食品中合成色素和違禁染料色譜檢測的分析研究

◎ 沈昌瑩，蘇駿敏，張樹權(quán)，莫淑梅

（東莞市食品藥品檢驗(yàn)所，廣東 東莞 523808）

色澤是影響人們選擇食品的重要因素。天然色素由于其對光、熱、酸和堿等因素敏感，所以在加工、貯存過程中易褪色和變色，影響食品的感官性能[1]。目前，在食品生產(chǎn)過程中，大多數(shù)商家因天然色素成本較高而選擇使用合成色素，也有部分商家使用食品違禁染料給食品著色。合成色素主要是指偶氮類化合物，如檸檬黃、新紅、莧菜紅、胭脂紅和日落黃等和非偶氮類化合物，如亮藍(lán)、赤蘚紅等常用于食品著色的人工合成有機(jī)色素，違禁染料主要是指羅丹明B、蘇丹紅Ⅰ～Ⅳ、酸性橙Ⅱ等不得用于食品著色的工業(yè)染料[2]。

與天然色素相比，合成色素和違禁染料具有價(jià)格低、著色穩(wěn)定、易獲取等優(yōu)點(diǎn)，但其具有毒性，尤其偶氮類合成色素的致癌作用明顯，其化合物在人體內(nèi)分解，形成的芳香胺代謝后與靶細(xì)胞作用，形成腫瘤[3]。當(dāng)人體攝入大量的合成色素時，還會出現(xiàn)噯氣、偏頭痛、多種過敏癥狀和中毒等癥狀以及影響兒童的智力，導(dǎo)致兒童IQ值下降[4-6]。違禁染料主要適用于溶劑、油、蠟和汽油增色以及鞋、地板等的增光，多為可誘發(fā)人體癌變，引發(fā)人體皮膚、黏膜或呼吸道過敏的致癌和致敏染料[7]。由此可見，合成色素和違禁染料的濫用都會嚴(yán)重?fù)p害消費(fèi)者的生命健康。目前，各檢測機(jī)構(gòu)主要使用色譜方法對食品中的合成色素和違禁染料進(jìn)行檢測，而且對檢測結(jié)果進(jìn)行判定的依據(jù)比較明確。對于合成色素，《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》（GB 2760—2014）中限定了其在不同食品中的使用量；對于違禁染料，食品整治辦〔2008〕3號和整頓辦函〔2011〕1號中列出的食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)名單中明確指出羅丹明B、蘇丹紅、酸性橙Ⅱ等不得在食品中添加。商家在食品生產(chǎn)過程中是否會依據(jù)相應(yīng)法律法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定使用合成色素和違禁染料，還需要檢測機(jī)構(gòu)確保檢測過程的準(zhǔn)確、穩(wěn)定、可重復(fù)和靈敏度。本文針對目前的檢測形勢和需求，從自身的檢測經(jīng)驗(yàn)出發(fā)，綜合參考其他研究文獻(xiàn)，綜述食品中合成色素和違禁染料色譜檢測的研究進(jìn)展，為檢測人員改善檢測方法提供參考。

1 檢測方法

目前，常用于食品中合成色素檢測的標(biāo)準(zhǔn)方法主要是《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中合成著色劑的測定》（GB 5009.35—2016）、《肉制品 胭脂紅著色劑測定》（GB/T 9695.6—2008）和《食品中誘惑紅、酸性紅、亮藍(lán)、日落黃的含量檢測 高效液相色譜法》（SN/T 1743—2006）。常用于食品中違禁染料檢測的標(biāo)準(zhǔn)方法主要是《進(jìn)出口食品中羅丹明B的檢測方法》（SN/T 2430—2010）、《食品中羅丹明B的測定》（BJS 201905）、《出口食品中酸性橙Ⅱ號的檢測方法》（SN/T 3536—2013）和《食品中蘇丹紅染料的檢測方法》（GB/T 19681—2005）。在實(shí)際開展檢測時，各個標(biāo)準(zhǔn)方法常用于檢測的食品類型見表1。

2 合成色素

2.1 樣品前處理與分析檢測

2.1.1 GB 5009.35—2016中合成色素的測定

合成色素的標(biāo)準(zhǔn)檢測方法中常用聚酰胺吸附法，其原理是利用聚酰胺粉在酸性條件下對色素有比較好的吸附性，吸附樣品提取上清液中的色素，倒入G3砂芯漏斗中抽濾，用熱的pH=4的水溶液或檸檬酸溶液淋洗聚酰胺粉，洗去聚酰胺粉中的糖等雜質(zhì)，再用甲醇-甲酸溶液洗去聚酰胺粉中可能吸附的天然色素，水洗聚酰胺粉至中性后，用乙醇氨水溶液將聚酰胺粉吸附的合成色素解吸附，得到純化的合成色素提取溶液，由于赤蘚紅溶于甲醇，使用甲醇-甲酸混合溶液進(jìn)行色素洗脫，很容易將樣品中的赤蘚紅除去，因此《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中合成著色劑的測定》（GB 5009.35—2016）中還針對含有赤蘚紅的樣品提出了液-液分配法，其原理是用三正辛胺-正丁醇溶液提取合成色素，經(jīng)飽和硫酸鈉溶液洗滌，用正己烷和氨水溶液進(jìn)行液-液分配得到純化的合成色素溶液。這兩種方法都是在配備了二極管陣列檢測器的高效液相色譜儀中測定，利用得到的光譜圖和校正曲線能準(zhǔn)確地進(jìn)行定性與定量。在用《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中合成著色劑的測定》（GB 5009.35—2016）中的聚酰胺法測定合成色素時，由于后續(xù)需要在G3砂芯漏斗中抽濾，因此需要先獲得樣品的上清水溶液，而液體狀的飲料、經(jīng)稀釋的飲料濃漿、糖果（硬質(zhì)糖果、壓片糖果、硬質(zhì)型奶糖和淀粉軟糖等）和蜜餞等的提取液經(jīng)高速離心后都能取得比較清澈的上清液，而高蛋白固體飲料的水提取溶液經(jīng)高速離心，用檸檬酸溶液調(diào)節(jié)pH值后，又會出現(xiàn)渾濁現(xiàn)象，如果此時用聚酰胺粉吸附后用G3砂芯漏斗抽濾，G3砂芯漏斗在抽濾時很容易被堵塞導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)難以繼續(xù)進(jìn)行，根據(jù)施正華等[8]、鄧國龍等[9]利用等電點(diǎn)沉淀法使蛋白質(zhì)沉淀的研究，高蛋白固體飲料的水提取溶液雖然經(jīng)高速離心，但是上清液中仍存在大量蛋白質(zhì)，用檸檬酸調(diào)節(jié)pH值并加熱后，蛋白質(zhì)發(fā)生了沉淀反應(yīng)。因此，在測定高蛋白固體飲料中的合成色素時，在加水提取固體飲料后，先用檸檬酸調(diào)節(jié)pH并加熱，再經(jīng)高速離心，再在G3砂芯漏斗中抽濾時，可以明顯改善抽濾效果。在用《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中合成著色劑的測定》（GB 5009.35—2016）中的液-液分配法測定合成色素時，檢測人員出現(xiàn)回收率低和精密度差的情況，這與三正辛胺試劑的純度有關(guān)，試驗(yàn)證明三正辛胺試劑的純度影響提取效果，純度高時提取合成色素效果好，因此在配制三正辛胺-正丁醇溶液溶液時應(yīng)盡量選擇色譜純及以上純度[10]。此外，還應(yīng)在每次提取時都加入鹽酸，能明顯提高提取效率，若只在第一次提取時加入，后續(xù)提取時不加入，則要分液多次才能提取完全，而在每次提取時都加入鹽酸，分液次數(shù)減少亦可提取充分；若采用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行多種合成色素分析測定時，出現(xiàn)檸檬黃和新紅的目標(biāo)峰分離效果差的情況，可以嘗試改用Thermo Hypersil GOLD C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱[11]或者TechMate C18-ST（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，檸檬黃和新紅的分離度得到改善并且不影響其他合成色素的分離。

2.1.2 GB/T 9695.6—2008中胭脂紅的測定

在使用GB/T 9695.6—2008第一法測定肉制品中的胭脂紅時，在肉制品中加入預(yù)處理好的海砂研磨，用石油醚除脂后用乙醇氨水溶液多次提取，提取液經(jīng)過濃縮后加入硫酸溶液和鎢酸鈉溶液沉淀蛋白質(zhì)，再用聚酰胺粉吸附，經(jīng)G3砂芯漏斗淋洗和洗脫，洗脫液蒸至近干后定容得到上機(jī)溶液。由于肉制品中含有油脂，不除油脂會導(dǎo)致G3砂芯漏斗堵塞，因此整個實(shí)驗(yàn)過程煩瑣，不利于批量化檢測，而且實(shí)驗(yàn)過程對石油醚的用量大，究其原因是除油脂效率低；在趙海峰等[12]的研究中，加入石油醚與肉制品提取液混合，經(jīng)冷凍離心除去脂肪；在實(shí)際檢測時，發(fā)現(xiàn)低溫對肉制品提取液除脂效果好，因此稱取肉制品樣品至離心管后，加入乙醇氨水溶液振蕩提取，可以將離心管放置在4 ℃冰箱中過夜或放置在-20 ℃冰箱中1 h，再經(jīng)離心機(jī)在4 ℃條件下高速離心，最終得到的提取液中油脂含量大量減少，在后續(xù)使用G3砂芯漏斗抽濾時，不會發(fā)生堵塞，節(jié)約了前處理的時間和石油醚的使用；肉制品中胭脂紅的檢測還需要考慮特殊樣品的均勻提取問題，如豬鞭或含筋較多、韌性強(qiáng)的肉制品等，普通的碎樣機(jī)器無法將其打碎，而且普通碎樣機(jī)器長時間碎樣會導(dǎo)致樣品溫度升高，得到的待測樣顆粒仍比較大，可以使用液氮粉碎機(jī)碎樣，其可以將肉制品冷凍到質(zhì)地變脆再碎樣，粉碎細(xì)度可以達(dá)到100～300目或更細(xì)，從而保證樣品的均勻性。

2.1.3 糖果中合成色素的測定

在使用GB 5009.35—2016和SN/T 1743—2006檢測糖果中的合成色素時，需要關(guān)注特殊樣品如膠基糖果、多種顏色的凝膠糖果和棉花糖等，這些類型的樣品在碎樣時會出現(xiàn)樣品不均勻的情況，因此也可以使用液氮粉碎機(jī)碎樣，稱樣后加水加熱溶解提取，再經(jīng)離心除去膠基等雜質(zhì)，保證樣品均勻性的同時減少對后續(xù)的提取和純化的影響。

2.2 檢測方法比較與適用性

合成色素常用的標(biāo)準(zhǔn)檢測方法以聚酰胺法和液-液分配法為主，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差一般都在10%以內(nèi)。其中GB 5009.35—2016適用的食品類型多，但除了液體飲料、飲料濃漿和糖果等基質(zhì)中的合成色素普遍回收率可達(dá)到80%～110%，其他基質(zhì)的合成色素回收率普遍在50%～80%，而且對含有赤蘚紅的樣品，要另采用液-液分配法，增加了批量檢測的時間。SN/T 1743—2006的步驟相對簡單，但只適用于飲料和糖果，雖然用在檢測酸性紅、日落黃時回收率可達(dá)到80%～100%，但亮藍(lán)回收率為60%～70%。用GB/T 9695.6—2008可以測定肉制品中的胭脂紅，但是胭脂紅的回收率為60%～80%。若以80%的回收率判定方法回收高低，則標(biāo)準(zhǔn)方法仍需進(jìn)一步優(yōu)化。

目前，關(guān)于合成色素檢測方法的研究眾多，陳連梅等[13]建立了固相萃取-HPLC法同時測定肉制品中莧菜紅、胭脂紅、日落黃和誘惑紅含量，樣品用乙醇氨水（7+2+1，V/V/V）溶液2次提取肉制品中的合成色素，加入水飽和正己烷與提取液混合后經(jīng)濃縮除去脂肪，經(jīng)P-WAX固相萃取柱凈化進(jìn)行測定，各組分分離好，回收率為66.7%～99.7%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.9%～3.6%，其中胭脂紅的回收率為82.4%～99.7%，比GB/T 9695.6—2008的實(shí)際回收率高，可檢測的合成色素多了3種，但該方法同樣只適用于肉制品。林芳等[14]建立了固相萃取（SPE）-超高效液相色譜法同時測定蜜餞中9種合成色素，樣品用乙醇氨水（7+2+1，V/V/V）溶液多次提取肉制品中的合成色素，80 ℃水浴氮吹濃縮后經(jīng)混合型陰離子交換柱凈化，用2%氨化甲醇（V/V）洗脫，洗脫液在50 ℃水浴氮吹至近干后，加水復(fù)溶進(jìn)行測定，根據(jù)合成色素出峰時間分成4組，分別采用適合的波長進(jìn)行測定，9種合成色素的回收率為80.1%～98.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.8%～4.3%，比GB 5009.35—2016的實(shí)際回收率好，可檢測的合成色素多了2種，并且同一種前處理方法適用于赤蘚紅的檢測，但是該方法僅適用于蜜餞的測定。劉麗等[15]建立了QuEChERS-HPLC快速測定食品中7種食用合成色素，樣品采用乙醇氨水（7+2+1，V/V/V）提取，混合使用C18和PSA兩種基質(zhì)分散凈化劑凈化，離心后取10 mL上清液用冰乙酸調(diào)節(jié)pH至中性后蒸發(fā)至近干，加水復(fù)溶得到待測液，分2組采用2種檢測波長進(jìn)行測定，平均回收率在83.01%～109.65%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差4.64%～15.23%，該方法相比國家標(biāo)準(zhǔn)方法極大縮短了樣品前處理時間，節(jié)約人力，采用可見區(qū)波長檢測，減少干擾，綜合性強(qiáng)，但僅適用于豆制品和肉制品，且比GB 5009.35—2016少了新紅的測定。

3 違禁染料

3.1 樣品前處理與分析檢測

3.1.1 SN/T 2430—2010中羅丹明B的測定

SN/T 2430—2010檢測辣椒、辣椒粉、辣椒油中的羅丹明B，原理是用乙酸乙酯-環(huán)己烷（1+1，V/V）提取樣品中的羅丹明B，經(jīng)過凝膠色譜凈化系統(tǒng)凈化，洗脫液經(jīng)40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，用甲醇復(fù)溶后使用高效液相色譜-熒光測定，若檢出則用40%甲醇水復(fù)溶后使用高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜確證，凝膠滲透色譜系統(tǒng)使用前后應(yīng)用乙酸乙酯-環(huán)己烷（1+1，V/V）清洗凝膠色譜柱，避免殘留雜質(zhì)的影響，多樣品同時凈化要注意收集流出液的時間，時間過短會導(dǎo)致?lián)p失，時間過長會影響凈化效果。

3.1.2 BJS 201905中羅丹明B的測定

BJS 201905檢測花椒、花椒粉、花椒油和半固體調(diào)味料中的羅丹明B，原理是用含0.1%甲酸的甲醇水溶液提取，提取液經(jīng)混合型陽離子（MCX）固相萃取柱凈化，洗脫液在45 ℃下氮吹至近干，含0.1%甲酸的乙腈水復(fù)溶后使用高效液相色譜-熒光測定，若檢出則使用高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜確證，在提取黏性較大的半固體調(diào)味料時，若采用振搖提取，在提取液中加入陶瓷均質(zhì)子可提高樣品分散效果，使提取充分。

3.1.3 GB/T 19681—2005中蘇丹紅的測定

GB/T 19681—2005檢測蘇丹紅Ⅰ～Ⅳ的原理是正己烷提取樣品中的蘇丹紅染料，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，經(jīng)氧化鋁層析柱凈化，5%丙酮正己烷洗脫，洗脫液經(jīng)濃縮定容后使用高效液相色譜-二極管陣列檢測器測定，實(shí)驗(yàn)前要提前處理中性氧化鋁和填柱，填充氧化鋁層析柱后要用標(biāo)液驗(yàn)證每種蘇丹紅的回收率，判斷中性氧化鋁的活性，根據(jù)實(shí)際調(diào)整中性氧化鋁的量。

3.1.4 SN/T 3536—2016中酸性橙Ⅱ號的測定

SN/T 3536—2013檢測酸性橙Ⅱ號的原理是用乙醇氨水（7+2+1，V/V/V）溶液2次提取樣品中的酸性橙Ⅱ號，將提取液濃縮后，經(jīng)氨基陰離子交換固相萃取柱凈化，10%氨水甲醇溶液洗脫，洗脫液氮吹至干后水復(fù)溶，使用高效液相色譜-二極管陣列檢測器測定，若用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮方式，雞心瓶內(nèi)液體剩余20 mL時，會有氣泡向上沖，易造成交叉污染而且濃縮時間長，因此濃縮時選擇60 ℃水浴濃縮，濃縮時間明顯減短、濃縮速度不會太快導(dǎo)致蒸干且不易交叉污染，濃縮后的待凈化液直接用氨基陰離子交換固相萃取柱凈化，易造成堵塞，而濃縮液離心后再凈化可盡量避免此問題。

3.2 檢測方法比較與適用性

3.2.1 羅丹明B

標(biāo)準(zhǔn)方法SN/T 2430—2010檢測羅丹明B時提取簡單，但是需要經(jīng)過凝膠滲透色譜系統(tǒng)凈化和旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，耗時久，對乙酸乙酯-環(huán)己烷（1+1，V/V）用量大；BJS 201905檢測羅丹明B的方法提取簡單，凈化速度快且凈化效果好，回收率穩(wěn)定在100%左右，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在10%以下。在段鶴君等[16]的研究中，方法1采用正己烷溶解調(diào)味油，0.5%冰乙酸酸化乙腈溶液2次超聲提取，離心得到的提取液氮吹至近干，用乙腈-1%甲酸水（1+1，V/V）復(fù)溶，經(jīng)MCX固相萃取柱凈化，5%氨化甲醇洗脫，洗脫液氮吹至近干后用甲醇-水（50∶50，V/V）復(fù)溶后，用高效液相色譜熒光檢測器進(jìn)行測定，平均回收率為84.2%～94.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.5%～2.9%；方法2采用20%丙酮正己烷2次超聲提取調(diào)味油油，經(jīng)中性氧化鋁固相萃取柱凈化，2%氨水甲醇溶液洗脫，洗脫液40 ℃氮吹至近干后甲醇復(fù)溶后，使用高效液相色譜熒光檢測器進(jìn)行測定，平均回收率為84.9%～92.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.0%～2.1%。這兩個方法都是采用固相萃取的方式凈化，比用GPC凈化節(jié)省時間和有機(jī)試劑，但是僅適用于調(diào)味油，因此對于辣椒油和花椒油可以采用此方法檢測羅丹明B。

3.2.2 蘇丹紅

GB/T 19681—2005檢測蘇丹紅染料時需要自己填充和驗(yàn)證層析柱，凈化效果不穩(wěn)定。馮寅潔等[17]研究了3種蘇丹紅專用固相萃取柱高效液相色譜儀檢測食品中4種蘇丹紅染料的含量，發(fā)現(xiàn)Cleanert Sudan 固相萃取柱適用于淺色、低油脂食品的前處理，ProElut SDH固相萃取柱普遍適用于不同種類食品的前處理，CNW Poly-sery MIP-SDR固相萃取柱適用于辣椒粉以外的大部分食品的前處理，其中ProElut SDH 固相萃取柱的回收率為（83.7%±2.4%）～（90.5%±3.9%），還對常用于分析顏色深和高油脂的色譜柱的維護(hù)提出建議，如增加保護(hù)柱，分析后及時按乙腈-異丙醇-乙腈的順序沖洗色譜柱，對可以反沖的色譜柱進(jìn)行反沖等，該研究結(jié)合了實(shí)際應(yīng)用，分析深入、詳細(xì)且實(shí)用[17]。

3.2.3 酸性橙Ⅱ號

在用SN/T 3536—2013檢測醬鹵肉制品中酸性橙Ⅱ號時，使用氨基陰離子交換固相萃取柱的回收率低于80%，參考了馮寅潔等[18]和劉穎等[19]的研究，得出使用混合弱陰離子（Cleanert PWAX）固相萃取柱凈化能保證回收率和節(jié)約成本的結(jié)論。在蔣建榮等[20]用高效液相色譜-二極管陣列檢測器半定性定量結(jié)合UHPLC-MS/MS確認(rèn)陽性樣品測定熟食制品中的酸性橙Ⅱ號的研究中，用70%乙腈水快速提取樣品，使用高效液相色譜-二極管陣列檢測器測定，對于陽性樣品再用另一品牌的弱陰離子（Waters Oasis WAX）固相萃取柱凈化，使用超高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜進(jìn)行確證和定量，該方法利用了酸性橙Ⅱ號不得在食品中添加的規(guī)定，建立了快速檢測的方法，提高了檢測效率，同時確保了陽性樣品的準(zhǔn)確定性和定量，但是Waters Oasis WAX固相萃取柱價(jià)格比Cleanert PWAX高，但對回收率的提升不大，批量檢測時采用Waters Oasis WAX固相萃取柱凈化將增加檢測的成本[18]。

4 結(jié)語

標(biāo)準(zhǔn)方法作為食品檢測機(jī)構(gòu)常用的檢測方法，實(shí)際應(yīng)用于食品中合成色素和違禁染料的檢測時仍存在不足。部分標(biāo)準(zhǔn)檢測方法前處理步驟復(fù)雜，消耗了大量的試劑和耗材，增加了檢測所需的時間，在批量化檢測時，成本高和效率低的缺點(diǎn)被放大，同時復(fù)雜的前處理還會導(dǎo)致回收率偏低；而標(biāo)準(zhǔn)檢測方法對可測定物質(zhì)的限定，導(dǎo)致同一種食品要用兩個方法進(jìn)行檢測，說明了標(biāo)準(zhǔn)檢測方法的局限性。隨著研究的深入，不同學(xué)者的研究結(jié)果為完善標(biāo)準(zhǔn)方法提供了有力的參考依據(jù)。食品色澤關(guān)聯(lián)食品安全，食品安全關(guān)乎人們的健康，基于食品中合成色素和違禁染料的濫用會損害人們的健康的事實(shí)，開發(fā)更準(zhǔn)確、更高效、更廣泛適用和更低成本的標(biāo)準(zhǔn)檢測方法是批量化檢測在未來發(fā)展的需求。因此，需進(jìn)一步探索食品中合成色素和違禁染料的檢測方法，減少人們對食品色澤的質(zhì)疑，規(guī)范商家對合成色素的使用，營造更良好的食品安全壞境。