精準(zhǔn)基因編輯技術(shù)的研究進(jìn)展

張赟，徐澍

(江蘇省腫瘤發(fā)生與干預(yù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210009)

0 引言

自2012年起，CRISPR/Cas9基因組編輯系統(tǒng)被首次發(fā)現(xiàn)之后，國(guó)內(nèi)外的研究者一直致力于對(duì)CRISPR/Cas9的優(yōu)化升級(jí)，分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域發(fā)生了革命性的變化。通過(guò)不斷的探索實(shí)踐，想要獲得一種更精準(zhǔn)、更方便和更經(jīng)濟(jì)的基因組編輯工

具[1,2]。

CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的工作基礎(chǔ)原理是，Cas9蛋白在向?qū)NA的引導(dǎo)下對(duì)靶DNA進(jìn)行雙鏈斷裂[3]，接著通過(guò)細(xì)胞內(nèi)自發(fā)的同源重組修復(fù)機(jī)制(HDR)或非同源重組修復(fù)機(jī)制(NHDR)進(jìn)行修復(fù)，從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)靶點(diǎn)基因序列的插入或刪除(indels)[4]。但是，CRISPR/Cas9依賴的HDR及NHDR僅限在細(xì)胞中存在，限制了其作用范圍；并且這種修復(fù)對(duì)靶基因引入隨機(jī)的插入和缺失(indels)[5]不受控制，帶有不確定性，而大約67%的人類遺傳疾病及動(dòng)植物性狀區(qū)分遺傳片段都是由單核苷酸變異(SNP)引起的[6]，于是精準(zhǔn)的單堿基校正技術(shù)便在這些迫切需求下誕生了[7,8]。

相較于CRISPR/Cas9的非精準(zhǔn)編輯[9]，單堿基編輯技術(shù)BE和先導(dǎo)編輯器PE的作用更精準(zhǔn)[10]。BE可在不產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂，也沒有供體DNA提供的情況下，即可實(shí)現(xiàn)單個(gè)堿基的替換，相較于CRISPR/Cas9不僅減少了一些副作用而且簡(jiǎn)化了整個(gè)編輯過(guò)程[11]。PE是CRISPR基因組編輯工程的最新成員，在CRISPR/Cas9系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，通過(guò)對(duì)小分子sgRNA以及蛋白酶的改造，可在細(xì)胞水平實(shí)現(xiàn)任意編輯[12]。BE和PE作為新型治療工具，在糾正人類基因組致病突變方面具有顯著的潛力，大約超過(guò)25%的人類致病位點(diǎn)能被糾正。下面將對(duì)這幾種精準(zhǔn)編輯系統(tǒng)進(jìn)行介紹。

1 單堿基編輯技術(shù)

1.1 胞嘧啶堿基編輯器

胞嘧啶堿基編輯器(CBE)主要是由sgRNA、dCas9(Cas9蛋白發(fā)生突變而失去了切割DNA的功能)或nCas9(D10A)(Cas9蛋白發(fā)生突變后只能切割單鏈DNA)、尿嘧啶糖基化酶抑制子以及胞嘧啶脫氨酶構(gòu)成[13]。其工作原理是，sgRNA先通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則與靶點(diǎn)結(jié)合，然后引使復(fù)合蛋白結(jié)合到達(dá)靶位點(diǎn)。在復(fù)合蛋白中的胞嘧啶脫氨酶的脫氨基作用下，非互補(bǔ)鏈中相應(yīng)的C被作用后改為U，而互補(bǔ)鏈中與編輯鏈上C互補(bǔ)的鳥嘌呤G由于堿基互補(bǔ)配對(duì)改成與U互補(bǔ)的腺嘌呤A，在尿嘧啶糖基化酶抑制子的作用下，減少了尿嘧啶U的切除事件的發(fā)生，最后便實(shí)現(xiàn)了非互補(bǔ)鏈上的C被替換成T，以及互補(bǔ)鏈上的G被替換成A的精準(zhǔn)編輯[14]。

2016年，哈佛大學(xué)博德研究所的劉如謙團(tuán)隊(duì)建立了三種rAPOBEC1堿基編輯器(大鼠胞嘧啶脫氨酶組成了復(fù)合蛋白)[10]。rAPOBEC1與dCas9組成了第一代堿基編輯器CBE1，在體外試管水平實(shí)現(xiàn)了C與T之間的替換編輯，盡管CBE1在引導(dǎo)高效的靶向堿基編輯在體外編輯效率高達(dá)37%，但它在哺乳動(dòng)物細(xì)胞體內(nèi)的編輯效率卻很低，作者認(rèn)為這種效率的降低很大程度上歸因于細(xì)胞通過(guò)堿基切除修復(fù)(BER)途徑修復(fù)DNA時(shí)產(chǎn)生的U-G中間體。U-G中間體由尿嘧啶DNA糖基化酶(uracil N-glycosylate，UNG)啟動(dòng)的，UNG識(shí)別U-G失配，切斷尿嘧啶和DNA脫氧核糖主鏈之間的糖苷鍵，導(dǎo)致堿基編輯器產(chǎn)生的U-G中間體逆轉(zhuǎn)回C-G堿基對(duì)而導(dǎo)致編輯產(chǎn)物毫無(wú)變化。

針對(duì)CBE1堿基編輯器的低編輯效率和局限性，劉如謙團(tuán)隊(duì)想要通過(guò)抑制尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG)來(lái)提高編輯效率，于是在CBE1的基礎(chǔ)上，將尿嘧啶DNA糖基化酶抑制劑(UGI)融合到CBE1的C端，來(lái)抑制UNG的活性，開發(fā)了第二代胞嘧啶堿基編輯器(CBE2)[11]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在人類細(xì)胞中編輯效率相較于CBE1提高了三倍。之后該團(tuán)隊(duì)又在CBE2的基礎(chǔ)上把毫無(wú)切割活性的dCas9替換成了nCas9(D10A)形成CBE3，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞體內(nèi)自發(fā)的錯(cuò)配修復(fù)機(jī)制作用下，對(duì)靶點(diǎn)處進(jìn)行修復(fù)編輯，進(jìn)而便可提高堿基編輯效率，這一次對(duì)CBE的升級(jí)也使CBE3的編輯效率比CBE2提高了6倍[11]。

1.2 腺嘌呤堿基編輯器

腺嘌呤堿基編輯器(ABE)是由Cas9蛋白與腺嘌呤脫氨酶構(gòu)成，在sgRNA的介導(dǎo)下靶向靶點(diǎn)后，通過(guò)腺嘌呤脫氨酶的脫氨基作用把A變成肌苷I，而肌苷在DNA水平會(huì)被當(dāng)做G進(jìn)行識(shí)別和復(fù)制，于是達(dá)到了將A替換成G的目的[8]。

目前存在的腺嘌呤脫氨酶在行使脫氨基作用時(shí)不能把DNA作為底物，劉如謙團(tuán)隊(duì)通過(guò)對(duì)大腸桿菌來(lái)源的tRNA腺苷脫氨酶TadA和人類來(lái)源的腺苷脫氨酶ADAT等多種腺嘌呤脫氨酶與nCas9融合后均未發(fā)現(xiàn)編輯活性，于是劉如謙就對(duì)腺嘌呤脫氨酶進(jìn)行替換改變，把隨機(jī)突變TadA序列的大腸桿菌的TadA與nCas9融合，構(gòu)建了一個(gè)突變蛋白文庫(kù)，先通過(guò)對(duì)氯霉素，卡那霉素，大觀霉素的抗性恢復(fù)的篩選，最后得到了能作用于DNA的ABE單堿基編輯系統(tǒng)，后來(lái)經(jīng)過(guò)不斷的改進(jìn)，由劉如謙開發(fā)的第7代腺嘌呤堿基編輯器通過(guò)實(shí)驗(yàn)顯示在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的編輯效率約為50%，并且引入插入或缺失的頻率低于0.1%[8]。此外，最近的研究報(bào)告了用于人類細(xì)胞編輯的雙堿基編輯器系統(tǒng)，這些新的堿基編輯器擴(kuò)大了DNA堿基編輯器的范圍，使其能夠進(jìn)行轉(zhuǎn)位突變，并且可能比目前單一的DNA堿基編輯器能夠?qū)崿F(xiàn)更復(fù)雜的復(fù)合編輯[15]。

1.3 單堿基編輯器的應(yīng)用

研究人員先在植物中進(jìn)行單堿基編輯實(shí)驗(yàn)。高彩霞的研究團(tuán)隊(duì)[12]學(xué)習(xí)應(yīng)用了單堿基編輯技術(shù)，在小麥，玉米和水稻中進(jìn)行育種編輯，即構(gòu)成了植物單堿基編輯系統(tǒng)(nCas9-PBE)，通過(guò)實(shí)驗(yàn)也證明了能在植物基因組中進(jìn)行高效準(zhǔn)確的單堿基編輯，編輯效率最高可達(dá)43.48%。

接著開始考慮將單堿基編輯器應(yīng)用到哺乳動(dòng)物體內(nèi)。根據(jù)統(tǒng)計(jì)，大概有75000個(gè)人類基因組位點(diǎn)和遺傳疾病有關(guān)。而真正有確切臨床治療手段的遺傳疾病還不足6%。目前，單堿基水平突變導(dǎo)致的基因疾病占了大多數(shù)。對(duì)哺乳動(dòng)物來(lái)說(shuō)，由于單堿基編輯器具有將胞嘧啶(C)轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶(T)的能力，所以可以使其成為一種治療方法，通過(guò)針對(duì)性地糾正單個(gè)堿基的突變來(lái)應(yīng)用在各種基因疾病模型中。比如β地中海貧血和鐮狀細(xì)胞病，前者是因?yàn)棣?珠蛋白基因的第7個(gè)密碼子發(fā)生了點(diǎn)突變。而后者是因?yàn)橹榈鞍谆?hemoglobinbeta, HBB)變異而發(fā)病，主要原因是HBB基因上發(fā)生了A-G的突變。而它們導(dǎo)致血液疾病的發(fā)生均是由于血紅蛋白的β基因的缺陷。中山大學(xué)的黃軍就教授研究團(tuán)隊(duì)[16]通過(guò)對(duì)不能發(fā)育成熟的人三原核胚胎細(xì)胞和患者早期皮膚細(xì)胞使用了CBE3編輯系統(tǒng)，對(duì)其基因組進(jìn)行單堿基修復(fù)編輯，效率分別為40.9%和20%。為傳統(tǒng)療法無(wú)法治療的遺傳疾病提供了希望。由于APOE4基因的突變會(huì)誘發(fā)遲發(fā)型阿爾茲海默疾病，劉如謙研究團(tuán)隊(duì)利用BE系統(tǒng)在鼠星型膠質(zhì)細(xì)胞糾正了APOE4的突變，編輯效率高達(dá)70.4%[14]。另外，Chadwick團(tuán)隊(duì)的研究人員首先在小鼠身上建立了人高脂血疾病模型，由于PCSK9基因突變的人不易得高脂血癥，通過(guò)CBE3對(duì)PCSK9基因進(jìn)行突變，便可達(dá)到降低血漿膽固醇的水平的目的[17]。通過(guò)上述例子，也說(shuō)明單堿基編輯技術(shù)有望成為人類基因組疾病治療的手段。

2 Prime Editing

現(xiàn)有的另外一種精準(zhǔn)編輯工具，是由劉如謙實(shí)驗(yàn)室開發(fā)的可對(duì)靶位點(diǎn)任意編輯的新工具Prime Editor(PE)[18]。PE是以CRISPR/Cas9系統(tǒng)為基礎(chǔ)，首先在sgRNA的3’端增加一段RNA序列成為pegRNA(pegRNA上攜帶著引物結(jié)合位點(diǎn)和逆轉(zhuǎn)錄的模板序列)，然后將逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV和Cas9切口酶(H840A突變型，只切斷以含PAM的靶點(diǎn)DNA鏈)融合，通過(guò)Cas9切口酶的作用切開單鏈，pegRNA末端的模板序列可以作為DNA修復(fù)的模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下按照既定的模板編輯靶點(diǎn)DNA。依據(jù)PE的工作原理，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)A-T，A-G，A-C，T-G，T-C，G-C等共12種單堿基間的自由相互轉(zhuǎn)換，還能實(shí)現(xiàn)多堿基的精準(zhǔn)插入和刪除，適當(dāng)彌補(bǔ)了BE系統(tǒng)的不足。

劉如謙團(tuán)隊(duì)通過(guò)對(duì)逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行點(diǎn)突變，進(jìn)化后得到了第二代PE2(D200N + L603W + T330P + T306K + W313F)[18]。與PE1相比，PE2的點(diǎn)突變效率和堿基的插入刪除效率提高了近2倍。但作者認(rèn)為編輯效率還不夠高，假設(shè)如果能對(duì)兩條鏈都進(jìn)行修正的話，那么效率將會(huì)大大提高。于是便設(shè)計(jì)了一條靶向另一條鏈的sgRNA，構(gòu)建了PE3，可以實(shí)現(xiàn)切割非互補(bǔ)鏈的目的來(lái)提高編輯效率。在293T細(xì)胞中也證明了PE3系統(tǒng)的編輯效率可以達(dá)到78%。但由于產(chǎn)生了雙鏈斷裂，Indels的風(fēng)險(xiǎn)也大大增加，作者進(jìn)一步在PE3的基礎(chǔ)上改進(jìn)，構(gòu)建了PE3b，設(shè)計(jì)了一條靶向pegRNA編輯產(chǎn)物的sgRNA，融合蛋白便可以先后單鏈切割靶基因來(lái)進(jìn)行雙鏈編輯，在不產(chǎn)生雙鏈斷裂的基礎(chǔ)上也大大提高了編輯效率[18]。

目前科學(xué)家們已經(jīng)在動(dòng)物上成功應(yīng)用了精準(zhǔn)編輯技術(shù)，劉如謙實(shí)驗(yàn)室在患有遺傳性耳聾的小鼠中進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，通過(guò)將堿基編輯器注入小鼠的內(nèi)耳中后部分恢復(fù)了小鼠的聽力[19]。2021年底，劉如謙團(tuán)隊(duì)對(duì)PE進(jìn)行改進(jìn)成Twin prime editing(twinPE)，是通過(guò)兩個(gè)pegRNA在基因組的特定位置進(jìn)行切割，后引入更大的DNA序列。作者先對(duì)一種罕見的人類遺傳疾病亨廷頓綜合征進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，這種遺傳疾病的產(chǎn)生是由于長(zhǎng)度約4000 bp的DNA片段倒位導(dǎo)致的。他利用twinPE技術(shù)成功糾正了疾病序列錯(cuò)誤。解決了第一代PE的一個(gè)缺陷，即最多只能編輯幾十個(gè)堿基對(duì)[20]。但是PE的應(yīng)用仍處于起步階段，隨著技術(shù)的發(fā)展，PE技術(shù)有待作為一種新的遺傳疾病治療方式，能夠更安全，更有特異性地治療疾病。未來(lái)再更新的精準(zhǔn)編輯器應(yīng)該在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中提供更高的效率和低indel形成[21]。無(wú)論如何，PE系統(tǒng)是精準(zhǔn)基因編輯通用方法發(fā)展過(guò)程中一個(gè)巨大的里程碑，在糾正已知致病突變的臨床疾病方面已經(jīng)展現(xiàn)出來(lái)無(wú)限的潛力。

3 結(jié)語(yǔ)

短短的9年時(shí)間里，基因組編輯技術(shù)取得了飛躍進(jìn)展，由最先的對(duì)目標(biāo)基因隨機(jī)打靶到現(xiàn)在可以實(shí)現(xiàn)對(duì)基因任意堿基的精準(zhǔn)替換編輯，技術(shù)上已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了很多重大突破。但是在編輯效率和脫靶等問(wèn)題上，仍然有發(fā)展空間。并且精準(zhǔn)編輯技術(shù)對(duì)于動(dòng)植物基因功能研究[22]、基因治療[23]和分子育種[24-25]等許多方面都有著重要的研究應(yīng)用價(jià)值，所以我們迫切需要大力發(fā)展這項(xiàng)技術(shù)。但同時(shí)也有很多問(wèn)題不可忽略。

首先，如何有效地遞送堿基編輯器是一個(gè)有待解決的難題，開發(fā)一種安全高效的傳遞系統(tǒng)對(duì)于精準(zhǔn)編輯技術(shù)在臨床中的成功應(yīng)用至關(guān)重要。藥物一般都是由小分子化合物制成不同劑型，可以通過(guò)口服，注射，透皮等方式進(jìn)行遞送。但基因編輯器是一個(gè)復(fù)雜的復(fù)合大分子，基因編輯器在體內(nèi)如何被有效地遞送到相關(guān)的組織器官的部分靶位點(diǎn)，對(duì)于它們的藥效發(fā)揮至關(guān)重要。目前通過(guò)利用自然界的病毒裝載堿基編輯器來(lái)遞送至人體是已經(jīng)成功實(shí)踐了的、非常有前景的遞送手段。來(lái)自馬賽諸塞大學(xué)的研究者Guangping Gao開發(fā)出了一種依賴于病毒外殼遞送的新方法[26]，其編輯效率更高，而脫靶效應(yīng)更低。通過(guò)將基因編輯器裝入腺相關(guān)病毒等病毒中，然后可以感染人體內(nèi)的細(xì)胞并釋放基因編輯器，得以成功遞送。但是病毒載體對(duì)傳輸物質(zhì)大小有限制，由于AAV的血清型都已普遍研究，且具有有限的免疫原性，AAV已成為基因組編輯器傳遞的普遍使用方式。如果將Cas9與胞嘧啶脫氨酶、UGI、sgRNA裝載入AAV載體進(jìn)而遞送BE系統(tǒng)，它們的組成序列很長(zhǎng)，高達(dá)4.7kb，AAV載體無(wú)法對(duì)BE系統(tǒng)進(jìn)行完全包裝[26]。此外，研究發(fā)現(xiàn)，如果在基因編輯傳送系統(tǒng)中使用脂質(zhì)納米顆粒也許會(huì)展現(xiàn)出意想不到的結(jié)果[27]。一些研究者使用脂質(zhì)納米顆粒，在電場(chǎng)作用下將基因編輯器帶到細(xì)胞中，來(lái)達(dá)到遞送目的[28]。盡管已有很多種遞送方式，但免疫原性仍是不可忽略的問(wèn)題，也是大多數(shù)遞送方式需要改進(jìn)的一點(diǎn)。

然后，我們通過(guò)利用基因編輯技術(shù)，為遺傳性疾病、腫瘤等多種疾病解決了很多難題。但是社會(huì)各界對(duì)于直接在人類胚胎細(xì)胞中進(jìn)行編輯方面仍然存在爭(zhēng)議。首先，對(duì)早期胚胎細(xì)胞時(shí)期發(fā)生基因突變進(jìn)行編輯，可治療一些傳統(tǒng)治療方法無(wú)法根本治療的疾病。其次，基因編輯技術(shù)無(wú)法避免的一個(gè)缺陷，就是可能會(huì)有控制不了的脫靶，或者錯(cuò)誤編輯時(shí)間的發(fā)生，從而導(dǎo)致嚴(yán)重的后遺效應(yīng)，這些將嚴(yán)重影響到人類的生活生存。然而目前很多國(guó)家對(duì)基因編輯治療的監(jiān)管措施立法上仍然有很多不足，如何合理地對(duì)待及管理基因編輯技術(shù)仍舊是一大難題。

總而言之，精準(zhǔn)編輯技術(shù)已經(jīng)在人類疾病治療等領(lǐng)域中表現(xiàn)出了巨大的潛力，隨著生物技術(shù)時(shí)代的發(fā)展，越來(lái)越多的蛋白及其功能將被發(fā)現(xiàn)，通過(guò)更多學(xué)科的知識(shí)融合，新一代的精準(zhǔn)編輯技術(shù)將會(huì)更加簡(jiǎn)單高效。隨著人們對(duì)疾病深度認(rèn)識(shí)，特別是對(duì)那些傳統(tǒng)療法難以治愈的遺傳疾病，精準(zhǔn)編輯技術(shù)的臨床疾病應(yīng)用研究將有非常大的發(fā)展空間，而它的進(jìn)步也勢(shì)必會(huì)極大推動(dòng)全世界生命科學(xué)，生物醫(yī)藥領(lǐng)域的發(fā)展。