CAR-T細胞治療在急性髓系白血病中的研究和應用進展*

肖植文 喻敏 李菲

近年來，已出現(xiàn)較多急性髓系白血病 （acute myeloid leukemia，AML）治療的新藥，這些新藥給予復發(fā)/難治性患者獲得再次緩解的機會，但在年輕復發(fā)AML 的預后評估中，高?；颊哒急燃s為66%，而5 年總生存率 （overall survival，OS）僅為4%[1]，提示有必要探索治療復發(fā)難治性AML 的其他有效方案。 在其他血液學腫瘤免疫療法治療成功案例的推動下，嵌合抗原受體修飾T 細胞 （chimeric antigen receptor Tcell，CAR-T）免疫療法已在部分復發(fā)/難治性AML 患者的治療中得到了應用。

1 嵌合抗原受體的基本結(jié)構及其作用

嵌合抗原受體 （CARs）是一種人工合成的受體，可以引導淋巴細胞識別并消除表達同源靶向配體的細胞。CARs 由胞外靶向連接區(qū)、鉸鏈區(qū)、跨膜區(qū)、胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導區(qū)4 個部分組成。胞外靶向連接區(qū)是CART 細胞外部，其識別目標抗原并改變CARs 表達的淋巴細胞的特異性。胞外靶向連接區(qū)主要是由單克隆抗體的重鏈可變區(qū) （VH）和輕鏈可變區(qū) （VL）通過連接肽 （linker）連接而成的單鏈可變片段 （single-chain variable fragment，scFv）[2]。鉸鏈區(qū)起著連接CAR 的外結(jié)構域和跨膜結(jié)構域的作用。跨膜區(qū)主要是由Ⅰ型膜蛋白衍生出來，如CD3、CD4、CD8 或CD28。胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導區(qū)主要是由1 個或多個共刺激因子 （costimulatory molecule，CM）和1 個激活域組成[3]。常用的共刺激因子是以CD28 為代表的B7 家族和以4-1BB 為代表的腫瘤壞死因子受體家族。其中具有CD28 結(jié)構域的CAR-T 細胞具有更高效、更快速的細胞毒能力，具有4-1BB 共刺激域的CAR-T 細胞在患者體內(nèi)保留時間更長[4]。

2 CAR-T 治療AML 的臨床應用靶點

2.1 CD33-CAR-T

CD33 在幾乎90% 的AML 病例中表達于白血病細胞亞群，包括白血病干細胞，以及一些正常的髓系祖細胞。CD33 為AML 免疫治療的1 個具有吸引力的靶點。解放軍總醫(yī)院對1 例復發(fā)難治性AML 患者開展的臨床試驗[5]，在輸注總計1.12×109CD33-CART 細胞后，2 周后骨髓原始細胞明顯減少，由原先＞50%下降至＜6%，卻在第3 周開始上升至22%，第5周為27%，第9 周接近70%，疾病逐漸加重，患者直至第13 周死亡。美國安德森癌癥中心報道的Ⅱ期臨床試驗中[6]，3 例接受抗CD33-CAR-T 輸注治療的患者中，2 例患者分別發(fā)生3 級和2 級細胞因子釋放綜合征 （cytokine release syndrome，CRS），1 例發(fā)生2 級免疫效應細胞相關神經(jīng)毒性綜合征 （immune effector cell-associated neurotoxicity syndrome，ICANS）。最終3 例患者在1 個月內(nèi)均因疾病進展而死亡。由于CD33 不僅在白血病細胞上表達，而且在幾乎所有健康的髓細胞和祖細胞上表達，CAR-T 細胞治療不良反應 （包括CRS、ICANS）是臨床前實驗和CD33 靶向治療臨床試驗中不可回避的問題，也是目前臨床應用需要克服的難題。Liu 等[7]構建出第3 代CD33-CART 在體外實驗中表現(xiàn)出較長的持久性及較小的細胞毒性，但還需更多的臨床前實驗驗證其效果。

2.2 CD123-CAR-T

CD123 在AML 中表達也相當普遍，60%～80%的AML 細胞高表達CD123，但在正常造血干細胞中表達水平較低或不表達。CD123 也是非常具有吸引力的治療靶點。在CD123 重定向CAR-T 細胞治療AML 的臨床前研究模型中顯示，抗CD123-CAR-T 會導致正常造血細胞顯著減少[8]。Sun 等[9]報道了單例患者在使用抗CD123-CAR-T 細胞治療后最終實現(xiàn)了完全緩解 （complete response，CR）。在輸注后第6 日，患者骨髓造血干細胞從38% 降至8%，第18 日行異基因造血干細胞移植，第42 日完成異基因造血干細胞移植但仍未脫離血小板及紅細胞輸注，于第56 日死于急性移植物抗宿主?。╝cute graft versus host disease，GVHD）、重癥肺炎、多器官功能衰竭。目前，研究肯定了抗CD123-CAR-T 細胞在AML 患者中的治療效果，但仍提出了血液學毒性的問題。有研究通過構建以CD28 為共刺激域并結(jié)合zeta 信號結(jié)構域的CD123-CAR-T 具有較好的安全性及有效性[10]。

2.3 CLL-1-CAR-T

C 型凝集素樣分子 （C-type lectin-like molecule-1，CLL-1）是Ⅱ型跨膜糖蛋白，起抑制受體的作用。白血病干細胞 （leukemic stem cell，LSC）被認為是AML治療失敗和復發(fā)的主要原因。CLL-1 在LSC 中低表達及存在個體差異表明CLL-1 并非1 個通用的LSC標記，但是CLL-1 在正常的造血干細胞和非造血組織表達中有限，預測CLL-1 將會是某些亞組患者的較好靶點，需要根據(jù)個體化的表達水平來選用CLL-1 靶點進行治療。動物模型中顯示，抗CLL-1-CAR-T 細胞對CLL-1 陽性的AML 動物具有治療效應，但由于CAR-T 細胞持久性不足而復發(fā)[11]。有研究報道3 例兒童AML 患者接受抗CLL-1-CAR-T 細胞治療后，均達到了完全緩解（complete response，CR），并接受了造血干細胞移植，提示抗CLL-1-CAR-T 細胞可能能為某些白血病患者提供后續(xù)造血干細胞移植的機會[12]。目前認為抗CLL-1-CAR-T 細胞安全性良好，不具有造血干細胞靶向的潛在毒性。

2.4 CD19-CAR-T

AML 中CD19的異常表達通常與t（8;21）（q22;q22）相關，未出現(xiàn)染色體易位的AML 及混合表型急性白血病也可有CD19 異常表達，已有臨床前研究報道抗CD19-CAR-T 細胞對CD19+AML 細胞具有殺傷力和應用潛力。有研究報道2 例t（8;21）CD19+AML 男性患者接受抗CD19-CAR-T 細胞治療的案例[13]，1 例患者在接受抗CD19-CAR-T 細胞治療后達到細胞形態(tài)學緩解 （morphological CR,mCR）持續(xù)10 個月，另1例患者在接受抗CD19-CAR-T 細胞治療后達到血液學緩解 （hematological CR,hCR）和mCR。在接受CD19-CAR-T 細胞治療后，2 例患者AML 細胞中CD19+占比分別從40.1% 和22.6% 下降至14.3%和6.5%。患者因經(jīng)濟原因拒絕進一步治療，最終于抗CD19-CAR-T 細胞治療后第3 個月復發(fā)，于第5 個月死亡。2 例患者都曾出現(xiàn)短暫的4 級血細胞減少，隨后很快恢復。有研究同樣報道1 例復發(fā)難治性AML男性患者[14]，流式細胞術證實CD19 異常表達，在接受抗CD19-CAR-T 細胞治療后第28 日達到臨床和分子學緩解，4 個月后仍持續(xù)緩解。提示CD19-CAR-T 細胞治療效果尚佳，但由于病例數(shù)較少，還需要更多的臨床試驗來證實。

2.5 NKG2D-CAR-T

NKG2D 配體表達在包括AML 在內(nèi)的多種惡性腫瘤中，但在正常成人組織中未廣泛表達。Marofi 等[15]研究顯示7 例接受抗NKG2D-CAR-T 細胞治療的AML 患者中，2 例患者疾病穩(wěn)定超過1 年，2 例患者疾病穩(wěn)定6 個月后進展，3 例患者僅改善了癥狀在6個月之內(nèi)陸續(xù)死亡。在另外一項臨床試驗中[16]，12 例復發(fā)難治性AML 患者接受抗NKG2D-CAR-T 細胞治療后，僅2 例患者達CR 時間超過3 個月，并在之后行異基因造血干細胞移植，持續(xù)CR 時間超過28 個月，5 例患者在3 個月之內(nèi)疾病進展，3 例患者因其他原因死亡，2 例患者病情穩(wěn)定。由于在AML 患者中NKG2D 配體的表達差異性較大，抗NKG2D-CAR-T細胞對AML 患者治療效果還有待于進一步觀察。

2.6 LewisY

Lewis 抗原在多種上皮來源的腫瘤中過度表達，在早期髓系祖細胞和相應的CD34+白血病細胞系也有表達。在一項早期抗LewisY-CAR-T 細胞治療的Ⅰ期研究中顯示[17]，接受抗LewisY-CAR-T 細胞治療的4 例AML 患者中，3 例患者在接受CAR-T 細胞輸注時有微小殘留病灶 （minimal residual disease，MRD）的依據(jù)，輸注后49 天、5 個月、23 個月后疾病進展。所有患者均未觀察到3 級或4 級不良反應。雖然僅觀察到有限的療效，但這項研究表明CAR-T 細胞可以在AML 患者體內(nèi)有治療效果且無明顯不良反應。

2.7 CD38-CAR-T

CD38 在大多數(shù)AML 細胞上表達，但在健康的人類造血干細胞上不表達。因此，CD38 是治療AML的潛在靶點。一項臨床試驗顯示[18]，在6 例異基因造血干細胞移植后復發(fā)且接受多組搶救治療均無效的CD38+AML 患者中，4 例患者在第4 周達到了CR，其中1 例CR，3 例伴骨髓恢復不完全的完全緩解（CR with incomplete count recovery，CRi），1 例患者無反應，1 例疾病進展。4 例CR 患者中，其中2 例患者復發(fā)，1 例于117 日后復發(fā)，予以抗CD38-CAR-T 細胞治療后再次CR，1 例患者死亡。6 例患者中位總生存期和無白血病生存期分別為7.9 個月和6.4 個月。

3 CAR-T 治療AML 的潛力靶點

Fms 樣酪氨酸激酶3 （FLT3）是AML 中最常見的基因突變之一，約占AML 病例的30%。Wang 等[19]的研究顯示，抗FLT3-CAR-T 細胞在體外有很強的FLT3+AML 細胞殺傷能力，能延長AML 小鼠的生存期且不會損傷健康的造血干細胞。Shrestha 等[20]的研究也顯示了同樣的結(jié)果。CD44 是一種跨膜蛋白，CD44v 是CD44 的一種亞型，僅在上皮細胞及造血細胞亞群上表達。早期一項研究顯示抗CD44v6-CART 在體外及小鼠體內(nèi)對AML 細胞均有殺傷效果，而對造血干細胞沒有影響，僅單核細胞減少[17]。葉酸受體β （folate receptor β,FRβ）表達于髓系造血細胞，在70%AML 中表達。Ghamari 等[21]已經(jīng)證實葉酸受體β 為AML 治療的潛在靶點，抗FRβ-CAR-T 細胞在體外及小鼠體內(nèi)均具有抗白血病效果，且未發(fā)現(xiàn)造血干細胞毒性。

4 復合CAR-T 在AML 中的應用

構建這種雙CAR 的主要目的是減少由于克隆逃逸丟失一個靶向抗原而導致的復發(fā)機會。一項實驗室研究發(fā)現(xiàn)CD33-CLL-1 組合靶向是兒童AML 中最有前途的靶向組合[22]。體外實驗顯示，抗CLL-1-CD33 CAR-T 對CD33 或CLL-1 陽性的細胞株以及AML患者的原發(fā)性白血病樣本具有特異性的抗腫瘤活性。Hazelton 等[23]進行的一項首次在人體內(nèi)進行的Ⅰ期臨床試驗，將抗CLL-1-CD33CAR-T 細胞用于1 例6歲復雜核型并對多種治療耐藥的AML 女性患者，治療安全且耐受性良好，在注射CAR-T 細胞治療后第19 日骨髓穿刺顯示MRD陰性。在第44 日接受異體干細胞移植后達到CR。

基于上述研究數(shù)據(jù)，雙靶點治療策略以防止抗原下調(diào)已被證明是有效的。但無證據(jù)表明雙靶向CAR會增加CAR-T 細胞相關不良反應的臨床發(fā)生率，由于可用數(shù)據(jù)有限，不能排除這種可能性。

5 CAR-T 細胞治療的不良反應

CRS 是CAR-T 細胞治療最常見的不良反應，主要由細胞因子過度釋放引起。CRS 的臨床癥狀表現(xiàn)為發(fā)熱伴疲勞、關節(jié)痛、僵直等，然后迅速進展為低血壓、心動過速、缺氧等。發(fā)熱通常是CRS 的首要和最必須的癥狀。目前，認為早期應用托珠單抗 （tocilizumab）可以降低嚴重CRS 的發(fā)生率，而不影響CAR-T細胞，或是使用大劑量皮質(zhì)類固醇激素通過抑制CART 細胞和旁路免疫細胞來緩解[24]。ICANS 可與CRS同時發(fā)生，也可獨立于CRS 發(fā)生。可表現(xiàn)為譫妄、昏迷、癲癇、腦水腫。目前，對ICANS 發(fā)生機制了解較少。類固醇激素是一線治療，托珠單抗對血腦屏障穿透力較差，在解決神經(jīng)毒性方面療效較差[25]。

6 結(jié)語

在B 細胞惡性腫瘤中，CAR-T 細胞取得較好的療效，但CAR-T 對AML 的治療價值仍未確定。尋找合適的具有低非靶向毒性的靶點和減少非靶向毒性是目前應用CAR-T 治療AML 面臨的挑戰(zhàn)。在已有的具有低毒性靶點上可進行更多的動物實驗來進一步明確治療效果及安全性。在減少非靶向毒性上可以做更多的嘗試，如在CAR 中植入自殺基因、構建臨時表達的CAR、提高CAR 的親和力與復合CAR 的選擇。