低會影響細胞間接觸，導致肝細胞扁平化和纖維化；密度過高則會干擾細胞黏附，同時抑制MRP2和MDR1a/1b的表達和活性[12]。

三明治培養(yǎng)體系所使用的培養(yǎng)基中應包含氨基酸、激素、維生素、微量元素和輔因子。常用的培養(yǎng)基有DMEM、WME 和氨基酸含量更高的MCM、L15。Chandra 等[16]的研究結果表明，使用WME 培養(yǎng)基的肝細胞和膽小管網(wǎng)絡的形態(tài)都更接近體內(nèi)實際情況，?；悄懰岬哪懝芡馀胖笖?shù)也較其他培養(yǎng)基高。而MCM 培養(yǎng)基則更有利于保持肝細胞的形態(tài)，穩(wěn)定肝特異性酶的活性和減少自噬蛋白的降解，這可能與其氨基酸含量更高有關[16]。

在細胞接種后的24 h 內(nèi)，培養(yǎng)基中應添加5%～10%的胎牛血清，促進肝細胞貼壁并改善細胞的形態(tài)。但血清也會導致細胞分化和抑制膽小管重建，因此應合理控制添加血清的時間[17]。此外，培養(yǎng)基中添加低劑量（0.1～1.0 μmol·L–1）的地塞米松可以促進肝細胞附著于ECM、增強細胞分泌白蛋白能力和改善膽小管網(wǎng)絡；而高劑量（10 μmol·L–1）的地塞米松則能誘導CYP3A 和胞膜轉(zhuǎn)運體的表達[12]。據(jù)報道，添加胰島素也能改善肝細胞的存活率和貼壁率、增強氨基酸轉(zhuǎn)運和蛋白質(zhì)的合成效率、促進糖原和脂肪的合成[11]。

隨著技術的發(fā)展，近年來有研究將微流控芯片技術和肝細胞整合。微流控芯片是由硅、玻璃、高分子聚合物等材料制作而成，具有過濾器、流體通道、反應室、檢測室、傳感器等元件，能在微米級別操控流體，配合自動分析儀器能完成提取、分析等過程[18]。與其他培養(yǎng)方法相比，微流控芯片技術能模擬生理條件下的血液動力學過程，實現(xiàn)細胞的動態(tài)培養(yǎng)，同時還能調(diào)節(jié)營養(yǎng)物質(zhì)或藥物的濃度產(chǎn)生濃度梯度。微流控芯片培養(yǎng)的肝臟組織已被用于肝臟生理學、肝臟疾病模型、藥物肝毒性反應、新藥篩選等研究中[19-20]。

3 SCH模型在中藥肝毒性評價中的應用

中藥導致肝臟損傷的機制主要包括：1）影響CYP酶代謝；2）干擾內(nèi)源性化合物（如膽紅素、膽汁酸）的轉(zhuǎn)運；3）抑制膽汁排泄誘發(fā)膽汁淤積；4）直接引起細胞器損傷[12]。已有大量研究應用SCH 針對上述毒性機制開展研究。

3.1 評價中藥對CYP酶的影響

CYP 酶為單加氧酶的一種，因其還原狀態(tài)在450 nm 下有最大吸收波長而得名。CYP 酶以血紅素鐵卟啉為催化活性中心，參與多種外源物質(zhì)的Ⅰ相代謝反應，包括羥基化、脫鹵、脫氨、環(huán)氧化等，是機體重要的代謝酶系[21]。據(jù)統(tǒng)計，75%的藥物進入機體后經(jīng)由CYP 酶系進行代謝，這其中95%的反應是由CYP3A4、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6 和CYP1A2 5 種酶介導[22]。中藥尤其是中藥復方成分復雜，對CYP 酶產(chǎn)生抑制或誘導效應都有可能延長藥效成分或其他活性代謝物在體內(nèi)的作用時間，增加藥物源性肝損傷的風險。研究提示，黃獨素B、黃樟油、大黃酸等中藥活性單體的肝毒性機制均與CYP 酶功能和水平的變化有關[23]。因此，研究代謝酶介導的藥物-藥物相互作用和肝毒性機制對于臨床上中藥的增效減毒具有重要的意義[4,23]。SCH 模型中正常表達的藥物代謝酶和轉(zhuǎn)運體使其成為重要的中藥代謝研究體外模型。Kirby 等[24]研究利托那韋和奈非那韋對SCH 模型和肝微粒體中CYP3A4 的抑制作用，結果顯示，在利托那韋和奈非那韋處理下，肝微粒體中CYP3A4 的活性分別比SCH 模型中的高13、4 倍，因此，與肝微粒體相比，使用SCH 模型能更準確地預測藥物對CYP的抑制作用。

Shen 等[25]構建了SCH 模型，以咪達唑侖為探針藥物，研究雷公藤甲素（triptolide，TP）的肝毒性機制，結果顯示，TP 以質(zhì)量濃度依賴性的方式抑制CYP3A 的活性，CYP3A4抑制劑能加劇TP對肝細胞的毒性，CYP3A4 誘導劑則能緩解TP 的毒性，提示CYP3A4 的活性可能與TP 的肝毒性機制有關，在臨床中TP 應盡量避免與CYP3A4 的抑制劑聯(lián)用。Zhuang 等[26]利用SCH 模型證實CYP3A 活性的抑制會導致TP 的肝毒性增強。Jackson 等[27]發(fā)現(xiàn)在SCH模型上，五味子提取物能抑制CYP3A4/5 的活性并增加CYP3A4 mRNA 水平，由此推測五味子提取物可能會與經(jīng)由CYP3A4/5 代謝的藥物產(chǎn)生藥物-藥物相互作用。

3.2 評價中藥導致的膽汁淤積

膽汁淤積是指肝內(nèi)外各種原因?qū)е碌哪懼纬?、分泌和排泄障礙，進而導致膽汁不能正常進入十二指腸而反流入血的病理狀態(tài)[28]。在正常生理狀態(tài)下肝細胞通過自身合成或血竇側轉(zhuǎn)運蛋白NTCP 和OATP 攝取膽汁酸。膽汁酸在肝細胞內(nèi)被葡萄糖醛酸化或硫酸化，隨后通過BSEP和MRP2排泄至膽汁中。膽汁排泄后，膽汁酸能通過回腸轉(zhuǎn)運體重新吸收至門靜脈，并再次被肝細胞血竇側轉(zhuǎn)運體所攝取。因此，任何能干擾膽汁酸正常循環(huán)的外源性物質(zhì)均有可能引起膽汁淤積并導致肝臟損傷[29]。調(diào)查顯示，在中藥藥源性肝損傷事件中，4.8%的患者出現(xiàn)膽汁淤積的臨床癥狀，6.7%的患者表現(xiàn)為肝實質(zhì)損傷合并膽汁淤積[30]。因此，建立能預測中藥誘導膽汁淤積型肝毒性的體外模型是研究人員重點關注的問題之一。

SCH 模型因能表達膽汁酸循環(huán)相關的酶及轉(zhuǎn)運蛋白而成為極有潛力的研究藥物性膽汁淤積的體外模型。體系中能形成具有正常形態(tài)和功能的膽小管結構，在含Ca2+/Mg2+的緩沖液中，膽小管結構能維持正常功能；而在不含Ca2+/Mg2+的緩沖液中，細胞的緊密連接無法維持，膽小管結構被破壞，管腔中的物質(zhì)將會擴散至培養(yǎng)液中。因此含Ca2+/Mg2+緩沖液下的細胞和管腔內(nèi)底物總量與不含Ca2+/Mg2+緩沖液下細胞內(nèi)底物總量之差即為排泄進入膽小管的底物量[31]。研究中常使用氘標記的?；悄懼幔╠5-TCA）、氘標記的甘氨鵝脫氧膽酸（d4-GCDCA）和羧基二氯熒光素（CDCFDA）作為探針底物，評價藥物對轉(zhuǎn)運體的影響。d5-TCA 和d4-GCDCA 是膽管側外排型轉(zhuǎn)運體BESP、血竇側攝取轉(zhuǎn)運體NTCP 及血竇側轉(zhuǎn)運體MRP3 和MRP4 的底物，利用液相色譜-質(zhì)譜法（LC-MS）測定細胞內(nèi)這2 種底物的濃度即可計算膽汁外排指數(shù)，間接反映藥物對上述幾種轉(zhuǎn)運體的影響。CDCFDA 進入細胞后被酯酶代謝得到的5(6)-羧基-2,7 二氯熒光素（CDF）是膽管側外排型轉(zhuǎn)運體MRP2 和血竇側外排轉(zhuǎn)運體MRP3 的底物，且CDF 是一種熒光物質(zhì)，可使用酶標儀檢測熒光吸收值測定其含量[32]。

康麗[31]在SCH 模型中分別使用d5-TCA、d4-GCDCA 和CDCFDA 作探針，利用實時熒光定量聚合酶鏈式反應和免疫印跡法（Western blot）評價何首烏中大黃素、大黃酚和大黃素甲醚對膽汁酸轉(zhuǎn)運體功能和表達的影響，進一步明確何首烏致肝臟毒性的機制。Wu 等[33]發(fā)現(xiàn)在SCH 模型中知母皂苷A3能抑制d8-TCA 的攝取和膽汁排泄，同時從mRNA 和蛋白水平上抑制膽汁酸相關轉(zhuǎn)運體的表達，即知母皂苷A3的肝毒性機制可能與膽汁淤積有關。膽汁淤積是治療肺結核的一線藥物利福平常見的不良反應之一，劉蕾等[34]利用SCH 模型研究利福平及聯(lián)用丹參酮ⅡA對BSEP 底物普伐他汀的膽管外排的影響，其結果表明利福平引起膽汁淤積的機制與BSEP 抑制有關，且聯(lián)用丹參酮ⅡA能減弱BSEP的抑制作用，緩解膽汁淤積，為臨床上預防利福平引起膽汁淤積提供依據(jù)。

除了膽汁酸以外，膽紅素是另一種依賴膽汁排泄的內(nèi)源性物質(zhì)。唐志芳等[35]利用SCH 模型研究何首烏炮制前后對膽紅素外排的影響，結果提示何首烏與制何首烏能抑制MRP2 的功能，導致膽紅素的膽汁排泄減少，進而引發(fā)膽汁淤積。

3.3 評價中藥的其他肝毒性機制

通過檢測SCH 模型中有和無Ca2+/Mg2+緩沖液條件下藥物在細胞內(nèi)的累積量，計算膽汁外排指數(shù)和清除率，可推斷藥物的動力學過程和毒性反應機制。Zhuang 等[26]利用SCH 模型發(fā)現(xiàn)在P-gp 抑制劑ritonavir 和tariquidar 的作用下，TP 的膽汁清除率分別下降73.7%和84.2%；而在P-gp 誘導劑作用下，TP的膽汁清除率可增加2倍，表明P-gp介導了TP的膽汁外排過程。梁瑞峰等[36]也利用該模型研究了有和無P-gp、MRP2抑制劑對黃連中3個活性成分小檗堿、巴馬汀和藥根堿的膽汁外排指數(shù)的影響，從而確定是P-gp 而不是MRP2 介導這3 個活性成分的膽汁排泄。

4 SCH與其他肝細胞體外培養(yǎng)模型的對比

SCH 與其他肝細胞體外培養(yǎng)模型相比主要有兩大優(yōu)勢，即可較好地模擬體內(nèi)肝細胞環(huán)境及較長時間維持肝細胞狀態(tài)，藥物代謝能力較好。但培養(yǎng)過程中需要每天更換培養(yǎng)基，且不適合用于96 孔板培養(yǎng)。

盡管傳統(tǒng)的2D 培養(yǎng)操作簡便且成本相對較低，但是無法有效地模擬實際體內(nèi)環(huán)境。在生理條件下，肝細胞呈三維立體的方式生長，能與其他細胞和細胞外基質(zhì)相互作用，這有利于維持良好的細胞形態(tài)，調(diào)節(jié)相關基因的表達，并形成正常的增生和分化功能。因此，3D 培養(yǎng)能更好地模擬肝細胞在生理狀態(tài)下的形態(tài)和活性，對于提高預測藥物代謝和毒性反應的準確性具有重要的意義[37]。肝細胞的3D 培養(yǎng)模型主要分為有支架和無支架2 種。支架能為細胞間的連接和肝細胞聚集體的形成提供良好的支撐作用，常用的支架材料包括殼聚糖、海藻酸鹽、膠原蛋白等。而無支架的方法則是通過使用無黏附性的培養(yǎng)皿、生物反應器或懸滴培養(yǎng)等方法，使肝細胞自發(fā)形成球狀聚集體[18,38]。

此外，早期常用的肝細胞體外培養(yǎng)模型為2D 平面培養(yǎng)模型，模型中肝細胞為扁平狀，且具備大部分肝臟特異性的功能，如糖原合成、蛋白質(zhì)的合成和分泌、尿素生成、膽汁酸的合成和吸收、代謝外源性物質(zhì)等[18]。但是由于2D 培養(yǎng)的肝細胞缺少細胞間接觸和細胞與細胞基質(zhì)的接觸，隨著培養(yǎng)時間延長，其形態(tài)和極性都與體內(nèi)肝細胞有較大差異，對藥物的代謝能力也會急劇下降，因此不適用于長期給藥研究。與2D培養(yǎng)相比，SCH模型的肝臟特異性功能明顯提高，能重建肝細胞極性，形成廣泛的類膽小管結構，是研究藥物肝膽轉(zhuǎn)運和膽汁淤積最有力的模型。但是在長期培養(yǎng)的過程中，SCH 模型仍不可避免地喪失肝細胞原有的形態(tài)和功能，相關的藥物代謝酶活性也逐漸下降。不同肝細胞體外培養(yǎng)模型及比較見圖2和表1。

5 結語與展望

中藥毒性作用靶點不明確是限制其發(fā)展的重要因素之一。與其他肝毒性體外評價模型相比，SCH模型能模擬在藥物轉(zhuǎn)運體和藥物代謝酶共同作用下的生物學效應，在研究藥物肝膽轉(zhuǎn)運和藥源性肝損傷機制方面具有突出的優(yōu)勢。但是隨著培養(yǎng)時間延長，肝細胞仍然不可避免地去分化，喪失部分肝臟特異性生物活性。因此研究人員通過調(diào)整培養(yǎng)基組成和更換ECM 種類等方法獲得最佳的培養(yǎng)條件。據(jù)報道，將肝細胞和其他非實質(zhì)肝細胞（如星狀細胞，竇狀內(nèi)皮細胞和庫普弗細胞）以三明治夾心的結構進行共培養(yǎng)，能更好地模擬肝臟正常的結構和生物活性，活性可至少維持4 周[41]。應用SCH 模型進行毒性研究時也應考慮細胞來源的問題。原代肝細胞保留了多種肝臟特異性功能，是體外研究藥物肝毒性的金標準。但其來源獨特、應用成本較高且無法批量生產(chǎn)，因此應用受到限制。而在使用癌細胞系、多能干細胞來源的肝細胞等細胞系時，應充分考慮實驗的需要和細胞系的特點，選擇合適的細胞，如HepG2 細胞中CYP450 酶活性普遍不高，不適用于與CYP 酶相關的毒性研究中；人誘導多能干細胞來源肝細胞BESP 低水平表達，不適用于膽汁淤積的研究[42]。通過不斷改良和優(yōu)化SCH 模型構建方法，模型用于預測藥物肝毒性的風險和研究毒性機制的價值將會大大提高，有望成為體外評價藥物肝毒性的有力工具。