結(jié)核分枝桿菌感染宿主相關(guān)生物標(biāo)志物研究進(jìn)展

曹景新 綜述，李 磊 審校

(西藏大學(xué)附屬阜康醫(yī)院：1.呼吸內(nèi)科；2.實驗室，西藏 拉薩 850000)

根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)發(fā)布的2018年全球結(jié)核病報告顯示，估計全球23%的人口(約17億)存在潛伏結(jié)核感染；2017年，全球范圍內(nèi)約有1 010萬例結(jié)核病新發(fā)病例，其中男580萬例，女320萬例；兒童100萬例，結(jié)核病死亡率約為16%(死亡人數(shù)約160萬)[1]。我國結(jié)核病患者數(shù)占全球結(jié)核病患者數(shù)的9%，是結(jié)核病第二高負(fù)擔(dān)國家，2017年估算我國結(jié)核病新發(fā)患者數(shù)為88.9萬例，死亡人數(shù)約為3.7萬例[1]。盡管許多國家已常規(guī)接種卡介苗，但該疫苗主要對兒童播散性結(jié)核病有效，對成人的療效仍存在較大爭議[2]。為了實現(xiàn)對結(jié)核病的全球控制，最重要的是開發(fā)有效的新型疫苗和縮短療程的新型藥物，同時，亦迫切需要開發(fā)一種低成本、微創(chuàng)、非痰、高度敏感和特異的結(jié)核病檢測方法，其最好采取易于獲取的生物樣本，如血液或尿液。另外，通過在治療早期和治療結(jié)束時能指示有效治療的生物標(biāo)志物，預(yù)測復(fù)發(fā)，可以極大地改善結(jié)核病臨床預(yù)后。結(jié)核病相關(guān)生物標(biāo)志物可分為結(jié)核分枝桿菌相關(guān)生物標(biāo)志物和結(jié)核分枝桿菌感染宿主產(chǎn)生的生物標(biāo)志物，本文主要針對后者的一些最新研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，特別是對活動性結(jié)核和潛伏性結(jié)核可進(jìn)行診斷或鑒別診斷，以及在結(jié)核病治療中可進(jìn)行效果監(jiān)測的生物標(biāo)志物。

1 宿主抗體對結(jié)核分枝桿菌抗原的應(yīng)答

感染和免疫力似一枚硬幣的兩面，當(dāng)結(jié)核分枝桿菌感染時，必然會激活宿主的免疫反應(yīng)，導(dǎo)致宿主生物標(biāo)志物的變化。宿主產(chǎn)生的病原體特異性抗體是診斷病原體常用的生物標(biāo)記物，主要優(yōu)勢為操作簡單、價格低廉，也可用于醫(yī)療保健。截至目前，針對結(jié)核分枝桿菌抗原[如結(jié)核菌素、人早期分泌抗原靶6抗體(ESAT-6)、人結(jié)核分枝桿菌(CFP-10)和熱休克蛋白]的特異性抗體已被廣泛研究[3]。但是，上述檢測方法表現(xiàn)出的靈敏度(14%～85%)和特異度(53.0%～98.7%)不佳[4-5]。同時，一些結(jié)核分枝桿菌抗原，比如ESAT-6和CFP-10不存在于卡介苗菌株的基因組中，因此檢測這些抗原的特異性免疫反應(yīng)可以區(qū)分結(jié)核分枝桿菌感染與疫苗接種反應(yīng)[6]。

近年來，幾種高抗原性結(jié)核分枝桿菌抗原(如Rv0310c-E和Rv1255c-E)已被證明可用于診斷，其靈敏度和特異度明顯升高。LUO等[7]研究結(jié)果表明，Rv0310c-E和Rv1255c-E特異性抗體IgG用于診斷結(jié)核分枝桿菌的敏感度和特異度[受試者工作曲線下面積(AUC)值分別為0.800和0.808]高于ESAT-6和CFP-10(AUC值分別為0.665和0.623)。而LPEZ-RAMOS等[8]研究表明，抗結(jié)核分枝桿菌抗原P12037抗體聯(lián)合sCD14診斷活動性肺結(jié)核的敏感度和特異度分別為92%和91%。另有研究發(fā)現(xiàn)，抗結(jié)核分枝桿菌抗原的抗體，如PPE17和MDP-1可以區(qū)分潛伏性結(jié)核病患者和活動性結(jié)核病患者[9-10]。MAEKURA等[10]研究表明，抗結(jié)核治療后MDP-1抗體持續(xù)升高可能與治療結(jié)束后復(fù)發(fā)有關(guān)，認(rèn)為MDP-1是一個潛在的治療監(jiān)測標(biāo)志物。但也有研究發(fā)現(xiàn)兒童對結(jié)核分枝桿菌抗原的抗體反應(yīng)普遍較低[4]。

2 宿主細(xì)胞因子對結(jié)核分枝桿菌抗原的應(yīng)答

相對于抗體反應(yīng)而言，針對結(jié)核分枝桿菌特異性抗原的細(xì)胞免疫反應(yīng)具有更好的一致性。結(jié)核菌素皮膚試驗(TST)已被廣泛用于診斷活動性結(jié)核和潛伏性結(jié)核，但由于交叉反應(yīng)，該試驗不能區(qū)分結(jié)核分枝桿菌感染、其他非結(jié)核分枝桿菌感染或卡介苗接種后反應(yīng)，同時，TST在免疫受損患者中的敏感性下降明顯。受結(jié)核分枝桿菌特異性抗原刺激，T細(xì)胞分泌干擾素-γ(IFN-γ)，其可提示過去或當(dāng)前感染結(jié)核分枝桿菌。近年來，IFN-γ釋放試驗(IGRA)已成為結(jié)核病診斷中較受歡迎的檢測方法，IGRA檢測的是結(jié)核分枝桿菌特異性抗原，如ESAT-6和CFP-10體外刺激全血后IFN-γ的產(chǎn)生。IGRA有2種檢測方式，一種是基于ELISA法的QuantiFERON-TB Gold(QFT)檢測，另一種是基于酶聯(lián)免疫斑點法(ELISPOT)的T-Spot檢測。相比之下，T-Spot檢測活動性結(jié)核的靈敏度(91.0%)比QFT的靈敏度(80.2%)更高[11]。總體而言，IGRA比TST具有更高的敏感度和特異度，同時，IGRA受人類免疫缺陷病毒(HIV)感染狀況的影響較TST小[12]。另有研究發(fā)現(xiàn)，從結(jié)核病特定部位(如胸腔積液、支氣管肺泡灌洗液和腦脊液)分離的外周血單核細(xì)胞進(jìn)行IGRA檢測具有很高的敏感度(90%)和特異度(100%)[13]?；顒有越Y(jié)核病患者的IGRA反應(yīng)一般比潛伏性結(jié)核病者更明顯，但I(xiàn)GRA不宜適用于活動性結(jié)核和潛伏性結(jié)核的鑒別診斷，因IGRA中應(yīng)用的抗原ESAT-6和CFP-10是結(jié)核分枝桿菌的分泌蛋白，容易在活動性感染期間出現(xiàn)[14]。ARROYO等[15]研究表明，在IGRA檢測中采用潛伏期相關(guān)抗原，即休眠生存調(diào)節(jié)子(DosR)和促進(jìn)復(fù)活因子(Rpf)更有益于鑒別結(jié)核病活動與否，DosR蛋白Rv2029c和Rpf蛋白Rv2389c被證明可以鑒別活動性結(jié)核和潛伏性結(jié)核，其敏感度分別為90%和85%。鑒于IGRA的敏感度和特異度，該檢測也被建議用作治療監(jiān)測工具。KANEKO等[16]研究顯示，治療結(jié)束時IGRA陽性的患者出現(xiàn)結(jié)核復(fù)活，而IGRA陰性的患者在兩年隨訪中沒有出現(xiàn)結(jié)核復(fù)活。

IGRA作為體外刺激試驗的一個優(yōu)點是同一試管可以通過多重陣列或流式細(xì)胞術(shù)重復(fù)研究其他生物標(biāo)記物，以獲得可能區(qū)分結(jié)核病不同階段的生物學(xué)特征。IFN-γ下游的IP-10，已被證明是一個潛力很大的生物標(biāo)記物。研究顯示，未刺激的輸卵管中血漿IP-10水平的升高與活動性結(jié)核有關(guān)[17]。IP-10不僅與血液中的IFN-γ一樣敏感，而且還能在患有活動性結(jié)核的兒童和成人的尿液中進(jìn)行IP-10檢測，使得樣本收集更加容易。此外，與IFN-γ不同的是，IP-10受HIV狀態(tài)的影響較小。上述優(yōu)點使IP-10成為一種較可靠的生物標(biāo)志物。

目前，已有多項研究在血漿上應(yīng)用多重細(xì)胞因子微珠陣列來區(qū)分活動性結(jié)核和潛伏性結(jié)核，這些研究分別應(yīng)用了5～15個生物標(biāo)志物的組合進(jìn)行分析，其鑒別敏感度為82.3%～96.7%[18-20]。其中，IFN-γ和IP-10是這些研究中最常用的生物標(biāo)記物。LUO等[21]通過對38個細(xì)胞因子的篩選研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)合應(yīng)用嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子、CCL22和MCP-1這3種細(xì)胞因子能鑒別活動性結(jié)核和潛伏性結(jié)核，敏感度和特異度分別為87.8%和91.8%。與抗結(jié)核治療成功與否相關(guān)的潛在生物標(biāo)志物還包括IL-6、MCP-1、VEGF、血清淀粉樣蛋白、IL-11受體拮抗劑和α2-抗纖溶酶等[22-23]，這些生物標(biāo)記物的具體情況還需要進(jìn)一步的研究評估和驗證。

3 宿主對結(jié)核分枝桿菌抗原的細(xì)胞免疫應(yīng)答

流式細(xì)胞術(shù)是利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行的一種單細(xì)胞定量分析和分選技術(shù)，可以用來分析不同種群中單個細(xì)胞的特征。當(dāng)結(jié)核分枝桿菌抗原暴露后，CD4+和CD8+T細(xì)胞經(jīng)歷幾個階段的分化，從幼稚T細(xì)胞發(fā)展到中央記憶T細(xì)胞、效應(yīng)記憶T細(xì)胞，最后到終末分化效應(yīng)記憶T細(xì)胞。同時，抗原暴露越多，T細(xì)胞分化就越快?；谏鲜鲈?，人們也關(guān)注與結(jié)核病分期相關(guān)的T細(xì)胞的功能特征(即亞群及其細(xì)胞因子的合成)。CD69是一種共刺激受體和早期激活標(biāo)志物，CD4+CD69+IFN-γ+T細(xì)胞水平升高與早期活動性結(jié)核病或近期的結(jié)核感染有關(guān)[24-25]。同樣，CD137是一種共刺激受體，負(fù)責(zé)維持T細(xì)胞的有效激活、增殖和存活，其出現(xiàn)頻率也被證明與活動性結(jié)核有關(guān)[26]。

MILLINGTON等[27]研究發(fā)現(xiàn)，多功能的CD4+IFN-γ+IL-2+TNF-α+T細(xì)胞主要見于活動性結(jié)核病患者，而CD4+IL-2+IFN-γ+T細(xì)胞和CD4+IFN-γ+T細(xì)胞見于潛伏性結(jié)核病患者。同時，也有研究表明，非活動性結(jié)核(包括潛伏性結(jié)核、卡介苗接種或治療期結(jié)核病)主要與CD4+IFN-γ+IL-2+效應(yīng)記憶T細(xì)胞和CD4+IL-2+效應(yīng)記憶T細(xì)胞有關(guān),而活動性結(jié)核主要與CD4+IFN-γ+終末分化效應(yīng)記憶T細(xì)胞有關(guān)[28]。AHMED等[29]研究發(fā)現(xiàn)，活動性結(jié)核與CD38+CD27low的頻率增加相關(guān)，而潛伏性結(jié)核與CD38-CD27high的頻率增加相關(guān)。CD27是TNF-α受體超家族成員之一，在鑒別活動性結(jié)核和潛伏性結(jié)核中有一定的應(yīng)用價值。研究發(fā)現(xiàn)，CD27和結(jié)核分枝桿菌特異性CD4+T細(xì)胞兩者與結(jié)核分枝桿菌抗原/結(jié)核分枝桿菌負(fù)荷相關(guān)，因此可以作為監(jiān)測治療進(jìn)展的生物標(biāo)志物[30]。其他T細(xì)胞亞群，如IL-10+Th17 T細(xì)胞在潛伏性結(jié)核病患者中顯著升高，而在DosR刺激下，活動性結(jié)核病患者IFN-γ+Th17 T細(xì)胞顯著升高[31]。除了T細(xì)胞外，樹突狀細(xì)胞在抗菌免疫方面也發(fā)揮著重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，BDCA3+樹突狀細(xì)胞和CD123+樹突狀細(xì)胞的占比在活動性結(jié)核病患者中明顯減少；而在潛伏性結(jié)核病患者中該亞型的占比明顯增加[32]。

其他表面標(biāo)志物，如CD38、HLA-DR、Ki-67和骨髓來源的抑制性細(xì)胞(MDSCs)的含量被認(rèn)為可作為監(jiān)測治療效果的生物標(biāo)志物[33]。AHMED等[29]研究發(fā)現(xiàn)抗結(jié)核治療9周后，T細(xì)胞表面CD38、HLA-DR等免疫激活標(biāo)志物的表達(dá)明顯降低。CACCAMO等[34]抗結(jié)核治療的隨訪研究顯示，結(jié)核病感染明顯好轉(zhuǎn)的患者表現(xiàn)出從CD4+IFN-γ+終末分化效應(yīng)記憶T細(xì)胞向CD4+IFN-γ+IL-2+效應(yīng)記憶T細(xì)胞的轉(zhuǎn)變。在一項關(guān)于活動性結(jié)核病抗結(jié)核治療的縱向前瞻性研究中，以抗結(jié)核治療開始后71 d為界點，將患者分為兩組：71 d內(nèi)痰培養(yǎng)轉(zhuǎn)陰者為快速反應(yīng)組，痰培養(yǎng)轉(zhuǎn)陰晚于71 d者為慢反應(yīng)組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Treg基因在慢應(yīng)答者中的頻率較高，并且Treg基因可以預(yù)測培養(yǎng)轉(zhuǎn)陰的時間，其敏感度為81%，特異度為85%[35]。

4 組學(xué)方法在生物標(biāo)志物研究中的應(yīng)用前景

組學(xué)即基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)和代謝組學(xué)等的統(tǒng)稱。這些組學(xué)方法不僅被用于結(jié)核病診斷、監(jiān)測治療效果、預(yù)測治療結(jié)果，而且還被用于提高對結(jié)核病發(fā)病機(jī)制的探索。

一項基因組學(xué)研究中，能編碼IFN誘導(dǎo)核蛋白的基因Sp110，對rs7580900、rs7580912、rs9061、rs11556887、rs2241525這5個單核苷酸多態(tài)性進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)rs9061與潛伏性結(jié)核的易感性呈顯著相關(guān)[36]。進(jìn)一步的研究表明，攜帶該單核苷酸多態(tài)性的個體血漿TNF-α水平有所降低[37]。一項轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，全血中有393個轉(zhuǎn)錄本表征活動性結(jié)核病，另有86個轉(zhuǎn)錄本，能將結(jié)核病與其他感染區(qū)分開,且通過分析發(fā)現(xiàn)活動性結(jié)核病的特征主要由中性粒細(xì)胞驅(qū)動的IFN誘導(dǎo)基因組成，包括IFN-γ和Ⅰ型IFN-αβ信號[38]。另有研究提出，轉(zhuǎn)錄圖譜能夠區(qū)分活動性結(jié)核和潛伏性結(jié)核[39]。細(xì)胞毒性基因轉(zhuǎn)錄本也可用于結(jié)核病預(yù)后評估，以預(yù)測結(jié)核病復(fù)發(fā)[40]。

轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究主要針對mRNA表達(dá)譜的研究，近年對mRNA的非編碼區(qū)的研究關(guān)注與日俱增。雖然這些非編碼RNA不編碼任何蛋白質(zhì)，但它們具有一定的調(diào)節(jié)功能，因此可能會因結(jié)核病的不同階段而改變。MIOTTO等[41]通過比較兒童結(jié)核、成人活動性肺結(jié)核、活動性肺外結(jié)核、結(jié)核/HIV混合感染和潛伏性結(jié)核病患者的microRNA(miRNA)圖譜，成功地確定了結(jié)核感染常見的15種miRNA特征，其敏感度和特異度分別為82%和77%。circRNA是一類具有閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的非編碼RNA分子，其高度抵抗核糖核酸酶的降解，因此在細(xì)胞中含量豐富且持續(xù)時間長。FU等[42]研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)核感染患者中有171個circRNA調(diào)控異常，circRNA_103017、circRNA_059914、circRNA_101128升高最明顯，而circRNA_062400下降，推測circRNA_103017對結(jié)核病的診斷有潛在價值，其次為circRNA_059914和circRNA_101128。CHAKRABARTY等[43]鑒定了幾種miRNA，發(fā)現(xiàn)兩種來自人類的miRNA(hsa-miR-146a-5p、hsa-miR-125b-5p)和一種來自結(jié)核分枝桿菌的miRNA(MTB-miR5)在活動性結(jié)核患者中有明顯增加。miRNA也被用來鑒別活動性結(jié)核和潛伏性結(jié)核。LYU等[44]通過研究250個miRNAs發(fā)現(xiàn)，hsa-let-7e-5p、hsa-let-7d-5p、hsa-miR-450a-5p、hsa-miR-140-5p在潛伏性結(jié)核病患者中呈差異表達(dá)，而hsa-miR-1246、hsa-miR-2110、hsa-miR-370-3p、hsa-miR-28-3p和hsa-miR-193b-5p在活動性結(jié)核病患者中存在差異表達(dá)。

利用蛋白質(zhì)組芯片方法，對4 262個結(jié)核分枝桿菌抗原進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)活動性結(jié)核病患者有152個結(jié)核分枝桿菌抗原的免疫球蛋白G水平比潛伏性結(jié)核病患者呈明顯提升，且進(jìn)一步分析表明，Rv2031c、Rv1408和Rv2421c能夠區(qū)分活動性結(jié)核和潛伏性結(jié)核[45]。由于組學(xué)方法能夠為結(jié)核病發(fā)生和發(fā)展的機(jī)制提供更全面的闡述，因此其在預(yù)測結(jié)核病治療結(jié)果上具有更高準(zhǔn)確性。DUFFY等[46]為了提高對結(jié)核病進(jìn)展的了解，通過結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)和通路分析，確定了一組新的免疫代謝信號,涉及皮質(zhì)醇、色氨酸、谷胱甘肽和tRNA?；W(wǎng)絡(luò)，該信號通路與潛伏性結(jié)核向活動性結(jié)核進(jìn)展有關(guān)。由于結(jié)核分枝桿菌特異性免疫反應(yīng)在人類群體中可能不是同質(zhì)的，可能受到HIV混合感染、遺傳和外源環(huán)境因素的影響。所以，組學(xué)研究中的變量數(shù)量通常比樣本量大得多，進(jìn)而檢測合適的生物標(biāo)志物的統(tǒng)計難度大幅提升。

5 小 結(jié)

結(jié)核病的診斷及治療監(jiān)測對臨床決策至關(guān)重要，宿主生物標(biāo)志物對此起著重要作用，但目前臨床上可用于結(jié)核病檢測的生物標(biāo)志物不是最理想的。宿主對結(jié)核分枝桿菌抗原產(chǎn)生的特異性抗體反應(yīng)普遍較低，但針對結(jié)核分枝桿菌特異性抗原的細(xì)胞免疫反應(yīng)具有更好的一致性。IGRA比TST具有更高的敏感度和特異度，IGRA已成為結(jié)核病診斷中較受歡迎的檢測方法。結(jié)核分枝桿菌特異性CD4+T細(xì)胞與結(jié)核分枝桿菌抗原負(fù)荷相關(guān)，因此可作為監(jiān)測治療效果的生物標(biāo)志物?；诮M學(xué)的技術(shù)能夠為疾病機(jī)制提供更全面的闡述，在預(yù)測結(jié)核病預(yù)后方面也更準(zhǔn)確，但仍需進(jìn)一步探索研究。