水凝膠材料在骨骼肌組織再生的研究進(jìn)展

寧曉橋 劉 湘 晉 茹 葉 國

1.口腔疾病與生物醫(yī)學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 重慶市高校市級口腔生物醫(yī)學(xué)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400000；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院附三院門診部，重慶 400000

骨骼肌在人體內(nèi)數(shù)量豐富， 約占成年人體重的40%[1]。 輕微損傷的骨骼肌具有極高的再生能力，但由于戰(zhàn)傷、車禍傷等導(dǎo)致骨骼肌大體積缺失（volumetric muscle loss，VML）[2]，包括衛(wèi)星細(xì)胞、血管周圍干細(xì)胞等再生必需成分丟失，內(nèi)源性自我修復(fù)能力就會嚴(yán)重受損。 肌肉再生不足會出現(xiàn)過度纖維化和瘢痕形成，導(dǎo)致肌肉功能障礙甚至功能喪失，極大影響患者的生活質(zhì)量[3]。

目前臨床可采用自體健康的骨骼肌組織替代受損或缺失的肌肉，而自體組織移植成本高昂且伴隨較大風(fēng)險(xiǎn)，手術(shù)成功后也不能保證完全恢復(fù)功能[4]。 因此，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，骨骼肌組織的修復(fù)與再生備受關(guān)注。 近年來，已經(jīng)嘗試將脫細(xì)胞生物支架、生長因子、干細(xì)胞及其他天然和人工合成材料用于骨骼肌的再生和功能恢復(fù)[5]。 但在肌肉組織結(jié)構(gòu)完整性嚴(yán)重受損的情況下， 單純的細(xì)胞輸送存在植入細(xì)胞存活不良、植入位點(diǎn)細(xì)胞滯留時(shí)間短等問題[6-7]，而直接注射細(xì)胞因子也不可行，將細(xì)胞、細(xì)胞因子與生物支架材料結(jié)合將會更適用于骨骼肌的再生。

在眾多支架材料中，水凝膠作為一種以水為分散介質(zhì)的高分子網(wǎng)絡(luò)體系，具有性質(zhì)柔軟、能吸收大量水分并保持一定形狀的特點(diǎn)[8]。它能均勻封裝細(xì)胞，并模擬天然組織的結(jié)構(gòu)和力學(xué)特性， 提供利于細(xì)胞存活、增殖、分化和骨骼肌組織再生修復(fù)的具有高含水量的獨(dú)特微環(huán)境[9]。 目前利用水凝膠輸送細(xì)胞和生長因子已成為骨骼肌組織再生的潛在解決方案，本文將對近年來水凝膠材料的分類、制備及其應(yīng)用于骨骼肌再生修復(fù)的最新研究綜述如下。

1 水凝膠的來源分類

1.1 天然水凝膠

天然水凝膠的原材料來自天然生物材料，通常為膠原、纖維蛋白、明膠、角蛋白、絲素等蛋白質(zhì)[10]，以及海藻酸鹽、透明質(zhì)酸、殼聚糖、纖維素等天然聚合物[11]。 天然水凝膠具有良好的生物相容性和生物活性，能促進(jìn)細(xì)胞黏附、增殖和組織修復(fù)再生[12]，但也存在不穩(wěn)定、強(qiáng)度較差、來源有限的問題，較難進(jìn)行化學(xué)修飾，在某些情況下還具有免疫原性[13]。

1.2 合成水凝膠

合成水凝膠可由聚乙二醇、聚丙烯酰胺、聚乳酸、聚乙醇酸等小分子單體或合成高分子制備，具有基本的結(jié)構(gòu)單元，可以根據(jù)應(yīng)用要求調(diào)整水凝膠的特性[14]，例如在聚乙二醇和纖維蛋白原組合制備光交聯(lián)水凝膠的過程中，通過改變聚乙二醇的分子量和比例即可調(diào)整水凝膠的彈性模量[15]。 合成水凝膠還具有可靠的原料來源和較長的保質(zhì)期，種類更加廣泛，可以大量生產(chǎn)，穩(wěn)定性好，但是合成過程中可能會引入化學(xué)交聯(lián)劑等有毒物質(zhì)成分，降解性和生物相容性欠佳[16]。

2 水凝膠的制備

通常情況下，水凝膠是通過物理或化學(xué)這兩種最基礎(chǔ)的交聯(lián)方式制成。 物理交聯(lián)主要包括范德華力、氫鍵、鏈纏結(jié)等，在較溫和的條件下即可形成聚合物網(wǎng)絡(luò)，例如對聚乙烯醇溶液進(jìn)行循環(huán)冷凍-解凍處理，即可形成水凝膠[17]。 物理交聯(lián)水凝膠沒有加入化學(xué)交聯(lián)劑，避免對組織造成潛在毒性，體內(nèi)運(yùn)用較為安全，但交聯(lián)結(jié)構(gòu)存在穩(wěn)定性差、力學(xué)性能低、快速降解等問題[18]。 化學(xué)交聯(lián)是通過共價(jià)鍵將網(wǎng)絡(luò)中的聚合物鏈連接而成，包括自由基聚合、輻射聚合等，化學(xué)交聯(lián)水凝膠聚合物鏈之間存在不可逆的、 永久性的連接，水凝膠具有穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)和優(yōu)異的力學(xué)性能，且降解性能可調(diào)[19]，不過水凝膠內(nèi)部也可能殘留有毒化學(xué)物質(zhì)，如未將水凝膠中殘留的交聯(lián)劑去凈，交聯(lián)劑還可能引起免疫炎癥反應(yīng)[20-21]。

3 水凝膠材料在骨骼肌再生的應(yīng)用

3.1 天然水凝膠

3.1.1 藻酸鹽水凝膠 海藻酸是一類來自褐藻或細(xì)菌細(xì)胞壁的天然多糖醛酸，來源豐富，生物相容性良好，具有非免疫原性[22]。 海藻酸具有溫和的凝膠行為，可以形成水凝膠輸送生長因子或其他藥物，也可用作組織工程細(xì)胞輸送的載體和支持基質(zhì)[23]。 單純的海藻酸鹽材料由于缺乏細(xì)胞識別位點(diǎn)， 不利于細(xì)胞黏附，需要通過改性來提高材料的細(xì)胞黏附能力和生長因子等的運(yùn)載和釋放效果，以滿足肌肉組織工程的應(yīng)用要求。 Ciriza 等[24]采用可注射的藻酸鹽基水凝膠運(yùn)載硼酸鈉，通過刺激細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)來促進(jìn)損傷后肌肉的再生。Yi 等[25]使用明膠和肝素改性的藻酸鹽水凝膠結(jié)合骨骼肌細(xì)胞外基質(zhì)培養(yǎng)骨骼肌祖細(xì)胞（skeletal muscle progenitor cells），材料能保持細(xì)胞活性，并為人骨骼肌祖細(xì)胞的生長和肌肉生成創(chuàng)造合適條件。

3.1.2 角蛋白水凝膠 角蛋白是頭發(fā)、 指甲的主要成分， 而角蛋白類材料具有生物降解性和生物相容性，可制成海綿、薄膜和水凝膠，在骨組織和神經(jīng)再生方面表現(xiàn)出積極效果[26]。 在骨骼肌再生方面，改變角蛋白的濃度和蛋白類型能調(diào)整水凝膠的彈性模量，制備不同降解速率的角蛋白水凝膠還能夠運(yùn)載生長因子并調(diào)節(jié)其釋放過程[27]。Baker 等[28]在小鼠背闊肌肌肉損傷模型植入載有骨骼肌祖細(xì)胞和不同生長因子的角蛋白水凝膠，載有堿性成纖維細(xì)胞生長因子和胰島素生長因子的水凝膠在植入2 個(gè)月后表現(xiàn)出更大的肌力恢復(fù)效果。 此外，Passipieri 等[29]將單純的角蛋白水凝膠以及載有生長因子的角蛋白水凝膠植入大鼠脛骨前肌肌肉缺損8 周和12 周后，能改善肌肉功能，形成更多的新生肌肉組織，提示角蛋白水凝膠材料不僅適用于細(xì)胞和生長因子的遞送，自身也具有一定促進(jìn)肌肉再生的效果，但是其促進(jìn)骨骼肌再生的具體機(jī)制尚不清楚。

3.1.3 纖維蛋白水凝膠 纖維蛋白是一種可用于細(xì)胞輸送的天然細(xì)胞外基質(zhì)， 是組織損傷后修復(fù)的支架，基于纖維蛋白的生物材料也應(yīng)用于肌肉組織工程。但是，單純植入纖維蛋白水凝膠材料后其肌肉再生效果有限，Marcinczyk 等[30]利用纖維蛋白原和層粘連蛋白-111 制備水凝膠， 雖然水凝膠在植入小鼠VML 損傷模型兩周后顯著改善了肌肉重量，但四周后卻沒有改善肌肉的重量和力量。將纖維蛋白水凝膠與細(xì)胞移植結(jié)合可能是實(shí)現(xiàn)肌肉組織再生的途徑，Kim 等[31]嘗試將載細(xì)胞的纖維蛋白凝膠以多次注射的方式植入裸鼠皮下，并顯示出更高的肌肉組織重建和功能改善能力。Liu 等[32]還制備具有大孔結(jié)構(gòu)的纖維蛋白水凝膠，包裹的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞表現(xiàn)出很高的存活率、增殖能力和肌源性分化能力。

3.1.4 透明質(zhì)酸水凝膠 透明質(zhì)酸是由N-乙酰葡糖胺和葡萄糖醛酸組成的雙糖單位， 廣泛分布于人體皮膚、晶狀體、軟骨等區(qū)域的細(xì)胞外基質(zhì)中，是細(xì)胞外基質(zhì)的主要組成部分[33]，其在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和傷口愈合中起著關(guān)鍵作用[34]。 透明質(zhì)酸水凝膠在肌肉再生中的應(yīng)用也表現(xiàn)出一定效果，研究發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)濃度的透明質(zhì)酸水凝膠與骨骼肌成肌細(xì)胞具有良好的相容性，水凝膠利于細(xì)胞黏附， 并能作為細(xì)胞生長的三維支架[35]。 將載有新分離衛(wèi)星細(xì)胞的透明質(zhì)酸水凝膠植入小鼠脛骨前肌肌肉缺損后，能顯著改善肌肉結(jié)構(gòu)和新生肌纖維數(shù)量，促進(jìn)肌肉功能恢復(fù)[36]。Goldman 等[37]還將添加層粘連蛋白-111 的透明質(zhì)酸水凝膠聯(lián)合碎肌移植來引導(dǎo)VML 缺損處的肌肉再生， 也恢復(fù)了肌肉的部分功能。

3.1.5 脫細(xì)胞外基質(zhì)水凝膠 脫細(xì)胞組織是去除組織或器官內(nèi)細(xì)胞成分而保留細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）成分和三維結(jié)構(gòu)的天然支架，具有生物相容性和生物活性[38]。ECM 水凝膠具有可注射性和填充不規(guī)則缺損的能力，在骨骼肌再生方面具有巨大潛力。 目前細(xì)胞外基質(zhì)水凝膠種類多樣，通過選擇合適的水凝膠并與細(xì)胞移植相結(jié)合，可能是一種更有效的骨骼肌再生方案。而不同來源的脫細(xì)胞外基質(zhì)也擁有不同的肌肉再生效果，利用脫細(xì)胞骨骼肌生產(chǎn)的可注射水凝膠能在體外誘導(dǎo)血管細(xì)胞和成肌細(xì)胞增殖[39]，豬真皮ECM 水凝膠利于C2C12 成肌細(xì)胞融合，而豬膀胱ECM 水凝膠在體內(nèi)降解更快且促肌肉再生效果更好[40]。 脫細(xì)胞外基質(zhì)水凝膠還可運(yùn)載細(xì)胞，Rao 等[41]利用脫細(xì)胞骨骼肌制備納米纖維細(xì)胞外基質(zhì)水凝膠，通過在水凝膠內(nèi)加入骨骼肌成纖維細(xì)胞，創(chuàng)造出一種能增強(qiáng)成肌細(xì)胞代謝活性和分化能力的特殊微環(huán)境，可提高可注射ECM 水凝膠運(yùn)載細(xì)胞的存活率， 緩解注射壓力和缺血環(huán)境對細(xì)胞的傷害。

3.1.6 殼聚糖衍生物水凝膠 殼聚糖作為一種天然多糖，具有生物相容性，能夠在體內(nèi)完全降解，但在水中的溶解度有限。 N-羧乙基殼聚糖（N-carboxyethyl chitosan，CECS）在水中具有足夠的溶解性，是用于細(xì)胞輸送的極佳候選材料[42]。 近年來，具有優(yōu)良導(dǎo)電性和水凝膠特性的導(dǎo)電水凝膠在組織再生方面顯示出巨大潛力[43]，而肌肉細(xì)胞固有的電興奮性也啟發(fā)研究人員將電活性支架應(yīng)用于骨骼肌再生。 Guo 等[44]利用N-羧乙基殼聚糖和葡聚糖接枝苯胺四聚體接枝4-甲酰苯甲酸（dextran-graft-aniline tetramer-graft-4-formyl benzoic acid）合成一系列可注射自愈性導(dǎo)電水凝膠，水凝膠表現(xiàn)出足夠的電活性和導(dǎo)電性，C2C12 細(xì)胞能從水凝膠基質(zhì)中釋放并表現(xiàn)出持續(xù)增殖能力，并且水凝膠還能在體內(nèi)促進(jìn)骨骼肌的再生。表明殼聚糖來源的可注射自愈合導(dǎo)電水凝膠擁有成為細(xì)胞遞送載體治療骨骼肌損傷的潛力，而賦予水凝膠導(dǎo)電性也許是改善材料肌肉再生能力的潛在方向。

3.2 合成水凝膠

合成水凝膠在骨骼肌再生研究中也有少量報(bào)道，也可作為細(xì)胞遞送的載體應(yīng)用于骨骼肌再生，但受合成材料生物相容性和生物活性的限制，若僅使用合成水凝膠修復(fù)骨骼肌缺損，效果可能不太理想，若能對其改性， 有望克服單一材料的缺陷， 改善材料性能。Han 等[45]利用聚乙二醇合成一種黏接性水凝膠，利用水凝膠將具有促肌肉生長修復(fù)的WNT7a 和原代肌衛(wèi)星細(xì)胞輸送到冷凍損傷的脛骨前肌，顯著促進(jìn)了衛(wèi)星細(xì)胞的增殖遷移和肌纖維的肥大。Ziemkiewicz 等[46]制備層粘連蛋白-111 功能化的聚乙二醇并將其混入聚乙二醇二丙烯酸酯（PEG-diacrylate，PEGDA）水凝膠中，水凝膠也利于成肌細(xì)胞存活、黏附。

3.3 雜化水凝膠

為進(jìn)一步優(yōu)化水凝膠的各種特性，模仿細(xì)胞外基質(zhì)，改善細(xì)胞黏附和組織反應(yīng)，將天然和合成聚合物結(jié)合可制備雜化水凝膠（hybrid hydrogel），雜化水凝膠可同時(shí)擁有天然及合成材料的優(yōu)勢，在骨骼肌再生方面具有較大潛力。Carleton 等[47]制備了甲基丙烯酸-聚乙二醇水凝膠和甲基丙烯酸-膠原水凝膠， 并探究兩種材料在VML 損傷中的再生效應(yīng)， 將水凝膠植入CD1 小鼠脛骨前肌VML 損傷模型后， 發(fā)現(xiàn)甲基丙烯酸-膠原水凝膠能夠恢復(fù)肌肉質(zhì)量和功能， 同時(shí)提高血管化和神經(jīng)支配。另外，Raj 等[48]將膽囊細(xì)胞外基質(zhì)與聚乙二醇二丙烯酸酯結(jié)合，制備出具有更高機(jī)械強(qiáng)度的生物合成水凝膠并希望用于高張力部位的肌肉再生，但該研究僅停留在材料和細(xì)胞學(xué)層面，缺乏動物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

4 小結(jié)與展望

VML 會嚴(yán)重?fù)p害機(jī)體的自我修復(fù)能力， 而臨床常規(guī)治療手段難以實(shí)現(xiàn)肌肉功能完全恢復(fù)的同時(shí)還存在一定局限性。 伴隨著骨骼肌再生相關(guān)研究的進(jìn)行， 水凝膠材料在骨骼肌組織再生方面取得諸多進(jìn)展。目前已經(jīng)利用多種天然及合成水凝膠材料結(jié)合細(xì)胞、生長因子等應(yīng)用于骨骼肌組織的再生修復(fù)，表現(xiàn)出增加肌纖維再生、提高血管化、改善肌力等效果，但這些研究都有一定的局限性，目前仍然沒有合適材料實(shí)現(xiàn)骨骼肌缺損的完全修復(fù)。為提高水凝膠材料運(yùn)載細(xì)胞的存活、增殖、分化能力，實(shí)現(xiàn)各種生長因子合理有效釋放，以及動員機(jī)體發(fā)揮自身的修復(fù)能力，仍需要探索更加合適有效的材料和治療方案。