低氧閾刺激促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化

趙勇亮 安國斌 侯春波 楊瑞瑞

山東第一醫(yī)科大學(xué)（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院）臨床與基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250117

中樞神經(jīng)損傷會降低患者的生活質(zhì)量，目前主要的治療手段是藥物治療、外科介入及康復(fù)訓(xùn)練，但治療難度較大，療效有限。中樞神經(jīng)損傷后的修復(fù)治療一直是臨床工作面臨的重大難題之一，需要進(jìn)一步探索促進(jìn)中樞神經(jīng)損傷后修復(fù)的方法。近年來，國內(nèi)外對神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cells，NSC）的培養(yǎng)、生物特性、臨床應(yīng)用進(jìn)行了一定研究并取得了相應(yīng)成果。NSC 是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)處于未分化狀態(tài)的母細(xì)胞，具有自我分裂及更新的能力，并能向多方向進(jìn)行分化。NSC 可以促進(jìn)中樞神經(jīng)損傷修復(fù)，特別是外源性NSC 移植，已在臨床中樞神經(jīng)損傷修復(fù)中得到廣泛研究。低氧作為外源性刺激因子，可激活機(jī)體內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，促進(jìn)NSC 的增殖，參與中樞神經(jīng)損傷后的修復(fù)過程［1］。低氧有利于神經(jīng)干細(xì)胞微環(huán)境的構(gòu)建，并且對中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后神經(jīng)元的再生及修復(fù)具有重要作用［2］。低氧閾刺激即在體外低氧環(huán)境誘導(dǎo)下刺激NSC 增殖分化。作為無創(chuàng)性治療方法，低氧閾刺激安全且易在臨床中實現(xiàn)，故探索中樞神經(jīng)損傷后低氧閾刺激對運動功能恢復(fù)的影響具有重要意義。

1 低氧處理有助于NSC的增殖分化

低氧處理后，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的NSC相較于常氧下，增殖數(shù)量有明顯提升［3］，并且低氧處理有效地促進(jìn)了NSC的分化［4］。而低氧本身作為胚胎發(fā)育和腦組織間隙的正常環(huán)境，是NSC增殖分化中的生理性刺激因素，體外培養(yǎng)NSC 則可利用低氧維持NSC干細(xì)胞特性的作用，從而觸發(fā)人中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元的發(fā)生［5］。但中樞神經(jīng)損傷后，其自發(fā)性的修復(fù)尚不能完全恢復(fù)神經(jīng)功能，低氧則可以在中樞神經(jīng)系統(tǒng)修復(fù)的基礎(chǔ)上進(jìn)一步刺激并增強(qiáng)內(nèi)源性恢復(fù)程度。目前發(fā)現(xiàn)低氧不僅可以作為NSC 增殖分化的直接刺激因素，還能夠上調(diào)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的低氧敏感性生長營養(yǎng)因子水平，不僅起到保護(hù)神經(jīng)的作用，還能增加神經(jīng)的可塑性，調(diào)節(jié)突觸與相關(guān)的信號通路，在神經(jīng)系統(tǒng)損傷后對功能恢復(fù)起到重要作用。此外，低氧可以增加腦組織中血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表達(dá)，促進(jìn)血管新生，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷起保護(hù)作用。

2 低氧閾刺激對NSC增殖分化的作用

2.1 RNA結(jié)合蛋白RBM3在低氧下促進(jìn)NSC增殖

RNA 結(jié)合蛋白RBM3 在低氧條件下促進(jìn)NSC增殖［6］，調(diào)控RBM3的表達(dá)為增加培養(yǎng)的NSC活力、增殖能力和多效性開辟了一條新途徑，這可能會提高移植后的治療效果。RBM3在低氧缺血性腦損傷后通過IMP2-IGF2信號通路以生態(tài)依賴性方式促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生［7］。

2.2 代謝性谷氨酸受體（metabotropic glutamate receptor，MGluR）發(fā)揮調(diào)節(jié)作用

MGluR 是結(jié)合谷氨酸并通過G 蛋白影響第二信使系統(tǒng)的細(xì)胞表面蛋白。有報道稱，低氧調(diào)節(jié)增殖的NSC 中，MGluR 的表達(dá)增多，而由低氧誘導(dǎo)的MGluR 的表達(dá)可能是低氧刺激NSC 活化的機(jī)制之一［8］，MGluR5參與暴露于低氧狀態(tài)的大鼠神經(jīng)祖細(xì)胞的增殖。研究表明，在體外低氧刺激大鼠神經(jīng)祖細(xì)胞的增殖過程中，MGluR5的表達(dá)被上調(diào)［9］。NSC是自我更新的多能細(xì)胞，可分化為神經(jīng)系統(tǒng)的主要表型（包括神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞）。神經(jīng)祖細(xì)胞（neural progenitor cells，NPCs）是干細(xì)胞分裂的后代，可以在有限分裂后開始分化為各種類型的細(xì)胞。低氧閾刺激下MGluR 表達(dá)水平提高，提示其亞型可能在低氧誘導(dǎo)的NSC增殖分化中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。

2.3 低氧時可見HIF-1α的表達(dá)增多

HIF-1 是由α 和β 亞基構(gòu)成的異二聚體轉(zhuǎn)錄因子，而HIF-1α在低氧狀態(tài)下表達(dá)增多并且理化性質(zhì)較常氧下更加穩(wěn)定。相較于其他生物活性因子?如誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS），HIF-1α 表達(dá)增加促進(jìn)NSC 增殖、抑制其凋亡的作用要顯著高于iNOS［10］。作為重要的生物活性因子，HIF-1α的作用很多。

2.3.1 促使VEGF 和VEGF 受體表達(dá)增加，誘導(dǎo)新生血管形成 內(nèi)皮細(xì)胞可以通過VEGF分泌促進(jìn)低氧條件下的NSC增殖［11］。HIF-1α可以誘導(dǎo)VEGF表達(dá)增多，輕中度或者短期內(nèi)的低氧閾刺激下可以使HIF-1α 更加穩(wěn)定，進(jìn)而引起VEGF 等具有保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)功能的靶基因表達(dá)增多。而VEGF本身可以動員新生血管細(xì)胞的形成，增加低氧部分的血液供應(yīng)，為NSC 提供更多的能量與生物活性因子，促進(jìn)NSC的增殖，特異性表達(dá)VEGF 的NSC 可用于治療神經(jīng)性疼痛以及損傷修復(fù)［12-13］。

2.3.2 促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1 型（glucose transporter type 1，GLUT-1）和糖酵解酶等表達(dá)，增加細(xì)胞攝取葡萄糖 GLUT-1 是一種普遍表達(dá)的葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白，主要在血腦屏障的內(nèi)皮細(xì)胞和紅細(xì)胞中表達(dá)，并負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運葡萄糖進(jìn)入大腦，而低氧時，NSC 增殖的過程是由于HIF-1α 上調(diào)使得NSC 受刺激后增加了葡萄糖攝入從而完成增殖。低氧增加了大鼠腦內(nèi)NSC 的細(xì)胞活力，而對于NSC 來說，低氧屬于一種高刺激的環(huán)境，只有當(dāng)缺乏葡萄糖時，NSC 才會凋亡。低氧閾刺激下，NSC 培養(yǎng)基中葡萄糖含量明顯降低，而其通過糖酵解消耗更多的葡萄糖來產(chǎn)生能量。但并非葡萄糖含量越高就意味著NSC 增殖能力越強(qiáng)，相反，相比于低氧高糖的環(huán)境下，NSC 更傾向于低氧低糖的條件下生長，并通過糖酵解維持其自我更新增殖的能力。

2.3.3 誘導(dǎo)腦源性促紅細(xì)胞生成素（erythropoietin，EPO）生成 腦源性EPO 與血源性EPO 比較產(chǎn)生的量少，但具有更高的活性。EPO 是一種糖蛋白激素，主要由成人的腎臟和胎兒的肝臟分泌，作用于骨髓的紅系干細(xì)胞以刺激其增殖和分化，其可以調(diào)節(jié)紅細(xì)胞的產(chǎn)生和VEGF 的表達(dá)從而觸發(fā)新血管形成和GLUT-1 的增多，促進(jìn)細(xì)胞攝取葡萄糖［14］。

2.3.4 調(diào)控miR-210 表達(dá) 一些ncRNAs 參與了低氧閾刺激下NSC增殖的調(diào)節(jié)，其中miR-210表達(dá)水平在低氧條件下增加［15］。其啟動子區(qū)有保守的HIF-1α調(diào)控元件，證明其受HIF-1α的調(diào)控。此外，低水平分泌型miR-210僅略微增加了神經(jīng)祖細(xì)胞的細(xì)胞活力，相比之下，高水平分泌型miR-210表現(xiàn)出對細(xì)胞活力的抑制作用?？傊?，低氧增加了外泌體中miR-210的分泌，并對受體NPC 的細(xì)胞活力表現(xiàn)出不同的影響。

2.3.5 低氧通過miR-21促進(jìn)NSC的增殖 miR-21的表達(dá)可以促進(jìn)NSC的增殖，若降低miR-21的濃度可以抑制NSC的增殖［16］。研究發(fā)現(xiàn)，在低氧（3%）條件下，NSC 在對照組高表達(dá)miR-21，在常氧組表達(dá)有所降低，但在0.3%低氧條件下miR-21 的表達(dá)明顯高于前兩組，這些都提示miR-21在NSC的增殖中起調(diào)節(jié)作用［17］。

2.3.6 HIF1-α 的穩(wěn)定有助于NSCs 保持其增殖分化的能力 HIF1-α 的穩(wěn)定性受脯氨酰羥化酶（prolyl hydroxylase，PHD）的調(diào)節(jié)，其活性主要受PHD底物如氧（O2）、α-酮戊二酸（α-KG）以及輔助因子抗壞血酸（ascorbic acid，ASC）和亞鐵（Fe2+）所影響。由此可見，HIF-1α 的轉(zhuǎn)錄活性實際上是由O2、α-KG、ASC 和Fe2+的含量決定的，在低氧狀態(tài)下，PHDs 的活性受到低O2的抑制，可以穩(wěn)定HIF1-α 水平。因此，在常氧條件下抑制PHD 活性，模擬低氧的作用，有利于保持NSCs 的干細(xì)胞增殖分化的能力［18］。但針對低氧刺激NSC分化還是增殖上，有不同的觀點。

低氧可以刺激NSC 分化增加，在體外培養(yǎng)NSC中起促進(jìn)神經(jīng)元分化的作用［19］。實驗證明，在低氧處理大鼠腦組織后，受影響的半球腦室下區(qū)域存在強(qiáng)烈的增殖反應(yīng)，而通過與對照組比較，發(fā)現(xiàn)受低氧處理的半球腦室下區(qū)域產(chǎn)生3 倍的神經(jīng)元，而少突膠質(zhì)細(xì)胞則多出2倍。低氧閾刺激對于調(diào)節(jié)神經(jīng)分化至關(guān)重要，并顯示出對NSC 分化的不同影響，這取決于NSC發(fā)育的時間進(jìn)程。在低氧誘導(dǎo)早期，低氧抑制神經(jīng)分化，維持未分化狀態(tài)；而在低氧誘導(dǎo)后期，低氧誘導(dǎo)神經(jīng)分化［20］。

低氧閾刺激對NSC 的增殖起促進(jìn)作用而分化并未表現(xiàn)出來。研究表明，在低氧氣（1%）供應(yīng)下，不會影響NSC 的體外活力與增殖，即便NSC 或者NPCs 能夠在低氧刺激下的成年小鼠腦組織存活并增殖，但其并未分化成神經(jīng)元［21］。除此之外，前文提到的HIF-1α在低氧閾刺激下表達(dá)增多，其可以通過激活Hes1防止NSC過早分化［22］，這與上文的實驗結(jié)果有差異。說明低氧閾刺激可以在促進(jìn)NSC 增殖的同時，抑制其早期分化，但關(guān)于二者是否存在明顯的差別，目前仍有爭論。

2.4 低氧通過其他信號通路促進(jìn)NSC的增殖

活性氧（reactive oxygen species，ROS）是由氧的不完全單電子還原形成的分子或離子，它們有助于巨噬細(xì)胞發(fā)揮效應(yīng)，調(diào)節(jié)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因表達(dá)，并可以對核酸發(fā)生氧化損傷。而在低氧閾刺激NSC增殖中，ROS 可以通過PI3K/Akt 信號通路介導(dǎo)NSC的增殖和分化［23］。星形膠質(zhì)細(xì)胞（astrocytes）形狀不規(guī)則，具有許多長突起，它們形成神經(jīng)膠質(zhì)膜并直接或間接地形成血腦屏障。在低氧閾刺激下，星形膠質(zhì)細(xì)胞被激活并通過PI3K/Akt 信號通路促進(jìn)NSC 增殖［24］。提示PI3K/Akt 信號通路參與低氧閾刺激時NSC 的增殖，在此當(dāng)中發(fā)揮作用。研究發(fā)現(xiàn)，體外低氧通過活化大鼠NSC中的c-Jun N末端蛋白激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）來增加細(xì)胞周期蛋白D1（cyclin D1）的表達(dá)，提示低氧誘導(dǎo)的NSC 增殖的可能機(jī)制［25］。此外，體外輕度低氧也可促進(jìn)海馬衍生的NSC 增殖和神經(jīng)元分化。輕度低氧增強(qiáng)了Notch1 和Hes1 表達(dá)，表明Notch1 信號可能參與低氧條件下的神經(jīng)保護(hù)。

Wnt 蛋白是一大類分泌性糖蛋白，在胚胎和胎兒發(fā)育以及組織維持中發(fā)揮重要作用。β連環(huán)蛋白（β-catenin）是一種參與細(xì)胞粘附和核信號傳導(dǎo)的多功能連環(huán)蛋白，它可以充當(dāng)Wnt蛋白介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的轉(zhuǎn)錄共激活劑和下游組件。Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)通過影響細(xì)胞周期來調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖，而低氧通過增加HIF-1α 的表達(dá)并激活Wnt/β-catenin信號通路來刺激NSC 增殖［26］，并通過MFN2 誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞分化［27］。研究發(fā)現(xiàn)，體外低氧培養(yǎng)下，NSC增殖增加且其β-catenin 表達(dá)增加，表明Wnt/βcatenin 信號通路具有促進(jìn)低氧誘導(dǎo)NSC 增殖的作用［28-29］。 基 質(zhì) 金 屬 蛋 白 酶 -9 （matrix metalloproteinase-9，MMP-9）是Wnt 激活后的下游關(guān)鍵分子效應(yīng)物，在低氧刺激NSC 增殖中發(fā)揮效應(yīng)［30］。

2.5 低氧預(yù)適應(yīng)增強(qiáng)Bcl-2 的表達(dá)并且抑制caspase-3 的表達(dá)，有助于提升NSC的抗低氧能力

B細(xì)胞白血病/淋巴瘤-2基因（Bcl-2），負(fù)責(zé)阻止正常細(xì)胞的凋亡，并在過度表達(dá)時與濾泡性淋巴瘤相關(guān)。caspase-3是一種短的前域半胱天冬酶，在細(xì)胞凋亡中起效應(yīng)作用。經(jīng)歷過低氧預(yù)適應(yīng)后，NSC可以提高對低氧損傷的抵抗力，這些在將來復(fù)氧后NSC 增殖活性提升起不可取代的作用。研究表明，低氧預(yù)適應(yīng)可以增加腦組織內(nèi)Bcl-2的表達(dá)并且可以抑制caspase-3的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞凋亡。低氧預(yù)適應(yīng)增強(qiáng)小鼠腦出血后NSC移植治療［31］，這樣的處理方式為體外培養(yǎng)NSC 提供方法基礎(chǔ)。同樣的研究還可見低氧預(yù)處理策略保護(hù)大鼠神經(jīng)細(xì)胞，改善大鼠脊髓損傷后的修復(fù)，因此可作為治療大鼠脊髓損傷的有效且可行的策略［32］。這些可以為臨床治療腦卒中提供理論基礎(chǔ)。

3 不同的低氧濃度刺激下NSC的增殖

多項研究均表明，低氧閾刺激可促進(jìn)NSC的增殖，但關(guān)于具體的低氧閾刺激濃度卻莫衷一是。有研究發(fā)現(xiàn)，3%的低氧環(huán)境下，NPCs 可以維持其活性，在此濃度下對其低氧預(yù)適應(yīng)并移植發(fā)現(xiàn)，3%的低氧預(yù)適應(yīng)增加NPCs 的增殖活性，其存活率是對照組的2 倍［33］，這樣通過低氧來增強(qiáng)細(xì)胞抗低氧能力的研究與前文研究結(jié)果一致。但多數(shù)研究以2%～5%的低氧刺激作為實驗組，有報道稱，大腦皮層NSC增殖分化的最佳濃度和時間窗為5%氧預(yù)處理72 h［34］；若以20%的常氧作為對照組，發(fā)現(xiàn)實驗組經(jīng)過低氧閾刺激后，NSC 增殖明顯提升，細(xì)胞增殖數(shù)量較對照組增多，并且可以有效提高NSC的增殖速度，但1%的低氧刺激NSC 并未表現(xiàn)出更高的增殖速度［35］，說明在一定程度的低氧范圍內(nèi)，對NSC 的增殖促進(jìn)具有最大效應(yīng)，而一旦超過此范圍，增殖的促進(jìn)效應(yīng)降低甚至可能會轉(zhuǎn)變?yōu)橐种菩?yīng)。

4 結(jié) 論

低氧閾刺激下，可以促進(jìn)NSC 的增殖分化，此外在低氧預(yù)適應(yīng)后，NSC 的抗低氧損傷能力提升，并在未來移植或者復(fù)氧后表現(xiàn)為更強(qiáng)的增殖活性。盡管有眾多的潛在機(jī)制為低氧閾刺激促進(jìn)NSC 的增殖分化提供理論依據(jù)，但針對其詳細(xì)機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

NSC 作為各種中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復(fù)過程中的種子細(xì)胞，其增殖與分化在此過程中扮演著不可取代的角色，目前在低氧閾刺激下NSC的增殖和分化機(jī)制研究并不充分。而眾多研究表明，低氧閾刺激可能成為NSC體外擴(kuò)增的可行手段，在未來的實驗研究和臨床應(yīng)用中有著廣闊的前景。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突