潰瘍性結(jié)腸炎體外模型研究進展

白金霞 張 婷 盧美琪 盧 貞

1.新泰市人民醫(yī)院，山東 泰安 271200；2.山東省康復醫(yī)院，山東 濟南 250109；3.山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，山東 濟南 250014

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種累及結(jié)腸、直腸的慢性非特異性炎癥性疾病，UC的臨床表現(xiàn)主要包括腹痛、腹瀉、便血、發(fā)熱、關節(jié)疼痛等［1］。研究證實，基因、環(huán)境、腸道微生物和自身免疫因素共同參與UC 的發(fā)?。?-2］。據(jù)推測我國UC 患病率為11.6/10萬［3］，并且隨著國人飲食結(jié)構(gòu)和生活方式的改變，近年來UC 發(fā)病率逐年增高［4］，例如在我國香港地區(qū)UC 的發(fā)病率從1997 至2006年增長了近3 倍［5］。UC 對患者的生活、工作造成嚴重影響，且一旦起病往往遷延難愈，而長期UC患者又有著較高的癌變風險［6］，對患者及其家庭帶來了巨大的心理負擔。UC 的治療已成為廣大臨床和科研工作者亟待解決的醫(yī)學問題。

目前，人們對疾病的研究以及藥物等對疾病的治療作用主要從3 個方面進行：一是在國家法律和社會倫理規(guī)定的范圍內(nèi)，在臨床開展試驗直接對患者進行相應生化指標、組織學或病理學等方面的檢測，還可進一步對患者使用藥物和各種治療方法進行干預；二是在遵守實驗動物3R 原則和相關條例的前提下，進行藥理、毒理、代謝等動物實驗以獲取相應數(shù)據(jù)；三則是在體外進行實驗，即選用離體組織、細胞或采用相關細胞復制疾病模型，以觀察藥物或各種致病因素對模型的干預情況。體外實驗具有實驗時間短、操作便捷、易于觀察、可控性好、減少實驗動物的使用等優(yōu)點，但體外實驗的研究結(jié)果能否完全推及到完整生物體內(nèi)，仍需進一步實驗以驗證。就UC 而言，研究多集中于臨床試驗和動物實驗，而在體外實驗層面的文獻相對較少，故現(xiàn)將通過細胞實驗體外評價抗UC的研究作一綜述。

1 UC模型細胞株的選擇

在建立某一體外細胞模型時，首先要對細胞株進行選擇，這主要取決于藥物的作用機理及其目標作用部位，通常選擇藥物作用于機體所在部位的組織細胞，以更好地模擬出藥物作用于機體體內(nèi)目標部位的效果［7］。UC病變主要累及結(jié)腸和直腸，但由于體外原代培養(yǎng)結(jié)腸上皮細胞存在技術(shù)上的難關，現(xiàn)在主要使用結(jié)腸癌細胞株進行研究［8］。人結(jié)腸腺癌細胞系Caco-2來源于人類直腸和結(jié)腸癌細胞，在標志酶、形態(tài)學的功能表達及滲透性等方面與小腸上皮細胞具有相似性［9］。因培養(yǎng)在微孔濾膜上的Caco-2 細胞構(gòu)建的藥物體外吸收過程與口服藥物在腸道的吸收過程具有良好的相關性，Caco-2 細胞已經(jīng)成為研究藥物吸收、代謝最經(jīng)典的體外模型之一，也是目前為止最好的腸道轉(zhuǎn)運模型和上皮轉(zhuǎn)運模型。研究發(fā)現(xiàn)，Caco-2細胞能被多種因素誘導促進炎癥因子的釋放，眾多國內(nèi)外研究者將其用作UC 體外模型的復制。唐立海［10］觀察了中藥湯劑潰結(jié)靈的含藥血清對Caco-2細胞炎癥模型NF-κB p65結(jié)合活性的影響等，在細胞層面探究UC 的發(fā)病機制、潰結(jié)靈對UC的治療作用以及潰結(jié)靈對UC治療的可能作用機理。Violeta 等［11］對Caco-2 細胞復制的炎癥條件下腸上皮的屏障功能開展實驗，并闡述了其作為良好腸屏障模型的依據(jù)，具體表現(xiàn)為具有功能性細胞旁連接和頂端膜上發(fā)育良好的微絨毛等。蘭丹鳳［12］將Caco-2細胞培養(yǎng)、融合、分化，形成腸上皮細胞屏障，并在IL-1β的刺激下，建立起炎癥損傷模型，對GC-C 信號通路對人腸上皮細胞屏障的影響及在炎癥損傷中的作用進行了研究。

同樣源自人結(jié)腸癌細胞的還有HT-29人結(jié)腸癌上皮細胞株。沈洪等［13］對清腸化濕方基于NF-κB/Tolls 通路治療UC 的作用機制研究正是采用HT-29細胞株制備炎癥模型進行的。此外，王慶文［14］的研究通過脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導HT-29的實驗反應，證實了朊蛋白表達量低的細胞株更容易被誘導出促炎癥因子這一結(jié)論。除此之外，人急性粒細胞白血病細胞系THP-1細胞也被用作UC 細胞模型的建立［15-16］，但研究數(shù)量相對較少。

RAW264.7 細胞作為一種巨噬細胞，能被LPS誘導產(chǎn)生促炎因子，是體外研究炎癥反應及抗炎機制的一種普遍模型［17］。一項研究對巨噬細胞RAW264.7被誘導后產(chǎn)生的促炎細胞因子表達差異及NF-κB p65 磷酸化水平高低等方面進行比較，證實了鵝掌楸苷的體外抗UC 的 活 性［18］。Mutenta等［19］考慮抗炎癥反應是炎癥性腸病的治療靶點，以LPS 誘導RAW264.7 巨噬細胞為模型，研究發(fā)現(xiàn)了一種南非特有藻類具有抗炎作用。同樣，Kim［20］完成了對靛玉紅-3-單肟（I3M）抗炎作用的研究，即通過LPS 刺激RAW264.7 細胞24 h 后復制UC 體外炎癥細胞模型，發(fā)現(xiàn)I3M 的抗炎作用與下調(diào)NF-κB 和MAPK通路的激活相關。大黃酸的體外抗?jié)冃越Y(jié)腸炎活性的實驗，是通過減少LPS 誘導的RAW264.7 巨噬細胞中促炎細胞因子（IL-6、IL-1β、TNF-α）的表達，抑制NF-κB 活化實現(xiàn)的［21］。Kim等［22］的研究采用Caco-2 細胞和RAW264.7 巨噬細胞共培養(yǎng)體系建立腸道炎癥體外模型，簡而言之，可記錄為“Caco-2 細胞在具有半透性支持膜的6 孔細胞培養(yǎng)插入物中生長，將鼠RAW 264.7巨噬細胞在6 孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，然后將含有Caco-2 細胞的培養(yǎng)插入物置于6孔板中以建立共培養(yǎng)系統(tǒng)”，并認為該模型在細胞水平類似人結(jié)腸炎。

李進安等［23］將人腸黏膜組織內(nèi)淋巴細胞分離，IL-12誘導其促炎因子升高，將制備好的大鼠含藥腦脊液作用于人體外細胞，證實了四君子湯含藥腦脊液具有抑制UC患者腸黏膜淋巴細胞的功能。還有研究通過采集受試者外周血淋巴細胞培養(yǎng)［24］，給予刺激物和藥物干預的方式，探討黃芩苷的體外免疫調(diào)節(jié)作用。董文毅等［25］也是通過分離人外周血淋巴細胞/單核細胞，經(jīng)細胞培養(yǎng)與人腸道厭氧菌抗原刺激后，加入中藥煎劑，檢測調(diào)節(jié)性T 細胞分化情況，并篩選出黃芪、丹參為UC組方的首選中藥。

2 UC模型致炎致?lián)p劑的選擇

LPS是目前體外復制UC模型使用最為廣泛的致炎劑之一。當LPS信號傳入細胞后，可以通過細胞內(nèi)信號傳遞，發(fā)生級聯(lián)反應，使基因表達發(fā)生變化，誘導多種促炎因子（如TNF-α、IL-1、IL-6等）的合成及釋放［26-27］。董旭旸［28］通過對人結(jié)直腸腺癌細胞系DLD-1 體外實驗探討基質(zhì)Gla 蛋白在UC 發(fā)病中的作用，證實5 μg/mL 的LPS 刺激細胞24 h 后可以成功建立模型。利用LPS刺激巨噬細胞產(chǎn)生炎癥反應是在細胞層面用來測評活性因子抗炎功效的經(jīng)典模型［29］，劉麗娟等［17］和陳宇等［29］選取LPS 刺激小鼠單核巨噬細胞RAW264.7，LPS 的作用濃度和作用時間分別為10 mg/L，24 h 和1 mg/L，12 h。劉超［30］在使用濃度為0.1 mg/L的LPS刺激RAW264.7細胞24 h 后，ELISA 法測定細胞上清促炎因子的含量增多，證實模型復制成功，而一項對白芨多糖體外治療UC的研究選用0.1 mg/L的LPS，作用時間48 h［31］。多數(shù)實驗均采用1 mg/L的LPS誘導RAW264.7細胞塑造UC 體外模型［32-33］。前文所述大黃酸體外抗炎活性的研究中，LPS 刺激RAW264.7 所用的濃度亦為1 mg/L（1 μg/mL），作用時間為24 h［21］。另外，還有研究選用U937 細胞株，先經(jīng)佛波酯誘導成為巨噬細胞后，再用2 mL濃度為1 μg/mL的LPS刺激，結(jié)果提示白術(shù)黃芪湯具有體外抗炎作用［34］。KE 等［35］為了進一步闡明清化腸飲的體外抗炎活性，用濃度為1 μg/mL的LPS刺激Caco-2細胞24 h，ELISA法測定IL-6 的含量；Western blot 法分別測定LPS（1 μg/mL）刺激30 min后，Caco-2細胞的p-STAT3、p-JAK1/2和24 h 后的SOCS3 的表達，評價其對UC 細胞模型中IL-6/STAT3/SOCS3信號通路的影響。

其他常用的致炎劑還包括腫瘤壞死因子、干擾素、白細胞介素等。研究發(fā)現(xiàn)，干擾素-γ（INF-γ）或TNF-α預處理后的腸上皮細胞增強LPS誘導產(chǎn)生的促炎細胞因子［36］，趙青春等［8］、沈洪等［13］的課題組以TNF-α、LPS 共同刺激誘導HT-29 細胞炎癥模型，使用hTNF-α（20 ng/mL）孵 育12 h 后，再給 予LPS（1 μg/mL）孵育15 h 來建立UC 模型組。王春賽爾［37］選取了1 株結(jié)腸正常上皮細胞（CCC-HIE-2 細胞）和2 株結(jié)腸癌細胞（Caco-2、HCT-116 細胞），對UC 及其癌變展開研究，確定了IL-6和TNF-α 的最佳刺激濃度及時間均為50 ng/mL，6 h。亦有報道稱白細胞介素-1β（IL-1β）對Caco-2細胞系的激活作用強于TNF-α 和LPS，可以用來復制腸上皮炎癥細胞模型［38-39］。

除上述所列舉的常用致炎劑以外，過氧化氫（H2O2）也被用作UC體外模型的刺激物。Wang等［40］選用濃度為200 μl/L 的H2O2刺激鼠腸上皮IEC-6 細胞4 h，觀察藥物抑制H2O2誘導IEC-6 細胞凋亡和caspase-3活化的過程。此外，張涵等［41］采用三硝基苯磺酸對大鼠進行灌胃復制UC模型，3 d后取血分離血清作為損傷劑，用于Caco-2 細胞模擬UC 炎癥損傷細胞模型。

3 UC炎癥模型建立的檢測指標

目前，對UC 體外細胞模型建立的評價多是從確認促炎因子的表達升高入手，常用的指標有IL-1（IL-1β）、IL-6、IL-8、TNF-α、INF-γ 等。研究發(fā)現(xiàn)UC患者體內(nèi)存在多種促炎細胞因子水平的增加，并與UC 的發(fā)病相關，故對體外模型促炎因子表達水平的測定，也是在UC發(fā)病理論指導下，基于盡可能復制體內(nèi)環(huán)境進行的［42-45］。正如一項研究通過LPS誘導RAW264.7 細胞構(gòu)建UC 體外炎癥模型［46］，就是以IL-6/TNF-α指標評價模型的建立，探討靛藍的體外抗炎活性的。

4 結(jié) 語

UC 細胞實驗是在現(xiàn)代細胞分離、培養(yǎng)等技術(shù)日臻完善的基礎上發(fā)展而來的，相較于臨床試驗和動物實驗起步較晚，沒有較為系統(tǒng)、統(tǒng)一的構(gòu)建模式和評價方式，但目前就UC 發(fā)病和治療的細胞實驗研究以其不可取代的優(yōu)勢，正呈現(xiàn)出日益增多的趨勢。

總之，目前關于UC 的細胞實驗研究尚處于起步階段，深入系統(tǒng)地進行此方面的研究有助于從體外、細胞生物學的角度探討UC 的發(fā)病機制，填補UC在體動物實驗與臨床試驗的不足，對UC的發(fā)病機制、用藥選擇和療效評價提供更多的實驗方式選擇。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突