慢性疲勞綜合征動物模型評價方式的現(xiàn)狀與思考

王玉琳，劉同巖，孫瑋，屈媛媛，馮楚文，王宗興，顧冶，楊添松1，

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，哈爾濱 150040； 2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院針灸科，哈爾濱 150001；3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院 a.針灸五科，b.針灸科，c.周圍血管科，哈爾濱 150040)

慢性疲勞綜合征(chronic fatigue syndrome，CFS)是一種涉及多器官系統(tǒng)以慢性持續(xù)或反復(fù)發(fā)作的嚴(yán)重疲勞為特征的癥候群，休息后不可減輕的腦力、體力極度疲勞為其突出表現(xiàn)，該病病程較長，往往伴有非特異性軀體化癥狀[1]。病毒感染、心理社會應(yīng)激、遺傳及不健康的生活方式等導(dǎo)致免疫功能失調(diào)或神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)障礙均可誘發(fā)本病[2]。目前，CFS全球患病率為0.89%[3]。隨著人們生活壓力的逐漸增加，CFS的總體發(fā)病率呈上升趨勢，且逐漸年輕化。該病主要在心理和生理兩方面對患者造成影響，導(dǎo)致人體免疫、循環(huán)等各系統(tǒng)及情緒、意志發(fā)生病理性改變。在西方國家，CFS是迫使人們前往醫(yī)院就醫(yī)的五大原因之一。在我國，中等收入以上和低收入人群及某些特殊群體(如IT人員、醫(yī)務(wù)人員及長期作息不規(guī)律者)更易患CFS，給社會和家庭造成沉重負(fù)擔(dān)[4]。

因此，在CFS的研究工作中建立更為科學(xué)的動物模型有著重要的臨床意義。近年來，CFS模型多以順應(yīng)性強，與人類生理相近的鼠類為主，造模成功的評價標(biāo)準(zhǔn)多樣，但具體標(biāo)準(zhǔn)、方法沒有統(tǒng)一，缺乏科學(xué)性及說服力。現(xiàn)就CFS動物模型的評價方式與干預(yù)措施評價標(biāo)準(zhǔn)予以綜述，以為今后CFS的動物模型研究和臨床研究提供幫助。

1 常用評價方式

1.1基本狀態(tài)

1.1.1一般情況 一般情況包括精神狀態(tài)、皮膚顏色、耳與尾部色澤、糞便情況、日進食量與日飲水量等，可作為模型動物內(nèi)在疲勞程度及精神狀態(tài)的外在表現(xiàn)，有操作簡便、結(jié)果易得等優(yōu)勢，被眾多文獻作為衡量指標(biāo)。但一般情況有很強的主觀因素，結(jié)果可靠性不高?？梢酝ㄟ^制作半定量量表的形式減少主觀因素，增加結(jié)果可靠性。如高懷林等[5]制作的半定量量表，具體操作為將量表得分作為觀察對象，以造模前后得分差異有統(tǒng)計學(xué)意義為標(biāo)準(zhǔn)。建立統(tǒng)一的基本狀態(tài)的評定量表對與不同實驗之間的平行對比有一定的現(xiàn)實意義。在量表指標(biāo)采集過程中，還可以通過攝像機錄像采集指標(biāo)的方式，進一步減少指標(biāo)采集過程中的人為干擾因素。

1.1.2體重 體重是CFS模型動物衡量標(biāo)準(zhǔn)中較易獲取，且相對客觀的評價指標(biāo)。模型動物在CFS造模過程中的體重均表現(xiàn)為減輕，以實驗前后體重數(shù)值差異有統(tǒng)計學(xué)意義為造模成功標(biāo)準(zhǔn)?？稍谠炷ｉ_始時、進程中、完成時分次測量，動態(tài)展示體重減輕過程。但某些造模方式為模擬運動性疲勞而強迫大鼠游泳或跑步，是否因運動量增加而引起體重改變從而產(chǎn)生誤差和偏移，值得進一步思考、探索。

1.2行為學(xué)實驗

1.2.1力竭游泳實驗 力竭游泳實驗為強迫游泳實驗的一種變體，強迫游泳實驗是抗抑郁藥物的篩選及相關(guān)受體的研究實驗，通過觀察泳池中動物模型的各種行為動作達到實驗?zāi)康?，可分為傳統(tǒng)型與改良型。力竭游泳實驗在此基礎(chǔ)上做出相應(yīng)改良，可以涵蓋多方面刺激，如溫度、體力及精神等，包含心理與身體兩種應(yīng)激原，更加貼合CFS心理和身體雙重疲勞的特性[6]，具體做法為將實驗用鼠置于水溫恒定的泳池中，水深以鼠類不能接觸池底為準(zhǔn)，強制鼠類游泳，不動時用木棒驅(qū)趕，維持其運動狀態(tài)。力竭標(biāo)準(zhǔn)為實驗動物不能再堅持游泳動作，沉入水底數(shù)秒不能回到水面，實驗用鼠達到力竭標(biāo)準(zhǔn)后，取出晾干，并記錄時間。本實驗既可用于造模，也可用于評價，以時間差異有統(tǒng)計學(xué)意義為標(biāo)準(zhǔn)，如牛占忠等[7]采用力竭游泳加睡眠剝奪方法成功建立CFS鼠類模型的同時，將力竭游泳作為造模是否成功及治療是否有效的衡量標(biāo)準(zhǔn)。也可在實驗鼠尾后增加配重，加快實驗進程[8]。

1.2.2曠場實驗 曠場實驗最初由Hall于20世紀(jì)研發(fā)，目前應(yīng)用十分廣泛[9]。該實驗利用鼠類畏懼空曠場地的趨避性與面對新鮮事物的好奇心之間的矛盾心理[10]，通過對曠場中鼠類的運動路程、運動速度、具體運動軌跡及在曠場中的表現(xiàn)(理毛行為等)的觀察，檢測鼠類自發(fā)活動和探索行為，一般用來檢測藥物的副作用。在CFS鼠類模型中，曠場實驗多作為造模方法及干預(yù)措施。其具體操作與原始操作未發(fā)生較大變動，均為將鼠類放置于特定封閉曠場中，記錄特定時間內(nèi)鼠類行為。但觀察指標(biāo)略有差異，既可按照傳統(tǒng)實驗進行觀察，仍將運動路程、運動速度及理毛次數(shù)作為指標(biāo)，也可將跨格數(shù)量(三爪或四爪進入另一格為準(zhǔn))作為新的觀察指標(biāo)[11]。還可將跨格數(shù)作為水平運動，另加入垂直運動(兩后腿支撐身體，前爪離地)和(或)中央格停留時間作為指標(biāo)[12]，各指標(biāo)均按實驗前后差異有統(tǒng)計學(xué)意義為標(biāo)準(zhǔn)。該實驗操作簡單、可重復(fù)，所得數(shù)據(jù)表達信息豐富，一次實驗就可以對動物的自發(fā)活動、探索行為及焦慮抑郁狀態(tài)進行定量評價[13]，利用影像技術(shù)還可以進一步減少人為誤差的影響，但需注意實驗用鼠最好選用雄鼠，以最大限度避免雌鼠動情周期對結(jié)果的影響。實驗時需將實驗動物提前運送至實驗室，使其充分適應(yīng)環(huán)境，減少鼠類緊張因素對實驗結(jié)果的影響。實驗前及上一鼠實驗結(jié)束后要及時清理裝置，確認(rèn)裝置無味，尤其注意徹底清除上次實驗留下的鼠類排泄物及氣味，避免干擾。

1.2.3鼠尾懸吊實驗 在CFS模型研究中，鼠尾懸吊實驗主要用于衡量造模成功與否及干預(yù)措施的有效性，具體操作是將距鼠類尾尖一定距離(一般是5 cm)固定于特定實驗裝置上，使其呈倒懸狀態(tài)，頭部及前爪不能接觸地面，并用紙板隔開動物視線，減少外界干擾，記錄規(guī)定時間內(nèi)動物不動時間，并觀察動物掙扎的劇烈程度。該實驗的原理為動物處于不正常體位狀態(tài)時，會有自發(fā)糾正的行為，但根據(jù)不同個體的身體及心理因素，會逐漸進入一種絕望而不動的狀態(tài)，而不動時間可反映個體的心理狀態(tài)，并可以很好地模擬人類的抑郁狀態(tài)[14]。盡管對于鼠尾懸吊實驗中動物出現(xiàn)的不動狀態(tài)是因身體因素所致，還是心理因素所致仍存在爭議[15]，但因CFS具有心理、身體雙重疲勞的特性，故不影響該實驗在慢性疲勞研究中的應(yīng)用。研究中，除以不動時間、掙扎劇烈程度為評價標(biāo)準(zhǔn)外，還可以觀察實驗動物的抬頭次數(shù)。需注意的是鼠尾懸吊實驗對動物有一定的損害，實驗時間不宜過長。

1.2.4迷宮實驗 迷宮實驗包括許多類型，如Moriss水迷宮、高架十字迷宮、T形迷宮、放射臂水迷宮等，在CFS動物模型評價中應(yīng)用較多的有Moriss水迷宮與高架十字迷宮。

1.2.4.1Moriss水迷宮 水迷宮實驗是利用鼠類在水中求生的本能，對鼠類的空間位置感、方向感以及學(xué)習(xí)記憶能力等復(fù)雜生理功能進行測試[16]。經(jīng)典的水迷宮實驗是由定位巡航實驗與空間探索實驗組成，其中定位巡航實驗是指從池壁隨機釋放受試動物，記錄其找到水中隱藏逃生平臺的平均時間，空間探索實驗是指撤走逃生平臺后，原受試動物在特定時間內(nèi)跨越原平臺位置的次數(shù)，后一實驗中所有動物必須為同一入水點。

Moriss水迷宮實驗在CFS模型評價中，可以按經(jīng)典實驗同時完成兩個子實驗[17]，也可以僅做定位巡航實驗[5]，還可對其游泳速度做出測量[18]，所衡量項目均與經(jīng)典實驗相似，變化不大，以差異有無統(tǒng)計學(xué)意義為標(biāo)準(zhǔn)。與其他迷宮實驗相比，Moriss水迷宮實驗的優(yōu)勢為可減少實驗鼠嗅覺對實驗結(jié)果的影響，但對實驗的設(shè)備要求較高，且實驗人員也應(yīng)注意自身及實驗環(huán)境中其他物體的位移對實驗結(jié)果的影響。嚙齒類動物具有較良好的記憶能力，經(jīng)過訓(xùn)練的動物在較長時間里不會忘記行動軌跡，如同一實驗中造模后及治療后均需要進行評價，需要考慮動物的記憶效應(yīng)對評價的干擾。

1.2.4.2高架十字迷宮 高架十字迷宮實驗設(shè)備是由一對開放的平臺區(qū)(開放臂)和一對封閉的暗箱區(qū)(封閉臂)組成的“十字”構(gòu)成，再將其架高，與地面有一定高度，使測試對象的探索區(qū)域相對固定。利用受試對象面對新環(huán)境(開放臂)的好奇探索與嗜暗天性(封閉臂)之間的沖突心理[19]，通過對受試對象迷宮內(nèi)表現(xiàn)的觀察，完成受試對象焦慮程度的測量。對該實驗的信度檢測復(fù)測顯示，其結(jié)果穩(wěn)定可靠，所反映的是受試對象的特質(zhì)焦慮，而非狀態(tài)焦慮[20]。高架十字迷宮實驗在CFS模型評價中的應(yīng)用普及程度較水迷宮實驗低，它既可用于焦慮模型的建立，也是國際上公認(rèn)的經(jīng)典測量焦慮反應(yīng)的方法。在此實驗中，充當(dāng)CFS動物模型精神狀態(tài)的測量指標(biāo)是由跟蹤設(shè)備記錄的大鼠進入開放臂次數(shù)(open arm entry，OE)、開放臂停留時間(open arm time，OT)、進入封閉臂次數(shù)(closed arm entry，CE)及封閉臂停留時間(closed arm time，CT)，并計算進入開放臂次數(shù)百分比[OE%=OE/(OE+CE)×100%]以及在開放臂停留時間百分比[OT%=OT/(OT+CT)×100%]。OE及OT減少反映大鼠焦慮情緒加重。

1.2.5抓力實驗 抓力實驗可以對鼠類耐力及肌肉力量做出測量，反映實驗鼠類的疲勞程度。實驗方法是將小鼠放置在水平固定的抓力測定儀抓力板上，抓住其尾部水平向后牽拉，待實驗鼠抓牢抓力板，逐漸加大牽拉力度，直至小鼠松爪，等待儀器記錄抓力數(shù)值，多次測量取平均值作為測量結(jié)果[21]，以實驗鼠實驗前后的測量結(jié)果差異有統(tǒng)計學(xué)意義為造模成功標(biāo)準(zhǔn)。因該實驗僅能對小鼠體力疲勞程度做出反應(yīng)，不包含心理疲勞，且需專業(yè)儀器進行測量，故在研究中應(yīng)用較少。

2 客觀評價指標(biāo)及CFS中醫(yī)分型評價標(biāo)準(zhǔn)

2.1相關(guān)客觀評價指標(biāo) 由于對CFS病因病機的研究不夠深入，臨床上CFS的診斷多以癥狀學(xué)為主，缺乏特異性診斷指標(biāo)。其動物模型也沒有特定客觀指標(biāo)評價，相關(guān)文獻中客觀評價指標(biāo)多用于病因病機猜想的論證及干預(yù)措施有效性評價，現(xiàn)將常見的相關(guān)指標(biāo)按病因病機分類整理如下。

2.1.1免疫系統(tǒng)指標(biāo) CFS患者與正常人群的大量對比顯示，患者體內(nèi)存在高水平炎癥介質(zhì)，提示免疫系統(tǒng)與CFS關(guān)系密切[22]。其可能的病理機制是在多種不良因素的長期刺激下，免疫系統(tǒng)處于慢性應(yīng)激狀態(tài)，機體形成了相對穩(wěn)定的免疫反應(yīng)，進而產(chǎn)生許多高水平炎癥介質(zhì)[23]。在科研工作中，可以將這些炎癥介質(zhì)水平作為衡量疾病發(fā)展及干預(yù)措施有效性的重要指標(biāo)。在CFS動物模型中，應(yīng)用較多的有白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1β、IL-2、IL-6、IL-10、腫瘤壞死因子-α等[24-25]。

2.1.2神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)指標(biāo) 研究發(fā)現(xiàn)，CFS的發(fā)生發(fā)展與下丘腦-垂體-腎上腺軸功能異常有關(guān)，其諸多臨床表現(xiàn)與腎上腺皮質(zhì)功能紊亂的臨床表現(xiàn)類似[26]。雖然目前對CFS鼠類模型體內(nèi)下丘腦-垂體-腎上腺軸各激素含量變化仍存在爭議，但皮質(zhì)醇、促腎上腺皮質(zhì)激素、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素作為該軸主要效應(yīng)激素，其含量均被用作衡量CFS模型的重要指標(biāo)。在相關(guān)實驗中，神經(jīng)內(nèi)分泌相關(guān)指標(biāo)佐證了干預(yù)措施有效性，又為CFS的發(fā)病機制做出了進一步的闡述[27-29]。

2.1.3抗氧化/氧化系統(tǒng)指標(biāo) 抗氧化系統(tǒng)與氧化系統(tǒng)相互對立并長期處于動態(tài)平衡的關(guān)系中。當(dāng)機體處于長期疲勞中，抗氧化系統(tǒng)不能清除所有氧化系統(tǒng)的自由基，這種平衡就會被打破，產(chǎn)生氧化應(yīng)激。自由基的堆積會影響正常的細(xì)胞活動，最終損傷機體[30]。

在氧化應(yīng)激的發(fā)生過程中，因AMP/ATP比值升高而激活的AMP活化的蛋白激酶，可以作為反映機體能量代謝水平的指標(biāo)。由氧自由基與不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)產(chǎn)生的丙二醛，可以反映脂質(zhì)過氧化程度?？寡趸到y(tǒng)清除自由基最重要的酶類——超氧化物歧化酶，是機體抗氧化能力的重要指標(biāo)。這三者在相關(guān)文獻中被作為觀察指標(biāo)及干預(yù)措施有效性檢測指標(biāo)[31-33]。

2.2中醫(yī)分型CFS模型評價標(biāo)準(zhǔn) 在中醫(yī)學(xué)中，CFS屬于勞倦、懈怠、四肢不欲動等病癥[34]，病位以肝、脾、腎居多，CFS的中醫(yī)分型多圍繞此三臟。目前，關(guān)于CFS的中醫(yī)分型模型及評價標(biāo)準(zhǔn)研究較少，王宇航等[35]用一般情況、體重、行為學(xué)實驗評價腎虛型CFS鼠類模型，其中一般情況及體重是腎虛的評價方式，力竭游泳與曠場實驗為CFS的評價方式。馮玉華等[36]用飲食失調(diào)、疲勞過度、情緒失調(diào)的方法構(gòu)建脾氣虛CFS大鼠模型，用一般狀態(tài)(包括精神狀態(tài)、活動情況、飲食、大小便以及外觀行為變化)和體重變化作為評價指標(biāo)。在CFS中醫(yī)分型的模型評價中，應(yīng)充分體現(xiàn)“病證結(jié)合”的基本原則[37]，兼顧“病”與“證”的主要表現(xiàn)。在上述腎虛與脾氣虛CFS鼠類模型中，對于“病證結(jié)合”的評價原則均有所體現(xiàn)，而對腎虛及脾氣虛的主要表現(xiàn)的評價仍有待加強。

3 小 結(jié)

目前，以癥狀學(xué)為基礎(chǔ)的CFS鼠類動物模型研究已取得長足進步，造模及評價方式基本還原CFS社會心理應(yīng)激、長期疲勞等病因[38]。模型評價方式以行為學(xué)實驗為主，將常用評價方式單獨或組合應(yīng)用，但在具體實驗中尚存在如下問題：①所用評價方法不統(tǒng)一，對于不同的CFS造模實驗，實驗時間及實驗強度均不同。但其評價僅以實驗前后差異有無統(tǒng)計學(xué)意義為標(biāo)準(zhǔn)，無法對動物模型疲勞程度的“量”及是否患病的“質(zhì)”做出區(qū)分，亦不利于不同干預(yù)水平的比較。②評價采用的實驗方法往往只能體現(xiàn)身體或心理等單一層面疲勞問題，對于CFS這種多層面疾病，不能反映疾病的全貌。③客觀評價指標(biāo)相對較少?；谝陨蠁栴}，建議在今后的模型建立及評價中，針對疾病不同狀態(tài)、不同種類實驗動物采用與之相應(yīng)的、優(yōu)化的、具有針對性的造模及評價方法，以利于進行不同干預(yù)措施的水平比較；為避免鼠類在評價方式下產(chǎn)生耐受，影響實驗結(jié)果，造模方法與評價方法應(yīng)盡量考慮動物的記憶與適應(yīng)能力，且其評價方法應(yīng)包含生理及心理應(yīng)激原的雙重檢測；至于相關(guān)客觀評價指標(biāo)，則仍有賴于對CFS病因病機的進一步揭示。