薯蕷皂苷激活PERK-Nrf2-HO-1通路改善糖尿病小鼠胰島素抵抗的機(jī)制探究

徐在革，敖 文，黃 婷，劉惠雙

0 引言

糖尿病是一種常見(jiàn)的、由多種病因引起的慢性代謝性疾病，其典型特征是血糖較高，無(wú)法正常轉(zhuǎn)化，從而引起機(jī)體長(zhǎng)期糖代謝紊亂，導(dǎo)致眼、心臟、肝臟、腎臟等組織器官出現(xiàn)功能減退、衰竭等情況，對(duì)機(jī)體的危害非常嚴(yán)重[1-2]。胰島素抵抗(Insulin resistance，IR)是指在一些因素的影響下，機(jī)體對(duì)于胰島素的敏感度減弱，導(dǎo)致葡萄糖的攝取和利用率降低，是糖尿病和代謝綜合征的重要致病因素之一[3]。薯蕷皂苷一般是從薯蕷科植物中提取的，具有抗炎、降血壓、降低膽固醇等多種功效，廣泛用于心腦血管疾病、糖尿病和腫瘤等疾病的治療中[4-6]。本研究探討薯蕷皂苷通過(guò)調(diào)控PERK-Nrf2-HO-1通路改善糖尿病小鼠IR的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性C57BL/6小鼠，體重23～25 g，購(gòu)于河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK(豫)2017-0001。飼養(yǎng)環(huán)境：室溫20～26 ℃，濕度40%～70%，光照條件12 h/12 h光暗循環(huán)。適應(yīng)5 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，期間飲食正常。

1.2 主要試劑、儀器 薯蕷皂苷(批號(hào)：20210120)購(gòu)于西安斯諾特生物技術(shù)有限公司；鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)、HE染色試劑盒(G1120、G1121)購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司；小鼠空腹胰島素(Fasting insulin，F(xiàn)INS)ELISA試劑盒(FT-P9S2076X)購(gòu)自上海梵態(tài)生物科技有限公司；超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)(S0088)、丙二醛(Malondialdehyde，MDA)(S0131S)和活性氧自由基(Reactive oxygen species，ROS)(S0033S)試劑盒均購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；TUNEL試劑盒購(gòu)于上海翊圣生物科技有限公司；兔抗Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)(14796)、兔抗Nrf2 (20733)、兔抗PERK(3192)、兔抗HO-1(82206)、兔抗cleaved caspase-6(9761)、兔抗β-actin(4970)、山羊抗兔IgG (7074)購(gòu)于CST公司；三諾GA-3型血糖儀購(gòu)于上海聚慕公司；Nikon Ti-S顯微鏡購(gòu)于日本Nikon公司；光學(xué)顯微鏡購(gòu)自上海豫光儀器廠；Alpha View凝膠成像儀購(gòu)于蘇州阿爾法生物實(shí)驗(yàn)器材有限公司。

1.3 方法

1.3.1 糖尿病小鼠模型的構(gòu)建 雄性小鼠先用高脂飼料連續(xù)喂養(yǎng)30 d，然后只給飲水，禁食24 h。之后連續(xù)1周每天進(jìn)行STZ(40 mg/kg)腹腔注射(STZ采用0.1 mmol/L檸檬酸緩沖液溶解配置)。結(jié)束腹腔注射后7 d測(cè)定小鼠的空腹血糖(Fasting blood glucose，F(xiàn)BG)情況，小鼠FBG>11.1 mmol/L時(shí)，可認(rèn)為模型構(gòu)建成功。

1.3.2 分組與處理 隨機(jī)選取正常喂養(yǎng)的9只小鼠作為對(duì)照組，喂養(yǎng)普通飼料，腹腔注射0.1 mmol/L的檸檬酸緩沖液。將成功構(gòu)建糖尿病模型的45只小鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為5組：糖尿病組，薯蕷皂苷低、中、高劑量組，二甲雙胍組，每組9只。薯蕷皂苷低、中、高劑量組分別灌胃25、50、100 mg/kg薯蕷皂苷；二甲雙胍組小鼠灌胃100 mg/kg二甲雙胍；對(duì)照組和糖尿病組則灌胃等量生理鹽水，每日1次，連續(xù)30 d。

1.3.3 各組小鼠FBG、FINS、胰島素抵抗指數(shù)(Homeostasis model assessment of insulin resistance，HOMA-IR)及體重的檢測(cè) 在連續(xù)給藥完成后，小鼠禁食禁水12 h，測(cè)定其體重。之后靜脈取血1.5 ml，離心機(jī)中3 000 r/min 4 ℃的條件離心15 min，取血清，在-80 ℃條件下保存?zhèn)溆谩Ｊ褂醚莾x測(cè)量FBG水平，使用ELISA法測(cè)定FINS水平，計(jì)算HOMA-IR。HOMA-IR=(FBG×FINS)/22.5。

1.3.4 各組小鼠肝臟組織HE染色 各組小鼠處死之后，取肝臟組織。將右上葉使用4%甲醛固定，其余部分-80 ℃凍存?zhèn)溆?。?%甲醛固定的肝臟組織樣本經(jīng)石蠟包埋后切片(3 μm)，將肝臟組織切片脫蠟、水洗后行HE染色、封片，使用顯微鏡觀察肝臟組織病理形態(tài)變化。

1.3.5 各組小鼠肝臟組織中SOD活性及MDA和ROS水平的檢測(cè) 取上述凍存?zhèn)溆玫母闻K組織1 g，采用PBS(9 ml)制備組織勻漿，離心后取上清液進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)SOD、MDA和ROS試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，繪制相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算出SOD活性、MDA和ROS含量。

1.3.6 各組小鼠肝臟組織凋亡指數(shù)檢測(cè) 取上述肝臟組織的石蠟切片，按照TUNEL試劑盒操作步驟進(jìn)行，之后使用光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞核，細(xì)胞核著色呈棕黃色或棕褐色的細(xì)胞為凋亡細(xì)胞。使用雙盲法觀察，并進(jìn)行細(xì)胞凋亡指數(shù)(Apoptopic index，AI)的計(jì)算。AI(%)=凋亡細(xì)胞/總細(xì)胞×100%。

1.3.7 各組小鼠肝臟組織中Bax、cleaved caspase-6、PERK、Nrf2及HO-1的蛋白表達(dá) 取上述凍存?zhèn)溆玫母闻K組織，使用RIPA試劑盒提取總蛋白，并測(cè)定蛋白濃度。蛋白中加入上樣緩沖液混勻后100 ℃ 5 min使蛋白變性；上樣20 μg/孔，10% SDS-PAGE凝膠電泳，100 mV 2 h；半干法轉(zhuǎn)膜，100 mA 1 h；TBST溶液室溫洗膜15 min；Blocking one/Blocking one-P封閉30 min，一抗(1∶1 000稀釋)孵育，4 ℃過(guò)夜；洗膜后二抗(1∶10 000稀釋)孵育，室溫1 h；洗膜后，ECL發(fā)光液室溫反應(yīng)1 min，凝膠成像系統(tǒng)成像，并分析蛋白條帶。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠FBG、FINS水平、HOMA-IR及體重比較 與對(duì)照組相比，糖尿病組小鼠FBG、FINS水平、HOMA-IR均明顯提高(P<0.05)，而小鼠體重明顯降低(P<0.05)。與糖尿病組相比，薯蕷皂苷低、中、高劑量組和二甲雙胍組小鼠FBG、FINS水平和HOMA-IR均降低(P<0.05)，小鼠體重增加(P<0.05)，且薯蕷皂苷組的作用效果具有一定的劑量效應(yīng)關(guān)系，而二甲雙胍組與薯蕷皂苷高劑量組相比，作用效果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠FBG、FINS水平、HOMA-IR及體重比較

2.2 各組小鼠肝臟組織病理學(xué)情況 與對(duì)照組比較，糖尿病組小鼠的肝組織細(xì)胞形態(tài)異常且不規(guī)則、細(xì)胞排列凌亂，而且出現(xiàn)了較多空泡和壞死的現(xiàn)象。而在薯蕷皂苷各劑量組和二甲雙胍組中，無(wú)論是細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu),還是排列順序,較糖尿病組均有明顯改善，尤其是薯蕷皂苷高劑量組和二甲雙胍組。見(jiàn)圖1。

圖1 各組小鼠肝臟組織病理學(xué)情況(HE，200×)

2.3 各組小鼠肝臟組織中SOD活性、MDA及ROS水平的變化情況 與對(duì)照組比較，糖尿病組SOD活性明顯降低(P<0.05)，MDA和ROS水平則明顯升高(P<0.05)。與糖尿病組相比，薯蕷皂苷各劑量組和二甲雙胍組SOD活性明顯升高(P<0.05)，MDA和ROS水平明顯降低(P<0.05)，且薯蕷皂苷的作用效果具有一定的劑量效應(yīng)關(guān)系。二甲雙胍組與薯蕷皂苷高劑量組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

2.4 各組小鼠肝臟組織細(xì)胞凋亡情況 與對(duì)照組比較，糖尿病組AI明顯升高(P<0.05)。與糖尿病組相比，薯蕷皂苷低、中、高劑量組和二甲雙胍組AI明顯降低，且薯蕷皂苷的作用效果具有一定的劑量效應(yīng)關(guān)系(P<0.05)。二甲雙胍組AI略高于薯蕷皂苷高劑量組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2和圖2。

表2 各組小鼠肝臟組織中SOD活性、MDA和ROS水平及AI的變化情況

圖2 各組小鼠肝臟組織細(xì)胞凋亡情況(TUNEL，200×)

2.5 各組小鼠肝臟組織中凋亡相關(guān)蛋白Bax、cleaved caspase-6表達(dá)水平 與對(duì)照組相比，糖尿病組Bax、cleaved caspase-6在蛋白水平的表達(dá)明顯升高(P<0.05)。與糖尿病組相比，薯蕷皂苷低、中、高劑量組和二甲雙胍組Bax、cleaved caspase-6蛋白表達(dá)均明顯降低(P<0.05)，且薯蕷皂苷的作用效果具有一定的劑量效應(yīng)關(guān)系。薯蕷皂苷高劑量組和二甲雙胍組Bax、cleaved caspase-6蛋白表達(dá)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3和圖3。

圖3 各組小鼠肝臟組織中凋亡相關(guān)蛋白Bax、cleaved caspase-6表達(dá)情況

表3 各組小鼠肝臟組織中凋亡相關(guān)蛋白Bax、cleaved caspase-6表達(dá)水平

2.6 小鼠肝臟組織中PERK、Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)水平 與對(duì)照組相比，糖尿病組PERK、Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)水平均明顯降低(P<0.05)。與糖尿病組相比，薯蕷皂苷低、中、高劑量組和二甲雙胍組PERK、Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)水平明顯提高(P<0.05)，且薯蕷皂苷的作用效果具有一定的劑量效應(yīng)關(guān)系。二甲雙胍組與薯蕷皂苷高劑量組相比，作用效果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表4和圖4。

表4 各組小鼠肝臟組織中PERK、Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)水平

圖4 各組小鼠肝臟組織中PERK、Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)情況

3 討論

近年來(lái)，糖尿病的發(fā)生率越來(lái)越高，且呈現(xiàn)年輕化的趨勢(shì)，預(yù)計(jì)到2045年糖尿病的患病率高達(dá)8.3%[7]，如何有效地治療糖尿病成為研究熱點(diǎn)。IR作為糖尿病的一個(gè)重要致病因素，一直以來(lái)都是治療糖尿病的焦點(diǎn)[8]。然而，糖尿病治療藥物，如雙胍類、噻唑烷二酮類等，雖然對(duì)IR具有較好的效果，但是也帶來(lái)了諸多不良反應(yīng)，如肝腎損傷、胃腸道不耐受等。因此，尋找既能夠有效減輕IR，又具有較小不良反應(yīng)的藥物，對(duì)于糖尿病的治療具有重要意義[9]。本研究中，與對(duì)照組比較，糖尿病組小鼠的體重下降，F(xiàn)BG、FINS水平及HOMA-IR明顯升高，表明小鼠體內(nèi)出現(xiàn)了IR。

肝臟參與糖代謝，是機(jī)體調(diào)節(jié)血糖濃度的重要器官，IR的發(fā)生與其有關(guān)。在糖尿病患者的血漿中，cleaved caspase-6表達(dá)明顯升高，促進(jìn)高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡，進(jìn)而促進(jìn)糖尿病腎病的發(fā)展[10-11]。本研究中，與對(duì)照組比較，糖尿病組小鼠肝臟組織中的細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)變異，凋亡相關(guān)蛋白Bax和cleaved caspase-6表達(dá)水平明顯升高，肝細(xì)胞的凋亡指數(shù)明顯升高，與上述研究結(jié)果類似。提示糖尿病會(huì)對(duì)肝臟組織造成損傷，引起肝細(xì)胞凋亡。肝臟組織損傷會(huì)影響肝臟的正常功能，從而導(dǎo)致機(jī)體血糖濃度失衡，加重糖尿病病情。因此，減輕肝臟組織損傷和肝細(xì)胞凋亡，有利于抑制IR[12]。本研究表明，薯蕷皂苷能夠改善糖尿病小鼠肝臟組織細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)的異常，降低Bax和cleaved caspase-6蛋白表達(dá)水平以及抑制細(xì)胞凋亡，且呈一定劑量依賴效應(yīng)。本文研究結(jié)果顯示，薯蕷皂苷對(duì)糖尿病小鼠的肝臟組織損傷具有改善作用，能夠通過(guò)加強(qiáng)肝臟組織的功能，調(diào)節(jié)血糖濃度，抑制IR的發(fā)生。

氧化應(yīng)激是導(dǎo)致糖尿病持續(xù)發(fā)生的一個(gè)重要病理因素，因此，抗氧化是減輕或緩解糖尿病的一個(gè)重要方向[13]。PERK-Nrf2是一條關(guān)鍵的抗氧化信號(hào)通路，在糖尿病及其并發(fā)癥的治療過(guò)程中具有重要作用。PERK是位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的一種跨膜蛋白，在受到刺激后會(huì)發(fā)生磷酸化從而被激活。Nrf2位于PERK的下游，是維持機(jī)體氧化還原平衡的一種重要轉(zhuǎn)錄因子，能夠調(diào)控氧化應(yīng)激反應(yīng)，降低ROS等物質(zhì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的損傷和對(duì)氧化應(yīng)激反應(yīng)的加重，促使細(xì)胞趨于氧化還原的正常狀態(tài)[14-16]。當(dāng)PERK被激活后，會(huì)進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)，引起Nrf2蛋白的激活[17]，激活后的Nrf2會(huì)進(jìn)入到細(xì)胞核內(nèi)參與調(diào)控包括HO-1在內(nèi)的抗氧化物的基因轉(zhuǎn)錄。HO-1是一種重要的抗氧化酶，能夠抑制促氧化作用的發(fā)生，還能夠?qū)OS等自由基進(jìn)行有效清除，在抗氧化反應(yīng)中起到重要作用[18-19]。本研究顯示，當(dāng)小鼠發(fā)生糖尿病時(shí)，肝臟組織中PERK、Nrf2、HO-1在蛋白水平的表達(dá)明顯降低，而在薯蕷皂苷處理后，肝臟組織PERK、Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)明顯升高，提示PERK-Nrf2-HO-1通路參與了糖尿病的發(fā)生，而且薯蕷皂苷能夠通過(guò)調(diào)控PERK-Nrf2-HO-1通路，來(lái)抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，達(dá)到減輕糖尿病小鼠肝臟損傷及IR的效果。

當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)氧化應(yīng)激反應(yīng)時(shí)，細(xì)胞內(nèi)會(huì)有大量的ROS產(chǎn)生，這些ROS一方面能夠過(guò)度消耗體內(nèi)的抗氧化酶，如SOD[20]；另一方面又會(huì)對(duì)細(xì)胞中的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸等大分子進(jìn)行破壞，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，MDA是ROS過(guò)度氧化脂質(zhì)的一種有毒產(chǎn)物[21]。因此，可以通過(guò)對(duì)SOD活性、MDA和ROS含量的測(cè)定來(lái)反映氧化應(yīng)激的程度。本研究顯示，薯蕷皂苷能夠降低糖尿病小鼠肝臟組織中MDA和ROS含量，提高SOD活性。這提示薯蕷皂苷能夠減少氧自由基堆積，提高抗氧化酶活性來(lái)發(fā)揮抗氧化作用，同時(shí)也反映了PERK-Nrf2-HO-1通路確實(shí)起到了調(diào)控抗氧化系統(tǒng)的作用。

綜上所述，薯蕷皂苷能夠通過(guò)激活 PERK-Nrf2-HO-1通路，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)和肝臟細(xì)胞凋亡的過(guò)度發(fā)生，進(jìn)而發(fā)揮對(duì)糖尿病IR的減輕作用。薯蕷皂苷是否亦通過(guò)其他通路發(fā)揮對(duì)糖尿病小鼠的保護(hù)作用仍有待于后期深入探究。