川崎病急性期相關(guān)的生物標(biāo)志物研究進(jìn)展

吳玉秀，張永峰

(濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院兒科，山東 濰坊 261000)

川崎病是一種主要發(fā)生在5歲以下兒童的急性、自限性、發(fā)熱性血管炎。1967年日本川崎富作(Tomisaku Kawasaki)博士首先報(bào)道該病，并將其命名為川崎病[1-2]。川崎病的發(fā)病率、死亡率、臨床表現(xiàn)、冠狀動(dòng)脈損傷情況、預(yù)后等存在地域和種族差異，目前對于該病的認(rèn)知還十分淺顯。川崎病的臨床特征與許多兒童時(shí)期的傳染性疾病(麻疹、猩紅熱、腺病毒感染等)相似，均有發(fā)熱、皮疹、口腔黏膜彌漫充血、淋巴結(jié)腫大以及炎癥指標(biāo)升高等表現(xiàn)。對于川崎病患兒，尤其是不完全川崎病患兒，如不能及時(shí)早期診治，約25%的川崎病患兒會發(fā)生冠狀動(dòng)脈病變，這會嚴(yán)重影響患兒的預(yù)后。

川崎病病程分為急性期、亞急性期和恢復(fù)期，其中急性期的特征是壞死性血管炎，以中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤為主，炎癥標(biāo)志物升高[3]，但炎癥標(biāo)志物是非特異性的，在其他炎癥和感染性疾病中也會升高。在川崎病的診療過程中，盡管炎癥性生物標(biāo)志物提示機(jī)體正在發(fā)生的炎癥反應(yīng)，但在確定性診斷中的價(jià)值有限。與其他血管炎性疾病和風(fēng)濕病不同，川崎病沒有可以明確診斷的特異性實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)、病理指標(biāo)等。因而，在川崎病急性期發(fā)現(xiàn)與川崎病相關(guān)的生物標(biāo)志物，可為川崎病早期診斷、預(yù)測疾病進(jìn)程、免疫球蛋白耐藥及冠狀動(dòng)脈后遺癥傾向提供參考?，F(xiàn)從基因、蛋白、免疫、血漿4個(gè)方面對川崎病急性期相關(guān)生物標(biāo)志物予以綜述，以便早期識別川崎病，更好地指導(dǎo)臨床工作。

1 基因標(biāo)志物

川崎病在亞裔人群中的發(fā)病率明顯高于白種人群，這可能由生活環(huán)境或生活方式的差異導(dǎo)致，但也有可能由遺傳易感性導(dǎo)致[4]。在夏威夷定居的日裔中，川崎病的發(fā)病率也較高，并與日本本土人的發(fā)病率相似[5]，提示該病可能與遺傳有關(guān)。運(yùn)用候選基因方法和全基因組關(guān)聯(lián)研究方法，在疾病急性期識別易感基因可為川崎病的早期診斷提供幫助，同時(shí)也為尋找新的藥物靶點(diǎn)提供依據(jù)。

1.1B淋巴酪氨酸激酶(B lymphoid tyrosine kinase,BLK)基因 BLK基因編碼B細(xì)胞上的類固醇受體共激活子家族的B淋巴酪氨酸激酶，其在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路下游的幾個(gè)基因中起作用。BLK基因參與了免疫球蛋白A和免疫球蛋白B的免疫受體酪氨酸激活基序殘基的磷酸化，且BLK基因的突變會導(dǎo)致胰腺B細(xì)胞功能異常，從而導(dǎo)致川崎病患兒內(nèi)環(huán)境紊亂[6]。Lee等[7]發(fā)現(xiàn)，BLK在B細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮作用。在川崎病急性期，B細(xì)胞中的rs2736340風(fēng)險(xiǎn)等位基因參與了BLK的低表達(dá)，影響了川崎病患者B細(xì)胞的功能，增加了川崎病的易感性。此外，川崎病急性期，丙種球蛋白給藥前，BLK信使RNA的表達(dá)較高，但丙種球蛋白給藥后BLK信使RNA的表達(dá)降低，恢復(fù)期進(jìn)一步降低[8]。以上研究表明，在未給予任何藥物干預(yù)之前，川崎病急性期患兒體內(nèi)BLA信使RNA高表達(dá)。BLK基因突變使得其信使RNA表達(dá)異常、B細(xì)胞功能異常，導(dǎo)致川崎病患兒機(jī)體代謝紊亂，增加了川崎病的基因易感性。

1.2鈣釋放激活鈣通道調(diào)節(jié)分子1(calcium release-activated calcium channel modulator 1,ORAI1) 基因 ORAI1是一種涉及T細(xì)胞調(diào)節(jié)和炎癥反應(yīng)的鈣離子通道蛋白。Onouchi等[9]發(fā)現(xiàn)，日本人群中ORAI1基因第2外顯子的單核苷酸多態(tài)性(rs3741596)與川崎病具有顯著的非同義關(guān)聯(lián)，并伴有川崎病高風(fēng)險(xiǎn)，單核苷酸多態(tài)性會導(dǎo)致ORAI1的第2個(gè)胞外環(huán)中第218位的氨基酸從絲氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楦拾彼?。在后繼的研究中發(fā)現(xiàn)，日本人群中ORAI1(rs3741596)風(fēng)險(xiǎn)等位基因頻率是歐洲人的20倍，同時(shí)ORAI1基因的變異體(rs141919534)也與川崎病密切相關(guān)[10]。據(jù)報(bào)道，ORAI1基因編碼的蛋白質(zhì)與川崎病的易感性相關(guān)，ORAI1基因變異體影響了ORAI1基因相關(guān)蛋白質(zhì)的合成與加工，進(jìn)而影響了ORAI1基因編碼的蛋白質(zhì)，增加了川崎病的易感性[11]。以上研究表明，通過基因檢測技術(shù)檢測與川崎病易感性相關(guān)的基因及其變異體，可在急性期及時(shí)發(fā)現(xiàn)并識別川崎病，為川崎病的治療提供幫助。

1.3胱天蛋白酶3基因 胱天蛋白酶3基因位于第4號染色體，編碼胱天蛋白酶3，其是活化誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的重要分子。Onouchi等[12]報(bào)道，胱天蛋白酶3基因表達(dá)的改變影響免疫效應(yīng)細(xì)胞對川崎病的敏感性。研究顯示，胱天蛋白酶3基因5′非翻譯區(qū)的單核苷酸多態(tài)性(rs72689236)會增加歐美人群和日本人群川崎病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，在胱天蛋白酶3基因中發(fā)現(xiàn)的多種變異體(rs2702038、rs72689236及rs113420705)與川崎病顯著關(guān)聯(lián)[12-13]。此外，Wang等[14]研究表明，Ca2+/活化T細(xì)胞核因子信號中的多種遺傳變異均與中國人川崎病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，不同變體[CASP3 rs2720378、白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-2 rs2068962和基質(zhì)相互作用分子1 rs1561876]也可通過協(xié)同作用增加罹患川崎病的風(fēng)險(xiǎn)。

綜上所述，通過遺傳學(xué)方法鑒定出川崎病急性期易感基因，基于這些基因制訂臨床標(biāo)準(zhǔn)將改善川崎病的診斷靈敏度，有助于及早治療和預(yù)防冠狀動(dòng)脈損傷。

2 蛋白標(biāo)志物

隨著質(zhì)譜法蛋白質(zhì)組學(xué)分析研究的出現(xiàn)，與川崎病相關(guān)的蛋白生物標(biāo)志物研究取得了顯著進(jìn)展，盡管先前的研究希望通過基因表達(dá)早期診斷川崎病，但基于蛋白質(zhì)的發(fā)現(xiàn)可能更容易轉(zhuǎn)化為具有臨床實(shí)用性的檢測方法，從而幫助兒科臨床醫(yī)師在疾病急性期識別川崎病。

2.1N端腦鈉肽前體(N-terminal pro-brain natriunetic peptide,NT-proBNP) NT-proBNP是目前研究較多的一種蛋白，主要影響心臟功能，其水平升高提示心臟容量負(fù)荷過重，心功能不全。NT-proBNP在川崎病急性期也升高，可作為川崎病急性期的生物標(biāo)志物。楊芳等[15]依據(jù)患兒入院時(shí)的病程(主要分為≤7 d，8～11 d，12～21 d)、NT-proBNP的水平(截點(diǎn)值為300 ng/L)以及心動(dòng)圖檢測的冠狀動(dòng)脈情況，對川崎病患兒(包括154例典型川崎病和102例不完全川崎病)進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，病程早期(病程≤7 d)，NT-proBNP≥300 ng/L的患兒冠狀動(dòng)脈損害發(fā)生率明顯升高。Lin等[16]的Meta分析顯示，NT-proBNP的截點(diǎn)值為96～260 ng/L時(shí)診斷川崎病的靈敏度為66%～98%。Reddy等[17]的研究也報(bào)道了NT-proBNP的截點(diǎn)值為125 ng/L時(shí)，診斷川崎病急性期的靈敏度為88%，特異度為96%。以上研究表明，川崎病急性期NT-proBNP的水平可升高，對NT-proBNP的截點(diǎn)值進(jìn)行研究有望幫助兒科醫(yī)師在疾病急性期明確診斷并進(jìn)行針對性治療。

2.2半乳糖凝集素3(galectin 3，Gal-3) Gal-3是由活化的巨噬細(xì)胞分泌的一種β半乳糖凝集素，常被用作心力衰竭的潛在生物標(biāo)志物。川崎病急性期患兒體內(nèi)的Gal-3水平有不同程度的升高。Hoshino等[18]的研究在矯正川崎病患兒的性別和年齡后發(fā)現(xiàn)，射血分?jǐn)?shù)正常的川崎病患兒體內(nèi)的Gal-3水平較急性期射血分?jǐn)?shù)減低史川崎病患兒低。在后繼的研究中發(fā)現(xiàn)，盡管所有患者的射血分?jǐn)?shù)在治療后恢復(fù)正常，但是Gal-3水平在初次發(fā)病后數(shù)年仍較高[19]。國內(nèi)也有學(xué)者報(bào)道，川崎病患兒Gal-3水平在急性期明顯升高，并隨著病程的進(jìn)展緩慢下降，通過檢測體內(nèi)Gal-3水平可幫助早期識別川崎病[20]。

2.3其他蛋白標(biāo)志物 研究顯示，可溶性生長刺激表達(dá)基因2蛋白、心肌肌鈣蛋白、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、血小板反應(yīng)蛋白-1和血小板反應(yīng)蛋白-2等的水平在川崎病急性期顯著升高[21]，它們有助于為川崎病急性期相關(guān)生物標(biāo)志物研究提供新方向。

Jakob等[22]采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)對23例川崎病急性期患者和5例康復(fù)期川崎病患者的血管內(nèi)皮損傷標(biāo)志物血管性血友病因子(von willebrand factor,vWF)參數(shù)(vWF:抗原和vWF:膠原蛋白結(jié)合活性)進(jìn)行評估。通過計(jì)算vWF:抗原和vWF:膠原蛋白結(jié)合活性的比率以及對vWF多聚體結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，急性期vWF:抗原和vWF:膠原蛋白結(jié)合活性水平顯著高于恢復(fù)期，提示vWF:抗原和vWF:膠原蛋白結(jié)合活性的比率能夠早期預(yù)測川崎病的發(fā)生。Kimura等[23]使用基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)分析鑒定差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，研究鑒定出4種與川崎病相關(guān)的蛋白：脂多糖結(jié)合蛋白、富含亮氨酸的α-2-糖蛋白、血管緊張素原和視黃醇結(jié)合蛋白4,其中急性期脂多糖結(jié)合蛋白、富含亮氨酸的α-2-糖蛋白、血管緊張素原的水平顯著高于恢復(fù)期，但視黃醇結(jié)合蛋白4急性期的水平較恢復(fù)期低。以上兩個(gè)研究表明，對于vWF參數(shù)的全面分析可能有助于監(jiān)測川崎病急性期的炎癥反應(yīng)，并有助于識別冠心病風(fēng)險(xiǎn)增加的患者。在急性期檢測出高水平的脂多糖結(jié)合蛋白、富含亮氨酸的α-2-糖蛋白和血管緊張素原為預(yù)測川崎病的發(fā)生提供了依據(jù)。

3 免疫標(biāo)志物

3.1CD8T細(xì)胞 CD8T細(xì)胞活化后可以分化為細(xì)胞毒性T細(xì)胞，其可以抵制各種病毒的入侵以及殺滅外來的病原體。CD8T細(xì)胞及其早期活化的生物標(biāo)志在川崎病急性期高表達(dá)，并與冠狀動(dòng)脈損傷密切相關(guān)[24-25]。Rivas等[24]對伴有冠狀動(dòng)脈損傷的川崎病患者的尸體進(jìn)行檢查后發(fā)現(xiàn)，CD8+T細(xì)胞優(yōu)先隔絕在冠狀動(dòng)脈中，并引起炎癥性血管炎。不僅CD8T細(xì)胞，早期T細(xì)胞活化的標(biāo)志物CD69+CD8T細(xì)胞在川崎病患兒急性期也明顯增加[25]。

3.2髓樣樹突狀細(xì)胞(myeloid dendritic cell,mDC) mDC來源于造血干細(xì)胞，主要發(fā)揮抗原呈遞作用。mDC作為獲得性免疫與固有免疫之間的橋梁，已被證實(shí)在川崎病患者中減少。在川崎病急性期，mDC的下降是受累組織的再循環(huán)或外周破壞增加所致[26]。Burns等[27]認(rèn)為，只有年齡較大的兒童在整個(gè)免疫循環(huán)中有大量成熟mDC,這一特征使得川崎病患兒表現(xiàn)出嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，表現(xiàn)為紅細(xì)胞沉降率升高，丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶水平升高，彌散性血管內(nèi)凝血和心肌炎。以上研究表明，川崎病急性期炎癥反應(yīng)上調(diào)可能是由于固有免疫軸存在功能障礙導(dǎo)致，因此mDC能夠成為早期預(yù)測川崎病的生物標(biāo)志物。

3.3IL-17A IL-17A是一種主要由輔助性T細(xì)胞17產(chǎn)生的促炎性細(xì)胞因子，輔助性T細(xì)胞17及其產(chǎn)生的IL-17A通過上調(diào)其他細(xì)胞因子和基質(zhì)金屬蛋白酶而發(fā)揮促炎作用[28]。血清IL-17A的水平與川崎病急性期和亞急性期病情活動(dòng)呈正相關(guān)，血清IL-17A水平可指導(dǎo)丙種球蛋白的用藥[29-31]。Guo等[29]采集丙種球蛋白治療前24 h以及丙種球蛋白治療后3 d、21 d川崎病組患兒和發(fā)熱對照組患兒的血液樣本進(jìn)行分析，結(jié)果顯示丙種球蛋白治療前24 h，川崎病組患兒的血漿IL-17A水平較發(fā)熱對照組顯著升高[(25.35±3.21) ng/L比(7.78±1.78) ng/L]，而兩組患兒的IL-17A水平在丙種球蛋白治療后3 d和21 d明顯降低，說明在川崎病急性期IL-17水平較高，IL-17A可能是川崎病早期診斷最為重要的生物標(biāo)志物之一。Jia等[30]的研究也發(fā)現(xiàn)，川崎病患兒的IL-17A水平較高。劉欣等[31]的研究同樣證實(shí)，川崎病急性期及亞急性期血清IL-17A的水平均升高。

綜上所述，由于免疫系統(tǒng)紊亂，川崎病急性期產(chǎn)生了大量異常的免疫細(xì)胞、化學(xué)因子等，導(dǎo)致血管炎的形成。

4 血漿標(biāo)志物

目前川崎病僅依靠臨床表現(xiàn)診斷，血液檢查和儀器檢查輔助診斷，但由于川崎病是由感染性因素誘發(fā)的自身免疫性疾病，因此難以區(qū)分川崎病與感染性相關(guān)疾病，尤其是兩者均伴隨發(fā)熱時(shí)。目前關(guān)于川崎病血漿標(biāo)志物的研究很少將感染引起發(fā)熱的患兒設(shè)為對照組，且大多數(shù)研究均是基于單個(gè)生物標(biāo)志物來預(yù)測川崎病的發(fā)生的。使用多個(gè)生物標(biāo)志物聯(lián)合測定診斷川崎病較單個(gè)生物標(biāo)志物測定更能早期識別川崎病，并為川崎病的早期診斷提供依據(jù)。

血漿炎癥標(biāo)志物種類很多，如C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein,CRP)、髓樣相關(guān)蛋白8/14(myeloid-related protein 8/14,MRP8/14)、人中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(human neutrophil elastase,HNE)。CRP是一種急性期炎癥蛋白，其可與微生物上的多糖結(jié)合，觸發(fā)經(jīng)典的補(bǔ)體途徑，并啟動(dòng)先天性免疫應(yīng)答[32]。CRP通常在急性感染和發(fā)熱期升高[33-34]。MRP8/14被認(rèn)為是多種炎癥性疾病的生物標(biāo)志物，包括炎性腸病和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎[35-37]。HNE是中性粒細(xì)胞活化的標(biāo)志物。有研究報(bào)道，川崎病急性期HNE水平升高[38]。Zandstra等[32]的研究包含1個(gè)發(fā)現(xiàn)隊(duì)列和2個(gè)獨(dú)立驗(yàn)證隊(duì)列，結(jié)果顯示，在發(fā)現(xiàn)隊(duì)列中，MRP8/14聯(lián)合CRP可以區(qū)分川崎病患者(n=48)與和感染發(fā)熱患者(n=105),曲線下面積為0.88；第1個(gè)驗(yàn)證隊(duì)列證實(shí)了MRP8/14聯(lián)合CRP可區(qū)分急性期川崎病患者(n=26)與感染發(fā)熱患者(n=150)，曲線下面積為0.78；同樣，MRP8/14聯(lián)合CRP也可區(qū)分第2個(gè)驗(yàn)證隊(duì)列的急性川崎病患者(n=25)和感染發(fā)熱患者(n=50)，曲線下面積為0.72，當(dāng)包括HNE時(shí)，曲線下面積可以提高到0.84。該研究還發(fā)現(xiàn)，MRP8/14、CRP、HNE聯(lián)合使用時(shí)更有助于鑒別川崎病和感染發(fā)熱兒童。值得注意的是，在川崎病急性期后的1、2、3個(gè)月在患兒的血液樣本中仍有可能檢測到HNE，且發(fā)病5年以上的有冠狀動(dòng)脈瘤的川崎病患兒中CRP仍然升高[33]。這表明，輕度炎癥在亞臨床的存在時(shí)間可能較以往認(rèn)為的更長。綜上，MRP8/14、CRP和HNE聯(lián)合使用可能有助于區(qū)分川崎病和疑似感染。

5 小 結(jié)

在川崎病急性期尋找一些特異性較高且能充分應(yīng)用于臨床的生物標(biāo)志物以幫助臨床兒科醫(yī)師早期識別川崎病已成為當(dāng)務(wù)之急?；驑?biāo)志物和免疫標(biāo)志物因其復(fù)雜性很難應(yīng)用于臨床，基于質(zhì)譜法的蛋白質(zhì)組學(xué)分析對于低水平的血清蛋白質(zhì)標(biāo)志物檢出率較低，而單個(gè)血漿標(biāo)志物對川崎病預(yù)測缺少特異性和敏感性。以上提示對于川崎病急性期相關(guān)生物標(biāo)志物進(jìn)一步開展多中心大樣本研究的必要性，以期早期識別對川崎病敏感性和特異性較高的生物標(biāo)志物。