免疫原性細胞死亡在腫瘤中的研究進展

王佩文，張小博

(江蘇省南京市鼓樓區(qū)童家巷24號中國藥科大學玄武門校區(qū)，江蘇省腫瘤發(fā)生與干預重點實驗室，江蘇 南京 210009)

0 引言

免疫原性細胞死亡是一種調(diào)節(jié)性細胞死亡，能夠激活適應性免疫應答。目前已經(jīng)有多種藥物和療法被研究證明可以誘導免疫原性細胞死亡的發(fā)生，包括化療藥物，溶瘤病毒，光動力療法等[1]。垂死或者應激狀態(tài)下的細胞會釋放某些分子，這些分子會作為免疫系統(tǒng)可識別的危險信號，這都被統(tǒng)稱為損傷相關分子模式(Damage-associated Molecular Patterns，DAMPs)。當這些信號分子被先天模式識別受體所識別，則會激活Toll樣受體和NOD樣受體信號通路，有利于抗原提呈細胞的募集、活化、歸巢、抗原攝取和成熟，從而激活下游腫瘤相關特異性免疫應答[2]。本文中主要討論了免疫原性細胞死亡發(fā)生的相關概念、分子機制以及上下游相關的信號通路，主要強調(diào)了其在抗腫瘤免疫治療中的應用意義。

1 免疫原性細胞死亡(ICD)發(fā)生機制

免疫原性細胞死亡(Immunogenic Cell Death，ICD)是藥物在誘導腫瘤細胞凋亡的同時，通過質(zhì)膜成分的變化，釋放可以被抗原提呈細胞識別的損傷相關分子信號，從而激活T細胞介導的適應性免疫反應，ICD的發(fā)生的機制主要在于鈣網(wǎng)蛋白(Calreticulin，CRT)的暴露、胞外三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate，ATP)的分泌以及高遷移率族蛋白B1(High-mobility group protein box 1，HMGB1)釋放的增加[3]。

CRT通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(Endoplasmic reticulum stress，ERS)活化而暴露于細胞表面，這一般是由ICD誘導劑引發(fā)的，同時還會伴隨著活性氧的產(chǎn)生以及ER應激反應，且其跨膜轉(zhuǎn)位數(shù)量的變化與ICD呈正相關，當其被激活時會發(fā)生一系列變化，而這些微變化會率先由免疫細胞感知，例如樹突狀細胞感知到免疫原性的信號時，會吞噬應激和垂死的細胞，并刺激腫瘤特異性CD8T細胞的產(chǎn)生[4]。另外，CRT通過其表面表達的CD91作用于靶樹突狀細胞，以促進促炎細胞因子的釋放并調(diào)節(jié)免疫抑制性Th17細胞的活性，CRT與CD91的結(jié)合有助于募集抗原提呈細胞，促進腫瘤特異性免疫應答[42]。

當腫瘤細胞發(fā)生ICD時，ATP會從胞內(nèi)釋放到胞外，充當垂死細胞釋放的信號，這是抗腫瘤免疫反應所必須的，因此，ATP的消耗消除了細胞死亡的免疫原性[3]。而ATP的釋放需要多種信號轉(zhuǎn)導途徑的激活[5]，其也依賴于細胞自噬，若自噬被干擾，則不能釋放足夠的ATP，從而無法引起腫瘤細胞外的免疫應答[6]。細胞死亡后，ATP 釋放可繼發(fā)于 caspase-3 或 caspase-7 介導的活性?；熀?，釋放的 ATP 被樹突狀細胞上的嘌呤能 P2RX7 受體感知并誘導它們的募集。ATP 還通過激活 NLRP3 炎性體和隨后分泌 IL-1β 來介導免疫刺激作用。這一步對于樹突狀細胞介導的細胞死亡免疫原性是必需的[36]。

HMGB1蛋白是高遷移率族蛋白超家族成員之一，在ICD晚期HMGB1釋放到胞外[7]，有研究表明，HMGB1能夠促使DC與腫瘤細胞表面的TLR4結(jié)合，并且其也可以與TLR4相互作用，這對于DC吞噬垂死的腫瘤細胞或DC的激活都是關鍵因素，這才便于激活特異性免疫應答[8]。另外還有研究表明，HMGB1與ATP協(xié)同誘導DCs釋放IL-1β，并且針對HMGB1的抗體消除了DCs與垂死細胞相互聯(lián)系時產(chǎn)生的IL-1β的能力[37]。而且還有很多研究證實HMGB1的免疫原性取決于其氧化還原狀態(tài)，與非活化形式相比，HMGB1還原形式的有效促炎活性也證明了這一點[38]。有一項研究還證實，HMGB1與腫瘤浸潤性DCs相互作用，抑制已確定腫瘤的小鼠的核酸介導的抗腫瘤活性[39]。

2 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(ERS)與ICD

未折疊蛋白反應(unfolded protein response，UPR)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應的一部分，ERS可以通過誘導蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(protein kinase R—like ER kinase，PERK)誘導該途徑的激活，UPR是細胞響應ERS的自我保護的重要途徑。UPR主要涉及的是三條通路：PERK-eIF2A信號通路、IRE1-XBP1信號通路和ATF6信號通路，在應激狀態(tài)下，PERK、IRE1和ATF6三種蛋白便會與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶GRP78蛋白分離而激活相應的通路，減輕未折疊蛋白或錯誤折疊的蛋白累積對細胞穩(wěn)態(tài)平衡造成的損傷，恢復內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)[9]。IRE1屬于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)I型跨膜蛋白，有蛋白激酶領域和核糖核酸內(nèi)切酶活性，IRE1被激活，其會發(fā)生寡聚化和反式自磷酸化以激活其胞質(zhì)RNase結(jié)構(gòu)域，從而剪切XBP1的mRNA，產(chǎn)生成熟的剪切形式的XBP1[10]。ATF6 是一種 II 型跨膜蛋白，是bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族的成員。ERS發(fā)生則ATF6會從GRP78釋放，從而轉(zhuǎn)移到高爾基體，經(jīng)過切割釋放出有活性的ATF6α片段，進入到細胞核內(nèi)參與UPR基因的轉(zhuǎn)錄，誘導啟動ER相關降解和細胞凋亡[11]。PERK是調(diào)節(jié)ERS的關鍵跨膜蛋白，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)腔積聚未折疊蛋白后，PERK二聚和反式自磷酸化導致eIF2A激酶激活[12,13]。在PERK介導的eIF2A的磷酸化過程中，激活轉(zhuǎn)錄因子4(ATF4)可被激活[14,15]。大部分情況下，PERK信號通路是通過eIF2A磷酸化介導的，但也有研究表明，NRF2也可能是PERK激酶活性的底物，NRF2通過與微管相關蛋白Keap1結(jié)合分布在細胞質(zhì)中，ERS發(fā)生時，PERK磷酸化NRF2導致其與Keap1分離，從而NRF2在核內(nèi)積累[16]。

UPR在許多癌癥中均會被激活，但在不同的腫瘤類型中，UPR的激活存在著差異，其過度激活時間過長和不足都不利于腫瘤的發(fā)展，IRE1-XBP1是三個UPR相關信號通路中最保守的[17]。研究發(fā)現(xiàn)，MYC通過與IRE1啟動子和增強子結(jié)合直接轉(zhuǎn)錄激活IRE1-XBP1通路，MYC與XBP1s相互作用并調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄活性，而XBP1s不影響MYC轉(zhuǎn)錄活性。綜合多個臨床前乳腺癌模型結(jié)果分析可知，用IRE1 RNase抑制劑對IRE1 / XBP1途徑進行抑制可防止MYC過度激活的腫瘤生長并使腫瘤對標準化療敏感[18]。還有研究顯示，IRE1-XBP1信號通路通過激活IL-6/STAT3信號傳導來促進黑色素瘤發(fā)展[19]，且有研究提到ERS可由IRE1-XBP1通路介導的PHLDA3過表達加速肝細胞損傷[20]。

3 ICD與抗腫瘤免疫

在腫瘤微環(huán)境中，免疫原性細胞死亡在刺激功能失調(diào)的抗腫瘤免疫系統(tǒng)中起主導作用。先天免疫系統(tǒng)在激活導致腫瘤特異性免疫反應的適應性免疫中起著至關重要的作用。首先，在沒有任何佐劑的情況下，腫瘤細胞發(fā)生ICD可以觸發(fā)抗腫瘤免疫，從而保護小鼠免受同類型腫瘤細胞的攻擊[40]。其次，體內(nèi)誘導的ICD可以刺激局部抗腫瘤免疫，其會將免疫效應細胞吸引到腫瘤微環(huán)境中，導致至少部分依賴免疫系統(tǒng)的腫瘤抑制[41]。

有研究顯示，GRP78介導的CD47調(diào)控可能是促進抗腫瘤巨噬細胞募集的分子驅(qū)動因子，通過ERS上調(diào)CD47的表達調(diào)控抗腫瘤免疫反應。CD47是一個在正常細胞和腫瘤細胞表面廣泛表達的蛋白，可以與巨噬細胞表面的SIRPα相互作用，調(diào)節(jié)多種骨髓細胞的活性，保護正常細胞不被巨噬細胞吞噬。SIRPα/ CD47相互作用也參與了巨噬細胞遷移的調(diào)控，但其具體機制仍未知[21]。研究表明，JQ1通過誘導ICD在舌鱗狀細胞癌(TSCC)中顯示出治療潛力，其可誘導eIF2A磷酸化，和鈣網(wǎng)蛋白、HMGB1和ATP釋放，JQ1預處理的垂死細胞可以保護小鼠免受腫瘤細胞的再次攻擊，有效抑制了腫瘤的增殖并增加了CD3+/CD8+T細胞的腫瘤浸潤[22]。研究發(fā)現(xiàn)，EPHB4受體表達下調(diào)會抑制SRC / MAPK / MYC通路，降低葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白GLUT3的表達，導致葡萄糖攝取受損和細胞ATP水平降低，并與ERS激活和腫瘤細胞發(fā)生ICD有關[23]。RIG-I類解旋酶(RLH)是用于病毒RNA誘導I型干擾素產(chǎn)生的胞質(zhì)傳感器，可識別病毒RNA種類，可被合成RNA激活，啟動由IRF，MAPK和NF-κB介導的信號級聯(lián)反應，導致I型IFN和免疫應答基因的產(chǎn)生。研究人員在胰腺癌小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，RLH配體進行治療可誘導有效的抗腫瘤免疫活性，并證實了RLH的激活與免疫原性腫瘤細胞死亡有關[24]。

Hemidesmus indicus是近年來被發(fā)現(xiàn)的一種有前途的抗癌植物藥，研究人員發(fā)現(xiàn)其具有刺激人結(jié)腸癌細胞系產(chǎn)生ICD的能力，其表現(xiàn)為CRT的暴露、HSP70表達的增加以及ATP和HMGB1的釋放，本研究中發(fā)現(xiàn)在亞毒性濃度下，其可以誘導DC輕度激活，在癌癥免疫治療方面存在潛力[25]。人參皂苷Rg3是具有抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)活性的人參皂苷，有研究驗證了其在基于DC誘導免疫原性腫瘤細胞死亡中的重要性，Rg3通過誘導凋亡使鈣網(wǎng)蛋白和熱休克蛋白在內(nèi)的免疫原性死亡標志物的表達和相關基因的轉(zhuǎn)錄增加，CRT的表達與DC對垂死腫瘤細胞的攝取成正相關[26]。

近年有項研究將ROCK抑制劑與ICD誘導劑相結(jié)合使用，ROCK抑制劑可以增強吞噬細胞清除癌細胞的能力并有助于增加DC介導的T細胞啟動，誘導抗腫瘤免疫力，從而抑制腫瘤生長。將ROCK抑制劑與免疫原性化學療法相結(jié)合可導致DC成熟度提高、CD8 +細胞毒性T細胞協(xié)同增效以及腫瘤浸潤，這種治療策略可有效抑制腫瘤生長并提高總體生存率[27]。PD-1檢查點抑制劑的一個突破點就是在于缺氧腫瘤微環(huán)境中很少有腫瘤特異性T細胞免疫浸潤，大多數(shù)腫瘤對此療法還具有耐藥性，而在與ICD誘導劑聯(lián)合使用后，則可以改善T細胞對不同腫瘤的反應，使腫瘤對免疫檢查點抑制劑敏感[46]。在用PD1單抗和Dinaciclib聯(lián)合治療后，Dinaciclib處理的細胞表現(xiàn)出明顯的ICD特征，聯(lián)合治療的小鼠腫瘤的T細胞浸潤和DC活化明顯增加，表明這種聯(lián)合療法確實可以提高PD-1單抗免疫療法的作用[47]。

癌癥免疫療法的宗旨就是激活自身免疫系統(tǒng)從而起到特異性抗腫瘤作用，目前越來越多的研究證實ICD在抗腫瘤免疫上的治療潛力，從某些程度上我們或許可以發(fā)現(xiàn)更多的ICD誘導劑或是將非ICD誘導劑轉(zhuǎn)化為有效的ICD誘導劑，開發(fā)出它們在腫瘤中更多的效用。

4 ICD誘導劑在腫瘤中的應用

許多研究發(fā)現(xiàn)，蒽環(huán)類藥物、奧沙利鉑等可以誘導腫瘤細胞免疫原性細胞死亡，他們的共同特征就是誘導ERS和ROS產(chǎn)生，而具有顯著抗癌活性的天然化合物誘導ICD的研究還較少[28]。蒽環(huán)類藥物通過釋放ATP誘導骨髓細胞的腫瘤浸潤，從而刺激具有炎性特征的樹突狀細胞的局部分化，該類細胞可以提呈信號給T細胞，誘導抗腫瘤免疫反應。此外，蒽環(huán)類藥物治療死亡的腫瘤細胞釋放的ANXA1需要與樹突狀細胞上的FPR1相互作用，以引發(fā)T細胞介導的抗腫瘤免疫[49]。近年來也有植物來源的天然化合物被證明有作為ICD新型誘導劑的潛力，例如紫草素、強心苷等。紫草素可以有效激活受體和線粒體介導的細胞凋亡，并增加所得腫瘤細胞裂解物中DAMPs的表達，從而導致免疫原性細胞死亡的發(fā)生，在聯(lián)合LPS的額外刺激可將DC激活至完全成熟，增強腫瘤特異性免疫應答[29]。強心苷能夠有效誘導ICD并以此將死亡的癌細胞轉(zhuǎn)化為刺激抗腫瘤反應的疫苗，這種作用與抑制細胞膜中的鈉鉀依賴性三磷酸腺苷酶有關[30]。紫杉醇誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，在體外可以誘導小鼠卵巢癌細胞CRT暴露，ATP釋放，HMGB1釋放，CXCL10上調(diào)和ANXA1暴露，觸發(fā)蛋白激酶R樣ER激酶激活和真核翻譯起始因子2α磷酸化，其可以依賴于TLR4通過ICD激活抗腫瘤免疫，并在原發(fā)性卵巢腫瘤中誘導T細胞浸潤[48]。

有研究證明，漢黃芩素(Wogonin)能夠通過ROS介導的ERS，激活PI3K/AKT通路誘導CRT/ Annexin A1細胞膜移位和HMGB1的釋放[31]。還有研究證實，在異種移植腫瘤模型中，漢黃芩素抑制腫瘤生長并促進DC成熟、募集免疫細胞到腫瘤組織中，并且其直接抑制腫瘤細胞中STAT3的激活，STAT3的去磷酸化有助于降低B7H1和MHC I類鏈相關蛋白A的表達，并增強細胞膜上CRT的表達[32]。溶瘤新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)會觸發(fā)ICD并引發(fā)抗腫瘤免疫力，研究發(fā)現(xiàn)NDV感染的肺癌細胞表面CRT表達增加和HMGB1和HSP70 / 90的釋放，且肺癌細胞中自噬相關基因的消耗顯著抑制了NDV誘導的ICD作用，研究證明了NDV是強效的ICD誘導劑，這也說明了自噬是NDV誘導肺癌細胞發(fā)生ICD的重要原因[33]。與之相關還有研究顯示，STAT3有助于NDV誘導的黑色素瘤細胞ICD發(fā)生，同時也證明了細胞凋亡、自噬、壞死和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激都對NDV誘導的黑色素瘤細胞ICD有促進作用[34]。阿霉素也是一種ICD誘導劑，現(xiàn)被廣泛用于NP制劑，目前已有研究提出將阿霉素加載到高度整合的介孔二氧化硅NPs中，開發(fā)了一種pH和GSH雙重敏感的遞送系統(tǒng)，用于全身治療高度轉(zhuǎn)移性三陰性乳腺癌，從而誘導樹突狀細胞的成熟和抗腫瘤細胞因子的釋放[45]。

此外，金絲桃素的光動力療法已被證實可以誘導phox-ER應激，從而導致ecto-CRT的表達、ATP的主動分泌和熱休克蛋白的被動釋放，例如HSP70、HSP90，在晚期細胞凋亡中，可以通過在非免疫小鼠中誘導ICD來抑制腫瘤生長[35]。而且除了誘導ICD直接殺死腫瘤細胞，還能產(chǎn)生類似疫苗的方法用于刺激“冷”腫瘤微環(huán)境向免疫原性“熱”腫瘤微環(huán)境轉(zhuǎn)變，比如剛提到的光動力療法，以及放射療法和光熱療法等，這都可以有助于引發(fā)更廣譜的抗原特異性免疫反應，增強免疫刺激反應，更好的起到抑制腫瘤細胞增殖和腫瘤浸潤的免疫抑制作用[43]，目前ICD療法還與新興的納米粒子結(jié)合起來，可以實時監(jiān)測定位和治療效果，并作為佐劑或免疫增強劑[44]。因此近年來，越來越多人開始投入研究ICD誘導劑，而且從各種研究證據(jù)來看，ICD誘導劑聯(lián)合治療具有更深遠的臨床和治療意義。

5 小結(jié)與展望

綜上所述，免疫原性細胞死亡為提高癌癥治療提供了更多的機會和可能性，但目前很多ICD還是在小鼠模型上進行的驗證，臨床模型上的證據(jù)還不是那么充足，因此還是需要進一步的研究，以說明ICD誘導劑在臨床中的實用性。未來在應用抗癌藥物治療的同時，可以考慮使用ICD誘導劑進行組合療法，克服臨床藥物治療中產(chǎn)生的耐藥性，使得患者能從新型療法中獲得益處。另外，也可以開發(fā)更多理想的ICD誘導劑，從而為改良腫瘤疫苗接種策略開辟了前景。