經(jīng)典Wnt信號通路與腫瘤免疫耐受的研究進(jìn)展

霍迪妮，聶小博

(河南大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河南 開封 475004)

經(jīng)典Wnt(整合酶基因與無翅基因)信號通路又稱為Wnt/β聯(lián)蛋白信號通路，在進(jìn)化過程中高度保守，通過調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等過程在胚胎發(fā)育、組織穩(wěn)態(tài)和組織修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用[1]。經(jīng)典Wnt信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)異常與諸多疾病的發(fā)生和發(fā)展有密切關(guān)系，其中與惡性腫瘤的關(guān)系一直是腫瘤學(xué)研究領(lǐng)域的熱點方向。經(jīng)典Wnt信號通路中關(guān)鍵組成分子發(fā)生基因突變或表觀遺傳學(xué)修飾均會導(dǎo)致其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)失調(diào)，進(jìn)而促進(jìn)惡性腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展、耐藥及復(fù)發(fā)。近年來，隨著腫瘤免疫學(xué)的興起，其在腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment，TME)中的調(diào)節(jié)作用也引起了人們的日益關(guān)注。經(jīng)典Wnt信號通路已被證明通過調(diào)控樹突狀細(xì)胞、T細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞等參與癌癥免疫周期的各個階段[2]。雖然免疫治療尤其是免疫檢查點阻斷療法已在惡性腫瘤治療中取得了很好的效果，但部分患者對于免疫治療的初始反應(yīng)低下或長期治療后產(chǎn)生耐藥，這均與經(jīng)典Wnt信號通路異常有一定關(guān)系[3]。因此，聯(lián)合應(yīng)用Wnt調(diào)節(jié)劑有望改善TME，增強免疫治療的效果。 現(xiàn)就經(jīng)典Wnt信號通路與腫瘤免疫耐受的研究進(jìn)展予以綜述。

1 經(jīng)典Wnt信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制

目前在人類中已鑒定出19種Wnt蛋白分子[4]。Wnt蛋白在出細(xì)胞前必須經(jīng)過棕櫚?；揎棧诉^程依賴?；D(zhuǎn)移酶Porcupine(PORCN)的作用[5]。Wnt蛋白以自分泌或旁分泌方式與靶細(xì)胞膜表面的Frizzled(G蛋白偶聯(lián)受體家族成員)受體以及輔助受體低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白(low density lipoprotein receptor-related protein,LRP)5/6結(jié)合。其中Frizzled受體胞外半胱氨酸結(jié)構(gòu)域的N端是Wnt 蛋白的主要結(jié)合部位[6-7]。Wnt與Frizzled和LRP5/6結(jié)合后形成的復(fù)合物會募集細(xì)胞質(zhì)中的Dishevelled蛋白(一種大多數(shù)Wnt通路介質(zhì))[8]，并通過Dishevelled蛋白特殊的結(jié)構(gòu)域招募軸蛋白并激活軸蛋白-糖原合成酶激酶-3(glycogen synthase kinase-3，GSK-3)復(fù)合物，促進(jìn)GSK-3對LRP6的磷酸化修飾[9]，進(jìn)而抑制由軸蛋白、結(jié)腸腺瘤性息肉病(adenomatous polyosis coli，APC)蛋白、GSK-3β和酪蛋白激酶1α等組成的降解復(fù)合體的活性，導(dǎo)致β聯(lián)蛋白在細(xì)胞質(zhì)中蓄積并進(jìn)入細(xì)胞核與轉(zhuǎn)錄因子T細(xì)胞因子(T cell factor，TCF)/淋巴增強因子結(jié)合，激活一系列與細(xì)胞增殖、分化等過程相關(guān)的靶基因轉(zhuǎn)錄[10]。當(dāng)Wnt蛋白缺乏時，胞質(zhì)中游離的β聯(lián)蛋白會被降解復(fù)合體中的激酶磷酸化修飾，并通過這些磷酸化位點與E3泛素蛋白連接酶亞基即β-轉(zhuǎn)導(dǎo)素重復(fù)序列包含蛋白結(jié)合，進(jìn)而被蛋白酶體降解[11]，此時下游靶基因的轉(zhuǎn)錄受到抑制。

2 經(jīng)典Wnt信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)異常與惡性腫瘤的發(fā)生

經(jīng)典Wnt信號通路中起抑制作用的組分發(fā)生失活性突變或起信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用的組分發(fā)生激活性突變均會導(dǎo)致該通路的異常激活，促進(jìn)惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。APC蛋白和軸蛋白是降解復(fù)合體中的關(guān)鍵組分[12]，其編碼基因的失活性突變會導(dǎo)致β聯(lián)蛋白的過度蓄積及下游癌基因的過度轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)正常細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化或腫瘤細(xì)胞的惡性增殖[13]。在大多數(shù)結(jié)直腸癌組織中可以檢測到APC基因的失活性突變，且這些突變在結(jié)直腸癌早期已經(jīng)發(fā)生[14]，然而目前尚不清楚這些突變發(fā)生的原因。此外，在部分肝細(xì)胞癌及肝母細(xì)胞瘤組織中可以檢測到Axin 1和Axin 2基因的失活性突變[15]?；谌祟惏┌Y基因組數(shù)據(jù)庫的一項研究發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜癌、肝癌和結(jié)直腸癌組織中β聯(lián)蛋白編碼基因的激活性突變發(fā)生率均較高，且突變主要發(fā)生在編碼N端區(qū)域的第3個外顯子附近[16]，然而該基因突變的頻率在其他類型的惡性腫瘤中很低。惡性腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展也與經(jīng)典Wnt信號通路中關(guān)鍵組分或其調(diào)控分子編碼基因的DNA甲基化或共價組蛋白修飾等表觀遺傳學(xué)改變導(dǎo)致的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)異常有關(guān)[17]。例如，分泌型脆性相關(guān)蛋白1和β聯(lián)蛋白抑制基因3均是經(jīng)典Wnt信號通路的抑制性調(diào)控因子，前者基因啟動子區(qū)域的高甲基化會導(dǎo)致其表達(dá)水平降低，失去對Wnt蛋白的抑制作用，促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的惡性增殖[18]。β聯(lián)蛋白抑制基因3的二價組蛋白修飾也會降低其表達(dá)水平，失去對β聯(lián)蛋白和經(jīng)典Wnt信號通路的抑制作用。在結(jié)直腸癌組織中可以檢測到β聯(lián)蛋白抑制基因3二價組蛋白修飾水平的升高及表達(dá)水平的明顯降低[19]。因此，闡明經(jīng)典Wnt信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)異常發(fā)生的分子機(jī)制對于惡性腫瘤的靶向治療具有重要意義。

3 經(jīng)典Wnt信號通路異常與免疫監(jiān)測的破壞

經(jīng)典Wnt信號通路不僅能夠調(diào)控造血干細(xì)胞的自我更新和祖細(xì)胞的增殖，還可以調(diào)控胸腺T細(xì)胞的發(fā)育過程[20]。此外，經(jīng)典Wnt信號通路的激活有利于記憶性CD8+T細(xì)胞的生成，強化免疫系統(tǒng)對抗病原體的能力[21]，這對于維持免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。然而，經(jīng)典Wnt信號通路異常激活會通過調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞參與腫瘤免疫，協(xié)助腫瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視，并引起腫瘤對免疫治療產(chǎn)生耐藥。

3.1經(jīng)典Wnt信號通路異常促進(jìn)免疫耐受 TME是指腫瘤細(xì)胞生成和生活的微環(huán)境。腫瘤細(xì)胞與TME之間復(fù)雜的相互作用對于腫瘤的發(fā)展、轉(zhuǎn)移以及治療反應(yīng)至關(guān)重要。TME中除了含有腫瘤細(xì)胞，還包括其他類型的細(xì)胞，如成纖維細(xì)胞、免疫細(xì)胞和脂肪細(xì)胞等，以及腫瘤血管、淋巴管和細(xì)胞外基質(zhì)成分，同時還存在一些細(xì)胞因子、生長因子和趨化因子[22]。免疫耐受是腫瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視的主要方式。經(jīng)典Wnt信號通路異常激活會在一定程度上影響TME中樹突狀細(xì)胞的成熟與激活。有研究表明，β聯(lián)蛋白缺失會導(dǎo)致樹突狀細(xì)胞表面共刺激分子表達(dá)水平增加以及共抑制分子表達(dá)水平降低，增強抗腫瘤免疫[23]。相反，激活TME中樹突狀細(xì)胞的β聯(lián)蛋白會誘導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)因子的產(chǎn)生，促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell，Treg細(xì)胞)的分化，介導(dǎo)免疫抑制；同時通過抑制炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生抑制效應(yīng)T細(xì)胞的分化，促進(jìn)免疫耐受[24]。其中，樹突狀細(xì)胞中的免疫調(diào)節(jié)因子視黃酸由維生素A代謝而來，腫瘤細(xì)胞會激活樹突狀細(xì)胞中的β聯(lián)蛋白，β聯(lián)蛋白與TCF4結(jié)合后會誘導(dǎo)維生素A代謝酶的表達(dá)，在該酶作用下生成的視黃酸能夠驅(qū)動Treg細(xì)胞的分化并限制效應(yīng)T細(xì)胞[23]。同樣，免疫調(diào)節(jié)酶吲哚胺2，3-雙加氧酶-1也會促進(jìn)樹突狀細(xì)胞的耐受及Treg細(xì)胞的發(fā)育。有研究發(fā)現(xiàn)，黑色素瘤來源的Wnt5a依賴于β聯(lián)蛋白的作用誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞中吲哚胺2，3-雙加氧酶的表達(dá)[25]。此外，樹突狀細(xì)胞中的β聯(lián)蛋白的激活會促進(jìn)哺乳動物雷帕霉素靶向蛋白依賴的白細(xì)胞介素-10產(chǎn)生，抑制CD8+T細(xì)胞的交叉啟動。樹突狀細(xì)胞中β聯(lián)蛋白的激活對于維持克隆擴(kuò)增的CD8+T細(xì)胞也具有重要意義，說明β聯(lián)蛋白對處于不同發(fā)育階段的CD8+T細(xì)胞有不同的調(diào)節(jié)作用[26]。

3.2經(jīng)典Wnt信號通路異常抑制T細(xì)胞的浸潤 TME會降低細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的浸潤，這也是腫瘤細(xì)胞逃逸免疫監(jiān)視的機(jī)制之一。β聯(lián)蛋白信號活化能夠通過誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子3的表達(dá)干擾CC趨化因子配體[chemokine (C-C motif) ligand,CCL]4的生成，抑制CD103+樹突狀細(xì)胞的浸潤[27]。而CD103+樹突狀細(xì)胞會產(chǎn)生CXC趨化因子配體[chemokine (C-X-C motif) ligand，CXCL]9和CXCL10，這對于TME招募CD8+效應(yīng)T細(xì)胞是必需的[28]。有研究發(fā)現(xiàn)，β聯(lián)蛋白對于CXCL9和CXCL10的表達(dá)也具有調(diào)節(jié)作用，β聯(lián)蛋白反應(yīng)轉(zhuǎn)錄抑制因子14是一種β聯(lián)蛋白/TCF抑制劑，能夠上調(diào)大腸癌細(xì)胞中CXCL9/10/11的表達(dá)，促進(jìn)T細(xì)胞浸潤[29]。此外，在攜帶β聯(lián)蛋白編碼基因激活型突變的肝癌中發(fā)現(xiàn)，β聯(lián)蛋白通過下調(diào)CCL5的表達(dá)導(dǎo)致樹突狀細(xì)胞的募集缺陷，損害T細(xì)胞活性，進(jìn)而抑制機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)并促進(jìn)免疫逃逸[30]，而TME中CD103+樹突狀細(xì)胞和T細(xì)胞的浸潤減少正是非T細(xì)胞炎癥性腫瘤對免疫檢查點阻滯和過繼性T細(xì)胞轉(zhuǎn)移等免疫治療產(chǎn)生耐藥性的主要機(jī)制[31]。細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4抑制劑和程序性細(xì)胞死亡受體1(programmed cell death receptor 1，PD-1)抑制劑/程序性細(xì)胞死亡配體1(programmed cell death-ligand 1，PD-L1)抑制劑是目前最主要的兩類免疫檢查點抑制劑，通過阻斷癌細(xì)胞表達(dá)的免疫檢查點與T細(xì)胞之間的相互作用抑制免疫耐受及免疫逃避的發(fā)生，增強T細(xì)胞的活性，使機(jī)體產(chǎn)生更加有效的抗腫瘤免疫反應(yīng)。因此，細(xì)胞毒性CD8+T細(xì)胞浸潤程度越高的惡性腫瘤對免疫檢查點阻滯治療的反應(yīng)也越強[32]。有研究發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合阻斷PD-1/PD-L1和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4陰性共刺激通路可以增強B16黑色素瘤TME中CD8+效應(yīng)T細(xì)胞的浸潤，使TME向炎癥性轉(zhuǎn)變，并減少Treg細(xì)胞及髓源性抑制細(xì)胞的數(shù)量，加強免疫治療效果[33]。雖然免疫檢查點阻斷療法為癌癥患者帶來新的希望，但目前只有部分患者從中獲益，而且某些對治療有反應(yīng)的患者也會出現(xiàn)繼發(fā)性耐藥[34]，這些現(xiàn)象已被證明與腫瘤細(xì)胞中的β聯(lián)蛋白信號的過度活化有關(guān)[35]。

4 經(jīng)典Wnt信號通路調(diào)節(jié)劑在腫瘤免疫治療中的應(yīng)用

由于經(jīng)典Wnt信號通路的異常激活與腫瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視密切相關(guān)，其靶向藥物能夠增強腫瘤的免疫治療。目前靶向經(jīng)典Wnt信號通路的抑制劑主要有4類：配體受體抑制劑、PORCN抑制劑、端錨聚合酶(tankyrase，TNKS)抑制劑和β聯(lián)蛋白抑制劑。有研究發(fā)現(xiàn)，Wnt3a中和抗體能夠促進(jìn)樹突狀細(xì)胞成熟并誘導(dǎo)腫瘤特異性CD8+T細(xì)胞的增殖及抗腫瘤效應(yīng)，逆轉(zhuǎn)TME中的免疫抑制，恢復(fù)免疫監(jiān)視，進(jìn)而抑制荷瘤小鼠的腫瘤進(jìn)展[36]。磷酸源生萘啶是一種新型PORCN抑制劑，通過增加TME中CD8+T細(xì)胞浸潤抑制腫瘤的進(jìn)展，但磷酸源生萘啶與DKN-01[一種抗DKK1(Dickkopf-1)抗體]聯(lián)合應(yīng)用是否會增強臨床前卵巢癌患者對免疫檢查點阻滯治療的反應(yīng)，仍需要進(jìn)一步研究[37]。Wnt 974能夠抑制Wnt配體的分泌，在體內(nèi)和體外均可以干擾Wnt信號通路，對小鼠乳腺癌模型和人頭頸鱗狀細(xì)胞癌模型均有顯著的抑制作用[38-39]。一項針對晚期實體腫瘤患者的Ⅰ期臨床研究發(fā)現(xiàn)，Wnt 974還能夠增強免疫檢查點抑制劑的活性[40]。此外，PORCN抑制劑治療黑色素瘤荷瘤小鼠能同時增強樹突狀細(xì)胞捕獲和交叉呈遞腫瘤抗原的能力，并通過調(diào)控樹突狀細(xì)胞功能增強腫瘤特異性T細(xì)胞的功能[24]。TNKS抑制劑能夠抑制細(xì)胞中軸蛋白的降解，穩(wěn)定降解復(fù)合體的功能并增強其對β聯(lián)蛋白的降解作用，抑制經(jīng)典Wnt信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)[24]。TNKS抑制劑 XAV-939和PORCN抑制劑Wnt-C59均可以降低腫瘤細(xì)胞刺激誘導(dǎo)的骨髓源性肌成纖維細(xì)胞中PD-L1的表達(dá)，進(jìn)而抑制PD-L1治療耐藥的發(fā)生[41]。研究發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合應(yīng)用XAV-939可以增強抗 PD-L1抗體治療骨髓源性肌成纖維細(xì)胞混合瘤的效果，并顯著提高TME中CD8+T細(xì)胞的比例[41]。另有研究發(fā)現(xiàn)，黑色素瘤小鼠接受XAV-939治療后體內(nèi)的Treg細(xì)胞數(shù)量減少，而CD4+T細(xì)胞與CD8+T細(xì)胞的浸潤增加，腫瘤的生長速度受到抑制[23]。另一種新型TNKS抑制劑K-476也被證明通過上調(diào)CCL3、CCL4等趨化因子的表達(dá)增加CD8+T細(xì)胞的浸潤，提高免疫檢查點抑制劑的療效，且與XAV-939相比具有更高的選擇性和安全性，是一種具有應(yīng)用前景的新型治療藥物[42]。此外，PKF115-584(一種β聯(lián)蛋白/TCF4抑制劑)能夠抑制小鼠模型中白細(xì)胞介素-10的生成，恢復(fù)樹突狀細(xì)胞的免疫活性并激活T細(xì)胞[43]。因此，聯(lián)合應(yīng)用經(jīng)典Wnt信號通路拮抗劑和免疫檢查點抑制劑具有協(xié)同作用，能夠增強腫瘤免疫治療的效果。

雖然目前的多數(shù)研究認(rèn)為激活經(jīng)典Wnt通路可促進(jìn)腫瘤的惡性進(jìn)展，但也有研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)β聯(lián)蛋白能夠降低腫瘤的自我更新能力，減輕腫瘤負(fù)擔(dān)并提高患者的生存率[44]。目前研究較多的Wnt激動劑包括抗DKK1(經(jīng)典Wnt信號通路抑制因子)單克隆抗體和GSK-3抑制劑。DKK1通過與LRP5/6結(jié)合干擾其正常的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。然而，DKK1會通過靶向抑制β聯(lián)蛋白誘導(dǎo)髓源性抑制細(xì)胞積聚進(jìn)而抑制T細(xì)胞反應(yīng)，導(dǎo)致免疫抑制性TME的形成[45]。此外，DKK1也會協(xié)助潛伏性癌細(xì)胞下調(diào)自然殺傷細(xì)胞激活因子，促進(jìn)免疫逃逸[46]。相反，中和DKK1能夠減少髓源性抑制細(xì)胞的數(shù)量并通過促進(jìn)T細(xì)胞的募集和激活改善TME的免疫活性，抑制腫瘤的生長[45]。DKN-01是特異性靶向DKK1的人源化IgG4單克隆抗體。目前，單獨或聯(lián)合應(yīng)用DKN-01治療晚期難治性膽管癌、晚期食管胃癌以及卵巢癌的相關(guān)研究正在進(jìn)行中[47-49]。在免疫檢查點阻滯治療前使用PORCN抑制劑和DKK1抑制劑能夠改善免疫環(huán)境，增加卵巢癌對免疫治療的敏感性[37]。另有研究發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合應(yīng)用mDKN-01(一種新型抗DKK1單克隆抗體)可以增強PD-1抗體對黑色素瘤的治療效果[50]。GSK-3抑制劑是另一類Wnt激動劑，具有抗腫瘤和促進(jìn)免疫反應(yīng)的雙重作用。此類抑制劑不僅能夠促進(jìn)自然殺傷細(xì)胞的成熟，增強其免疫功能[51]，也可通過激活經(jīng)典Wnt信號通路促進(jìn)CD8+記憶干細(xì)胞的生成，進(jìn)而發(fā)揮更強的免疫作用[52]。GSK-3的小分子抑制劑已被證明能夠降低PD-1的表達(dá)，增加CTL的殺傷作用[53]。一項基于小鼠B16黑色素瘤的研究表明，雖然GSK-3抑制劑羅布麻寧的抑癌效果與抗PD-1抗體基本相同[54]，但可以避免低應(yīng)答率以及耐藥性的發(fā)生[55]。因此，適度激活經(jīng)典Wnt通路也有益于腫瘤的免疫治療。然而針對某種特定類型的惡性腫瘤，選用經(jīng)典Wnt通路激動劑還是抑制劑才能發(fā)揮增強免疫治療的效果仍需要更多研究才能確定。

5 小 結(jié)

異常激活的經(jīng)典Wnt信號通路通過破壞機(jī)體免疫監(jiān)測，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞逃避進(jìn)而抑制免疫系統(tǒng)的抗腫瘤功能。Wnt通路調(diào)節(jié)劑已被證明可以增強機(jī)體的抗腫瘤免疫能力，其中一些藥物甚至可以減少免疫治療耐藥性的發(fā)生，增強治療效果。然而，目前的多數(shù)研究結(jié)果是基于細(xì)胞和動物實驗得到的，其臨床治療效果及安全性還需要更多評價，且由于經(jīng)典Wnt信號通路對于免疫系統(tǒng)的調(diào)控過于復(fù)雜，選用經(jīng)典Wnt信號通路激動劑還是抑制劑才能發(fā)揮最佳的輔助免疫治療效果仍需要進(jìn)一步明確?？傊?，靶向Wnt信號通路無論是單獨應(yīng)用還是與腫瘤免疫治療、放療或化療等方法聯(lián)合應(yīng)用均是頗具應(yīng)用前景的腫瘤治療策略。