間充質(zhì)干細胞來源外泌體促進皮膚損傷創(chuàng)面修復的作用及機制研究進展

叢海燕 王 娜 常 鑫 王海濤 楊金存

1.山東大學附屬威海市立醫(yī)院中心實驗室，山東 威海 264200；2.大連醫(yī)科大學檢驗醫(yī)學院，遼寧 大連 116044；3.山東大學附屬威海市立醫(yī)院燒傷整形科，山東 威海 264200；

皮膚是人體最大的器官，其主要功能是保護人體免受病原體的侵襲。糖尿病或大面積燒傷等因素經(jīng)常會損傷皮膚，不僅給患者帶來身體和精神上的痛苦，還會造成巨大的社會經(jīng)濟負擔，因此，許多研究都在關(guān)注如何加速傷口愈合［1-2］。間充質(zhì)干細胞具有強大的增殖分化能力，目前已被廣泛應用于創(chuàng)傷修復和組織再生等研究中，且被證實具有良好的皮膚損傷修復功能。

雖然干細胞的更新修復能力較強，但在臨床應用中仍存在較多缺陷，包括：免疫原性過強，會引起機體排斥等不良反應［3］，引起治療效率低下［5］；分裂增殖能力強，有致瘤風險［4］；移植過程中涉及倫理問題。研究表明，干細胞移植后，只有少數(shù)干細胞通過分化來替代受損組織，其發(fā)揮作用的主要機制是依賴旁分泌改變局部微環(huán)境［6-7］。外泌體是干細胞旁分泌的重要組分，與干細胞相比具有免疫原性低、穩(wěn)定性高、活性高、不易致瘤等優(yōu)勢［8］，近年來引起廣泛關(guān)注，被應用到多種形式皮膚損傷的治療研究中。本文就各類間充質(zhì)干細胞外泌體在多種形式皮膚損傷中的治療應用及其作用機制的研究新進展進行綜述。

1 外泌體的生物學特性

外泌體是細胞通過特殊的內(nèi)吞外排機制主動向胞外分泌的一種直徑為30 ～100 nm的微型囊泡，幾乎所有的活細胞都可以分泌外泌體［9-11］。此外，外泌體還存在于唾液、血漿、尿液等多種類型的體液中［12-14］。外泌體主要由脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸構(gòu)成，脂質(zhì)構(gòu)成了外泌體的膜結(jié)構(gòu)，為外泌體提供了結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性并包裹著蛋白和核酸（miRNAs、mRNA、lncRNA等）等活性物質(zhì)。

正常細胞來源的外泌體能夠有效清除細胞代謝廢物并介導細胞間信息轉(zhuǎn)導，但某些特殊細胞分泌的外泌體，由于攜帶分泌細胞的特異性活性物質(zhì)，因此具有特殊的生物學功能，如腫瘤細胞來源的外泌體因攜帶特殊的miRNA，具有免疫學標志功能，可作為診斷標志物［15-16］。干細胞來源的外泌體含有干細胞分泌的多種蛋白和核酸，因此具有促進細胞分裂增殖、調(diào)節(jié)機體免疫反應等作用。

2 皮膚愈合的過程和機制

皮膚是附屬在體表外最大的器官，一些理化因素會造成皮膚的損傷，常見的有創(chuàng)傷、燙傷和燒傷，還有慢性疾病引發(fā)的皮膚損傷，如糖尿病引發(fā)的潰瘍。皮膚損傷的修復可以概括為以下4 個時期：①血液凝固期：損傷初期血小板和凝血因子被激活，啟動內(nèi)、外源性凝血途徑實現(xiàn)凝血；②炎癥反應期：中性粒細胞、單核細胞和巨噬細胞增多，通過吞噬異物和調(diào)節(jié)炎癥因子的釋放調(diào)控炎癥反應；③細胞增殖期：包括通過成纖維細胞增殖介導肉芽組織形成、通過角質(zhì)細胞介導再上皮化和通過內(nèi)皮細胞增殖介導血管生成等過程；④組織重塑期：隨著細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的分泌和肉芽組織的增生，成纖維細胞分裂合成大量膠原纖維，新生血管增多。后期在基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）作用下，降解ECM，膠原蛋白發(fā)生新陳代謝，最終導致瘢痕的形成［17］。

3 間充質(zhì)干細胞外泌體促進皮膚損傷修復的機制

皮膚愈合是一個復雜的過程，需要免疫細胞、上皮細胞、成纖維細胞和血管內(nèi)皮細胞等多種細胞以及各種生長因子協(xié)同發(fā)揮作用。外泌體攜帶間充質(zhì)干細胞的多種活性物質(zhì)，通過向靶細胞轉(zhuǎn)運活性蛋白和核酸等分子，在炎癥反應期、細胞增殖期和組織重塑期發(fā)揮作用，參與調(diào)控創(chuàng)面愈合過程中的炎癥反應、細胞增殖和遷移、血管生成與基質(zhì)重建等多個方面，促進創(chuàng)面愈合并抑制瘢痕形成［18-19］。

3.1 外泌體在炎癥反應期的作用及機制

炎癥反應是調(diào)控創(chuàng)面修復的重要階段，多種炎癥細胞和各種炎癥因子協(xié)同參與炎癥反應對抗感染。巨噬細胞是重要的炎癥細胞，具有促炎M1 和抗炎M2 兩個表型。研究顯示，間充質(zhì)干細胞外泌體可以促進巨噬細胞M2 極化，對抗皮膚損傷引起的炎癥反應，此過程中伴隨著各種炎癥因子表達量的變化。人骨髓間充質(zhì)干細胞外泌體（human bone marrow mesenchymal stem cell exosome, hBMSCEXO）可以通過激活PTEN/AKT 信號通路來促進巨噬細胞抗炎表型M2型極化，抑制促炎表型M1型極化，并且抑制促炎因子IL-1β和TNF-α的表達，促進抗炎因子IL-10 的表達，加快了糖尿病小鼠皮膚損傷的愈合［20］。在模擬炎癥狀態(tài)下，人臍帶血間充質(zhì)干 細 胞 外 泌 體（human umbilical cord bloodmesenchymal stem cell exosome, hucMSC-EXO）中特異表達的miRNA let-7b 通過TLR4/NF-κB/STAT3/AKT 信號通路穩(wěn)定調(diào)節(jié)巨噬細胞的極化，促使巨噬細胞向抗炎表型M2 型分化，減輕了炎癥反應并促進了糖尿病皮膚傷口的愈合［21］。hucMSCEXO的miRNA微陣列分析顯示，與成纖維細胞外泌體相比，hucMSC-EXO 中miR-21、miR-146a 和miR-181上調(diào)表達較顯著，通過文獻回顧，認為上述3種miRNA在傷口炎癥反應中具有炎癥調(diào)節(jié)的功能［22］，其中miR-181 的抗炎作用已被證實。hucMSC-EXO中的miR-181可以降低燒傷部位中性粒細胞和巨噬細胞的數(shù)量，抑制TLR4信號通路，抑制調(diào)控炎癥反應重要因子NF-κB/P65 和p-P65 蛋白的激活，阻止炎癥因子IL-1β 和TNF-α 的釋放，促進抗炎因子IL-10的表達，發(fā)揮抗炎作用［23］。

3.2 外泌體在促進細胞增殖期和抑制細胞凋亡中的作用機制

細胞增殖和皮膚再上皮化是創(chuàng)面愈合的關(guān)鍵，此階段依賴成纖維細胞和上皮細胞不斷增殖遷移。成纖維細胞增殖產(chǎn)生ECM，包括纖連蛋白和Ⅰ型、Ⅲ型膠原。上皮細胞增殖并向創(chuàng)面中心遷移，介導再上皮化，減少皮膚感染。

干細胞外泌體已被證實可以通過內(nèi)化途徑直接進入成纖維細胞促進其增殖遷移和膠原合成，進而促進傷口愈合［24］。脂肪間充質(zhì)干細胞外泌體（adipose-derived mesenchymal stem cell exosome,ADSC-EXO）進入成纖維細胞后，通過上調(diào)N-鈣黏素（N-cadherin）、細胞周期蛋白-1、增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、金屬蛋白酶1（metalloproteinase 1，MMP1）、堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）和轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor β1，TGF-β1）的表達刺激細胞增殖和膠原合成，加速皮膚創(chuàng)面愈合［25-26］。

外泌體還可以通過釋放活性物質(zhì)至受體細胞內(nèi)，實現(xiàn)對受體細胞增殖遷移的調(diào)控。hucMSCEXO中的Wnt4蛋白能激活wnt/β-catenin信號通路、Jagged1 蛋白能激活North 通路，促進角質(zhì)細胞和成纖維細胞的增殖和遷移及合成ECM的能力，促進創(chuàng)面愈合［27-28］。胎兒真皮間充質(zhì)干細胞外泌體（fetal dermal mesenchymal stem cell exosome, FDMSCEXO）的Jagged 1蛋白也可激活North通路發(fā)揮同樣的功效［29］。脂肪干細胞外泌體（adipose-derived stem cell exosome,AD-EXO）中的miR-21 可以激活PI3K-AKT 通路、lncRNA MALAT1 錨 定miR-124 可以激活wnt/β-catenin 信號通路，促進皮膚損傷模型中的角質(zhì)細胞和成纖維細胞的增殖、遷移，并抑制細胞凋亡［30-31］。hBMSC-EXO 中的lncRNA H19 在成纖維細胞中與miR-152-3p結(jié)合，抑制磷酸酶和張力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog，PTEN）的表達，同時激活PI3K/AKT 信號通路，促進成纖維細胞的增殖、遷移并抑制其凋亡，促進糖尿病小鼠傷口的愈合［32］。

3.3 促進血管再生

皮膚愈合的血管生成階段主要依賴內(nèi)皮細胞的增殖以及各類血管生成因子的相互作用。外泌體可直接作用于內(nèi)皮細胞，或通過調(diào)節(jié)血管生成相關(guān)的生長因子、細胞因子、趨化因子等的表達水平間接作用于內(nèi)皮細胞，促進血管形成，為新生組織提供營養(yǎng)和氧氣。

人胎盤來源間充質(zhì)干細胞（human placenta derived mesenchymal stem cells,PMSCs）分泌相當數(shù)量的促血管生成分子，可顯著改善糖尿病大鼠皮膚創(chuàng)面的血管生成。在此過程中，旁分泌機制發(fā)揮了重要作用，而該作用很可能是通過外泌體介導實現(xiàn)的［33］。Liu 等［34］發(fā)現(xiàn)hucMSC-EXO 通過血管生成素2（Ang-2）促進了血管內(nèi)皮細胞的遷移和成管能力，促進創(chuàng)面的血管生成。hBMSC-EXO 的蛋白組學分析結(jié)果顯示，外泌體中有1 927種蛋白質(zhì)，其中多種與血管生成相關(guān)，如血小板衍生生長因子、表皮生長因子、成纖維細胞生長因子以及NFk-B 信號通路蛋白等，可直接促進血管生成［35］。除了直接作用于血管內(nèi)皮細胞外，外泌體中攜帶的活性蛋白或核酸等，可以調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞內(nèi)的其他活性因子的表達，間接促進血管生成。如hucMSC-EXO 中的Wnt4 蛋白可以進入內(nèi)皮細胞，誘導內(nèi)皮細胞β-catenin 活化，增加PCNA、cyclin-D3和N-cadherin的表達，促進血管生成［27］。ADSC-EXO 富含miR-125a，可以抑制血管生成抑制因子DLL4 的轉(zhuǎn)錄和表達，通過促進內(nèi)皮尖端細胞的形成來促進內(nèi)皮細胞生成血管［36］。hucMSC-EXO 中miR-21-3p 高度富集，可以下調(diào)PTEN 和SPRY1 的表達進而調(diào)節(jié)PI3K/Akt 和ERK1/2 信號通路，實現(xiàn)內(nèi)皮細胞的促血管生成作用，但miR-21-3p 并不是hucMSC-EXO 發(fā)揮促血管生成作用的唯一介質(zhì)，其他信號分子可能也參與了這一過程［37］。

3.4 抑制瘢痕形成

瘢痕形成是傷口愈合的最后一個過程，瘢痕形成的主要機制是成纖維細胞顯著增生，膠原蛋白過度沉積，并合成細胞外基質(zhì)，導致病理性瘢痕形成。

ADSC-EXO注射后，小鼠創(chuàng)面組織學分析顯示，在傷口愈合的早期，外泌體增加了Ⅰ和Ⅲ型膠原的生成，而在后期，外泌體可能抑制膠原表達，以減少疤痕形成［25］。

Fang 等［38］在hucMSC-EXO 中發(fā)現(xiàn)一組特異性miRNA（miR-21、miR-125b 和miR-145）通 過 抑 制TGF-β/SMAD途徑，抑制TGF-β與相應受體結(jié)合，切斷細胞間的信號轉(zhuǎn)導，抑制肌成纖維細胞激活，減少肌動蛋白生成和膠原沉積，從而抑制瘢痕形成。hucMSC-EXO 還 可 以 遞 送14-3-3ζ 促 進p-LATS 和YAP結(jié)合，增強YAP磷酸化進而抑制Wnt/β-catenin通路的激活，從而限制真皮成纖維細胞的過度擴張和膠原沉積，抑制瘢痕的形成［39］。ADSC-EXO 通過調(diào)節(jié)III型和I型膠原比例調(diào)節(jié)膠原蛋白的沉積和排列，通過調(diào)節(jié)TGF-β3和TGF-β1比例調(diào)節(jié)成纖維細胞分化，減輕瘢痕形成。還可激活ERK/MAPK通路增加皮膚真皮成纖維細胞MMP3 的表達，導致MMP3 與基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑-1（tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-1，TIMP1）的比例增高，這也有利于ECM 的重塑，促進無瘢痕創(chuàng)面修復［40］。

4 外泌體調(diào)控在創(chuàng)面愈合中的應用

間充質(zhì)干細胞外泌體已被證實對皮膚創(chuàng)面愈合有顯著的促進作用。研究發(fā)現(xiàn)，近年來利用分子生物學手段或細胞工程技術(shù)對外泌體或干細胞進行預處理，會進一步提高外泌體的效能。

根據(jù)外泌體的生物相容性，通過電穿孔將miR-21-5p 模擬物加載到人脂肪干細胞外泌體（hASCEXO）中，調(diào)控后的外泌體通過Wnt/β-catenin 信號通路促進再上皮化、膠原重塑、血管生成和成熟，加速糖尿病創(chuàng)面愈合［41］。從過表達miR-126的骨髓間充質(zhì)干細胞中分離出的外泌體（Exo-miR-126），通過靶向PIK3R2 激活PI3K/Akt 信號通路，可促進人臍靜脈內(nèi)皮細胞的增殖、遷移和血管生成。在體內(nèi)給藥Exo-miR-126 顯著增加了毛細血管數(shù)量，加速創(chuàng)面愈合［42］。同樣，過表達lncRNA H19 和Nrf 2 的間充質(zhì)干細胞所分泌的外泌體都增強了糖尿病足的愈合效果［32，43］。以上研究表明，外泌體與特定功能的分子相結(jié)合是促進創(chuàng)面愈合新的手段和策略。

除直接搭載功能分子外，在干細胞培養(yǎng)階段，施加某些生物、化學、物理因素也可以影響并增強外泌體的創(chuàng)面修復能力。研究表明，經(jīng)新生兒血清培養(yǎng)的間充質(zhì)干細胞所分泌的BMSC-EXO 促進創(chuàng)面愈合的效果更佳［44］。經(jīng)阿托伐他汀（atorvastatin，ATV）預處理的ATV-BMSC-EXO，能促進血管的形成，可以更顯著地提高糖尿病大鼠傷口再生的能力［45］。由Fe3O4納米顆粒和靜磁場（static magnetic fields，SMF）預處理的骨髓間充質(zhì)干細胞所分泌的外泌體（mag-BMSC-EXO）中，miR-21-5p 高度富集，可通過抑制SPRY2，激活PI3K/AKT 和ERK1/2 信號通路，加速大鼠皮膚創(chuàng)面愈合，且愈合后的疤痕寬度更窄，血管生成增強［46］。

5 外泌體在創(chuàng)面治療中給藥方式的研究進展

目前，外泌體治療皮膚損傷常用的給藥方式為體內(nèi)注射和局部注射，但注射不能使外泌體與損傷部位直接接觸，還會因為體內(nèi)的清除效應，影響其功能的發(fā)揮［47］，因此，近年來研究者不斷嘗試新的生物支架，作為外泌體的緩釋載體，維持其在創(chuàng)面的生物活性，進一步加速創(chuàng)面愈合。其中，應用較多的載體為水凝膠。生物醫(yī)學水凝膠的結(jié)構(gòu)類似于天然的ECM，不僅具有良好的生物相容性，還能改變細胞生長的微環(huán)境。Wang 等［48］制成多功能FHE 水凝膠，ADSC-EXO 通過靜電作用加載到FHE水凝膠中。與單純的外泌體相比，該水凝膠可通過持續(xù)釋放外泌體，獲得更佳的促進創(chuàng)面愈合效果。Shi 等［49］利用殼聚糖和絲素制備成水凝膠海綿，并在此基礎(chǔ)上添加了外泌體，添加了外泌體的水凝膠可通過促進膠原蛋白的再上皮化、促進血管生成和神經(jīng)元長入，有效促進糖尿病大鼠皮膚創(chuàng)面愈合。另外，還有研究指出，外泌體與PF-127水凝膠［50］、海藻酸鹽水凝膠［51］、殼聚糖水凝膠［52］、負載了姜黃莪術(shù)多糖的殼聚糖/絲水凝膠［53］、天然甲基纖維素-殼聚糖水凝膠［54］等形式的水凝膠相結(jié)合，具有良好的機械性能、保水性、抗感染能力和細胞生物相容性，會更穩(wěn)定高效地發(fā)揮外泌體對創(chuàng)面的愈合效果。

6 小 結(jié)

本文綜述了間充質(zhì)干細胞外泌體的生物學特性及其在皮膚損傷修復方面的作用機制，綜上，外泌體對創(chuàng)面愈合的促進作用已得到充分的證實。間充質(zhì)干細胞外泌體與干細胞相比具有高穩(wěn)定性、高效性等優(yōu)勢，最重要的是外泌體具有可調(diào)控性，可以通過多種調(diào)控手段調(diào)控其內(nèi)部活性物質(zhì)的種類和含量，以增強其創(chuàng)面愈合的效果。外泌體與生物載體的結(jié)合，能使其更高效穩(wěn)定地發(fā)揮療效。

雖然現(xiàn)有研究展示了外泌體的廣闊應用前景，但目前仍存在諸多問題阻礙其臨床應用：一方面是外泌體的內(nèi)容物和功能受分泌細胞種類和狀態(tài)的影響，涉及的信號通路錯綜復雜，尚未完全透徹闡明；另一方面是外泌體的提取鑒定操作復雜且沒有統(tǒng)一標準，不能規(guī)?；蜆藴驶a(chǎn)。因此，目前外泌體對創(chuàng)面愈合的研究只停留在實驗室探索階段。今后，需要更多的研究來進一步闡明間充質(zhì)干細胞外泌體促進創(chuàng)面愈合的機制，并進一步革新其制備與純化技術(shù)，探究其在臨床治療中發(fā)揮的功效，進一步推動其在再生修復領(lǐng)域發(fā)揮作用。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突