苦參堿聯(lián)合LY294002 對(duì)人髓系白血病K562 細(xì)胞增殖、凋亡和細(xì)胞周期的影響

郝艷梅，紀(jì)俊莉，劉純藝，張 楠，宮雅娟

蚌埠醫(yī)學(xué)院腫瘤基礎(chǔ)研究與臨床檢驗(yàn)診斷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 蚌埠 233030

急性髓系白血?。ˋML）是由于遺傳變異導(dǎo)致的發(fā)生于髓系干細(xì)胞前體的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，表現(xiàn)為原始或幼稚髓系細(xì)胞克隆性增生而正常造血受抑制［1］。AML治療有分子靶向治療、誘導(dǎo)分化治療、聯(lián)合化療、造血干細(xì)胞移植等多種治療方法，目前藥物治療仍是其治療主要手段，藥物不良反應(yīng)、耐藥性、微量殘留白血病等限制其臨床運(yùn)用，故探尋新的、安全的抗癌方案具有重要的臨床意義［2］。中醫(yī)藥是我國(guó)的寶貴財(cái)富，中藥苦參具有悠久的藥用歷史，苦參堿（Mat）作為苦參的主要有效成分之一，具有抗炎、抗病毒、抗肝纖維化及抗腫瘤等多種生物活性?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究指出，Mat能夠通過(guò)多元化抑制PI3K/Akt/mTOR［3］、Akt/GSK3β/β-catenin［4］、PTEN/Akt［5］等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的過(guò)度活化，多途徑下調(diào)Akt活化，發(fā)揮抗惡性腫瘤的作用［6］。Akt異常過(guò)表達(dá)或活化已在許多癌癥中被觀察到，與癌細(xì)胞增殖和生存增加相關(guān)，靶向Akt可能是癌癥預(yù)防和治療的重要途徑［7］。針對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路的分子靶向治療是研究的熱點(diǎn)［8］，LY294002是PI3K/Akt抑制劑，也能下調(diào)Akt活化，抑制信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路下游效應(yīng)［9］。LY294002與Mat聯(lián)合應(yīng)用是否有協(xié)同作用，是否能減少藥物用量，尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。

本研究以具有急、慢性髓細(xì)胞白血病細(xì)胞特征的K562細(xì)胞為研究對(duì)象，通過(guò)Mat與LY294002聯(lián)合作用，觀察兩者對(duì)K562細(xì)胞增殖、周期及凋亡的影響，進(jìn)一步探討其作用機(jī)制，以期為中西醫(yī)結(jié)合治療AML提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株及培養(yǎng) K562細(xì)胞株為蚌埠醫(yī)學(xué)院腫瘤基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室凍存株，用RPMI 1640完全培養(yǎng)基（含10%FBS）于37 ℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于后繼實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 小牛血清（Lonsera），RPMI 1640（Hyclone），苦參堿（成都瑞芬思生物科技有限公司），吖啶橙（Sigma），Wright染色液（Baso），CCK-8（Biomiky），Annexin Ⅴ-FITC/PI 試劑盒（凱基生物），青霉素-鏈霉素、RIPA裂解液、PMSF、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（碧云天），LY294002（APExBIO），β-actin、p-mTOR、p-PI3K、Akt、p-Akt、CyclinD1、Bcl-2、Caspase-9（ABclonal），HRP 標(biāo)記的羊抗兔IgG（Affinity Biosciences）。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 MultiSkan3酶標(biāo)儀（Thermo），倒置熒光顯微鏡（Olympus），普通光學(xué)顯微鏡（Olympus），流式細(xì)胞儀（BD），垂直電泳儀（Bio-Rad）。

1.2 方法

1.2.1 CCK-8比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞K562接種于96孔板，濃度設(shè)定為2×108/L，實(shí)驗(yàn)組中苦參堿濃度分別為0.2、0.4、0.8、1.6 g/L，聯(lián)合LY294002的濃度為10 μmol/L，對(duì)照組不加藥，空白孔不加藥和不加細(xì)胞，均設(shè)3 個(gè)平行孔，置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱孵育。在前期預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合使用藥物12h內(nèi)作用不顯著，超過(guò)48 h細(xì)胞增殖抑制率進(jìn)入平臺(tái)期，故設(shè)計(jì)分別孵育24 h和48 h，孵育后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h，用酶標(biāo)儀測(cè)量各孔在波長(zhǎng)450 nm 處的吸光度值（A值），實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞增殖抑制率（%）=[1（-A實(shí)驗(yàn)-A空白）（/A對(duì)照-A空白）]×100%。

1.2.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期狀態(tài)良好的K562 細(xì)胞接種于6 孔板，實(shí)驗(yàn)分組：對(duì)照組、苦參堿（0.4 g/L）組、LY294002（10 μmol/L）組和聯(lián)合組（終濃度為0.4 g/L 的苦參堿+10 μmol/L LY294002）處理K562 細(xì)胞，孵育48 h后，各取1 mL混勻的細(xì)胞懸液于24孔板中，靜置0.5 h后，用倒置顯微鏡觀察形態(tài)；各取1 mL混勻的細(xì)胞懸液，1500 r/min離心，5 min，棄上清，混勻細(xì)胞，涂片，自然干燥后，用Wright染色，觀察細(xì)胞形態(tài)變化；各取2 mL混勻的細(xì)胞懸液，用PBS緩沖液清洗2次，用1 μg/mL吖啶橙（AO）染色，避光染色15 min，PBS洗3次，應(yīng)用倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.2.3 Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染色法細(xì)胞凋亡檢測(cè) 細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組同上，孵育48 h后，4℃離心去上清液，用冷PBS洗2次，離心盡去上清，輕彈起細(xì)胞，使其盡量散開(kāi)，按照凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行AnnexinⅤ-FITC/PI 雙標(biāo)記染色，并設(shè)置空白對(duì)照組和單色對(duì)照組。1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀測(cè)定完畢，采用FlowJo7.6軟件分析細(xì)胞凋亡情況。

1.2.4 FCM測(cè)定細(xì)胞周期分布 細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組同上，收集細(xì)胞，預(yù)冷PBS洗滌1次，預(yù)冷70%乙醇固定細(xì)胞12 h，離心去上清，加入預(yù)冷PBS洗滌后轉(zhuǎn)入流式管，再離心去上清，彈起細(xì)胞，加入含有RNase A和PI的染色液0.5 mL，37 ℃避光溫浴30 min，隨后冰浴避光放置，于24 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，應(yīng)用FlowJo7.6 軟件分析細(xì)胞周期。

1.2.5 Western blot方法檢測(cè)目的蛋白的表達(dá) 細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組同上，分別收集各組的K562細(xì)胞至離心管中，預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞2次，轉(zhuǎn)入EP管中，離心后盡去上清，加入適量的細(xì)胞裂解混合液，冰浴后裂解細(xì)胞提取總蛋白，BCA蛋白試劑盒測(cè)定蛋白濃度。各組蛋白樣品上樣量為30 μg，CyclinD1、Bcl-2、Caspase-9分子量小進(jìn)行12% SDS-PAGE 分離膠電泳，p-mTOR、p-PI3K、Akt、p-Akt分子量較大進(jìn)行6%SDS-PAGE分離膠電泳。轉(zhuǎn)移至PⅤDF膜上，室溫封閉2 h后，β-actin一抗1∶100 000 稀釋?zhuān)渌豢?∶1000 稀釋?zhuān)? ℃孵育過(guò)夜；TBST洗膜3次；HRP標(biāo)記的二抗37 ℃孵育2 h；再TBST 洗膜3次；ECL顯影，F(xiàn)luorChem M凝膠成像系統(tǒng)曝光顯影。Image J 圖像分析軟件檢測(cè)條帶灰度值，以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算：蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的條帶灰度/內(nèi)參條帶灰度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism 6.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)繪圖分析，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Mat聯(lián)合LY294002對(duì)K562 細(xì)胞的增殖抑制作用

CCK-8法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖1）分析，不同濃度的Mat對(duì)K562細(xì)胞的增殖均有抑制作用，且呈劑量時(shí)間依賴(lài)性。相同作用時(shí)間下，Mat聯(lián)合LY294002對(duì)K562細(xì)胞的增殖抑制作用明顯強(qiáng)于單藥組（P＜0.01）。聯(lián)合用藥作用48 h K562細(xì)胞半數(shù)抑制濃度（IC50）時(shí)，Mat濃度約為0.4 g/L。當(dāng)Mat達(dá)到0.8 g/L以后聯(lián)合用藥組和單藥組的細(xì)胞抑制率差別趨于減小（圖1），聯(lián)合作用48 h后細(xì)胞增殖抑制率大于80%（圖1），相比較低濃度組表現(xiàn)為細(xì)胞數(shù)過(guò)少，且藥物的毒副作用與劑量相關(guān)，聯(lián)合用藥的目的之一是減少單藥的毒性。因此，以下將使用0.4 g/L作為Mat單藥組，10 μmol/L作為L(zhǎng)Y294002單藥組，0.4 g/L的Mat+10 μmol/L LY294002作為聯(lián)合用藥組，作用48 h進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

圖1 Mat和聯(lián)合LY294002對(duì)K562 細(xì)胞增殖抑制作用Fig.1 EInhibitory effect of matrine alone and in combination with LY294002 on proliferation of K562 cells.**P＜0.01,compared with the single drug group,the combined medication group of the same time of action.

2.2 Mat與LY294002單用和聯(lián)用對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響

K562細(xì)胞胞體多呈圓形、可見(jiàn)瘤狀突起、胞核大而多為類(lèi)圓形、含數(shù)個(gè)核仁（圖2B1 和2C1）。當(dāng)加入LY294002 和/或苦參堿作用48 h后，可見(jiàn)干預(yù)組細(xì)胞生長(zhǎng)明顯變慢，且有細(xì)胞出現(xiàn)形態(tài)變化。0.4 g/L 苦參堿作用48 h 后，可見(jiàn)胞體變小，胞核變小，染色質(zhì)密集（圖2A2、B2、C2）的凋亡表現(xiàn)；可見(jiàn)胞質(zhì)中出現(xiàn)數(shù)個(gè)明顯的空泡（圖2A2、B2），吖啶橙（AO）染色胞質(zhì)中可見(jiàn)呈強(qiáng)桔黃色球狀熒光（圖2C2），似為自噬小體；10 μM/L LY294002用48 h后，可見(jiàn)胞體變小、胞核變小、染色質(zhì)密集（圖2A3、B3、C3），吖啶橙染色胞質(zhì)中可見(jiàn)呈弱桔黃色球狀熒光（圖2C3）；LY294002與苦參堿聯(lián)用K562細(xì)胞形態(tài)變化更加明顯（圖2A4、B4、C4），且吖啶橙染色可見(jiàn)胞核呈致密濃染的黃綠色熒光，在少數(shù)細(xì)胞胞質(zhì)中也可見(jiàn)到桔黃色球狀熒光。

圖2 Mat聯(lián)用LY294002對(duì)K562細(xì)胞形態(tài)的影響Fig.2 Morphological changes of K562 cells treated with matrine alone or in combination with LY294002.A:Cell morphology observed under inverted microscope (Original magnification:×200).B: Cell morphology observed with Wright staining under optical microscope (×1000).C: Cell morphology observed with acridine orange (AO) staining under fluorescence microscope(×200).1:Control group;2:Matrine group;3:LY294002 group;4:Matrine+LY294002 group.

2.3 苦參堿與LY294002單用和聯(lián)用對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

Mat、LY294002、兩者聯(lián)合作用于K562 細(xì)胞48h后，早期凋亡與晚期凋亡的細(xì)胞總和分別為（13.78±1.64）%、（18.85±1.56）%、（42.50±2.63）%，與對(duì)照組（2.10±0.40）%相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，圖3）。

圖3 Mat聯(lián)合LY294002對(duì)K562細(xì)胞凋亡的影響Fig.3 Effects of matrine combined with LY294002 on apoptosis of K562 cells detected by flow cytometry.**P＜0.01,***P＜0.0001.LY:LY294002.

2.4 Mat與LY294002單用和聯(lián)用后K562細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明（表1，圖4），藥物處理K562 細(xì)胞48 h后，Mat組和LY294002組G0/G1期細(xì)胞較對(duì)照組增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表1）；聯(lián)合用藥組G0/G1期細(xì)胞顯著增加，S期顯著減少，較對(duì)照組及單藥組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，表1）。

圖4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)藥物作用48 h后K562細(xì)胞的周期分布Fig.4 Cell cycle distributions detected by flow cytometry after treatment for 48 h with matrine alone or in combination with LY294002.

表1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)藥物作用48 h后K562細(xì)胞的周期變化Tab.1 Cell cycle changes detected by flow cytometry after treatment for 48 h with matrine alone or in combination with LY294002(Mena±SD,n=3)

2.5 Mat與LY294002單用和聯(lián)用對(duì)K562細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)的影響

Western blot法對(duì)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果顯示（圖5），各藥物處理組的G0/G1期周期蛋白CyclinD1和凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2 蛋白表達(dá)量減少，凋亡相關(guān)蛋白Caspase-9的表達(dá)量增加，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且Ma（t0.4 g/L）和LY294002（10 μmol/L）聯(lián)合組蛋白的表達(dá)變化與單藥組相比差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即兩者共同作用下蛋白的表達(dá)變化更明顯降（P＜0.01）。

圖5 藥物作用48 h后對(duì)K562細(xì)胞周期蛋白和細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)水平Fig.5 Expression levels of cyclins and apoptotic proteins in K562 cells after treatment for 48 h with matrine alone or in combination with LY294002 detected by Western blotting.*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001 vs control group;#P＜0.01,##P＜0.001 vs Mat group and LY294002 group.LY:LY294002.

2.6 Mat 與LY294002 單用和聯(lián)用對(duì)K562 細(xì)胞PI3K/Akt通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明（圖6），K562 細(xì)胞內(nèi)AKT 蛋白的表達(dá)各組差異不明顯。單獨(dú)應(yīng)用Mat（0.4 g/L）或LY294002（10 μmol/L），p-mTOR、p-PI3K、p-Akt 蛋白的表達(dá)與對(duì)照組相比有下降，而聯(lián)合用藥組與對(duì)照組和單藥組比較，下降均有顯著性差異（P＜0.01），p-Akt下調(diào)更為明顯（P＜0.001）。

圖6 藥物作用48 h后對(duì)K562細(xì)胞PI3K/AKT通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響Fig.6 Expression level of proteins of PI3K/AKT pathway in K562 cells after treatment for 48 h with matrine alone or in combination with LY294002 detected by Western blotting.*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001 vs control group;#P＜0.01,##P＜0.001 vs Mat group and LY294002 group.

3 討論

隨著人們對(duì)AML發(fā)病機(jī)制認(rèn)識(shí)提高和對(duì)其細(xì)胞遺傳學(xué)、分子異常及治療靶點(diǎn)的識(shí)別，推動(dòng)了靶向治療、藥物有效組合治療、個(gè)體化治療和新藥研發(fā)等。目前，從中草藥中提取的活性化合物用于治療腫瘤受到廣泛的關(guān)注與研究［10,11］。中藥苦參堿(Mat)屬四環(huán)喹嗪啶類(lèi)生物堿，分子式為C15H24N2O，具有抗病毒、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等多種生理及藥理學(xué)活性［12］。多項(xiàng)研究表明［10］，苦參堿對(duì)白血?。?3,14］、肝癌［15］、肺癌［16］、乳腺癌［17］宮頸癌［18］等多種腫瘤細(xì)胞均有抗癌活性，能夠通過(guò)“多靶點(diǎn)-多途徑”發(fā)揮抗腫瘤作用［19］。Mat濃度不同生物學(xué)側(cè)重不同，低濃度（＜0.1 g/L）主要促進(jìn)白血病細(xì)胞分化和自噬性保護(hù)；中濃度（＞0.1 g/L）主要阻滯細(xì)胞周期，促進(jìn)細(xì)胞自噬性死亡和凋亡，從而抑制細(xì)胞生長(zhǎng)；高深度（＞2.0 g/L）主要使細(xì)胞壞死［20］。本研究以K562 細(xì)胞為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)Ma（t0.2 g/L～1.6 g/L）可以抑制白血病細(xì)胞株K562細(xì)胞增殖，且作用呈劑量和時(shí)間依賴(lài)性關(guān)系。在單藥和聯(lián)合用藥中，可見(jiàn)細(xì)胞凋亡與自噬共存于同一個(gè)細(xì)胞內(nèi)。最近研究證實(shí)［10］，自噬和凋亡兩條通路可受某些共同因子和成分的作用，兩者間存在著交叉反應(yīng)，也可以互相重疊地發(fā)揮功能；在某些條件下，自噬為凋亡所需，此時(shí)自噬通常先于凋亡，進(jìn)而啟動(dòng)凋亡，促進(jìn)細(xì)胞死亡。我們也發(fā)現(xiàn)以0.4 g/LMat處理K562細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察可見(jiàn)自噬與凋亡現(xiàn)象共存，并可見(jiàn)到兩種現(xiàn)象共存于同一細(xì)胞，我們推測(cè)可能存在細(xì)胞自噬與凋亡機(jī)制串話(huà)促進(jìn)了細(xì)胞凋亡。

Mat雖然生物活性多樣，但體內(nèi)達(dá)到抗腫瘤治療濃度有毒副作用，所以臨床一般不作為單劑量應(yīng)用于腫瘤治療，多與細(xì)胞毒性化療藥物聯(lián)合使用，提高治療效果［22,23］。雖然細(xì)胞毒性化療藥物在AML治療中占有重要地位，并且聯(lián)合Mat已有研究［23］，但是有部分AML對(duì)細(xì)胞毒性化療藥物有原發(fā)性和繼發(fā)性耐藥，也有少數(shù)患者由于身體原因不能耐受細(xì)胞毒性化療藥物，而且AML經(jīng)治療緩解后幾乎皆存在微小殘留白血病細(xì)胞的問(wèn)題，對(duì)這一部分患者，Mat聯(lián)合分子靶向藥物治療，具有重要的治療價(jià)值。急性白血病分子靶向治療是白血病治療的熱點(diǎn)，Mat是否與分子靶向藥物協(xié)同作用，需要實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。AML發(fā)生是一個(gè)多步驟的過(guò)程，它通過(guò)改變癌蛋白的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄因子，激活細(xì)胞增殖和侵襲，抑制凋亡和分化等過(guò)程，能夠靶向其中一個(gè)或多個(gè)過(guò)程的藥物應(yīng)該是癌癥防治的理想藥物［24］。PI3K/Akt是備受關(guān)注的信號(hào)通路，在包括急慢性白血病、淋巴瘤和多發(fā)性骨髓瘤在內(nèi)的多種惡性腫瘤組織中被異常激活［25］。PI3K 能磷酸化下游底物二磷酸磷脂酰肌醇（PIP2）成為三磷酸磷脂酰肌醇（PIP3），PIP3能促進(jìn)3-磷脂酰肌醇依賴(lài)性蛋白激酶（PDK1）磷酸化Akt，激活的Akt能激活下游靶基因，如及mTOR、Bcl-2、Cyclin D1等，進(jìn)而參與控制細(xì)胞的增殖、凋亡、自噬、遷移及血管生成等生物學(xué)行為。LY294002是PI3K的抑制劑，能夠透過(guò)細(xì)胞膜，可通過(guò)和ATP競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合PI3K催化結(jié)構(gòu)域，降低分子Akt的磷酸化水平，抑制腫瘤細(xì)胞增殖［9］。以往研究已證實(shí)［26］，10 μmol/L LY294002單藥能夠促進(jìn)惡性腫瘤肺癌細(xì)胞A549的自噬和凋亡，本研究形態(tài)學(xué)顯示LY294002作用于髓性白血病細(xì)胞K562亦有促進(jìn)自噬和凋亡現(xiàn)象，流式細(xì)胞儀檢測(cè)也證實(shí)能促細(xì)胞凋亡阻細(xì)胞周期，發(fā)揮抑制K562增殖作用。

臨床研究講明，PI3K/Akt通路與其他信號(hào)通路存在串?dāng)_，Akt也可以通過(guò)負(fù)反饋機(jī)制被重新激活，單獨(dú)使用通路抑制劑只有適度的抗白血病作用［27］。本研究設(shè)想通路抑制劑LY294002與具有多種生物活性的中藥Mat聯(lián)合應(yīng)用，或許能起到強(qiáng)化治療和減少藥物用量的作用。本研究根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道［28］及預(yù)實(shí)驗(yàn)采用10 μmol/L LY294002 和各濃度Mat 聯(lián)用作用于K562 24 h和48 h后，繪制增殖抑制曲線，顯示聯(lián)合用藥細(xì)胞的增殖抑制率明顯低于單藥組，藥物聯(lián)合顯示出協(xié)同效應(yīng)。形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，兩單藥組細(xì)胞數(shù)目減少，可見(jiàn)細(xì)胞胞體變小，胞核固縮，藥物聯(lián)合組表現(xiàn)更為明顯。FCM檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡以解釋這些結(jié)果的可能原因，結(jié)果表明，兩種單藥組細(xì)胞凋亡率和G0/G1期阻滯細(xì)胞的比例均高于對(duì)照組，聯(lián)合組細(xì)胞凋亡率和G0/G1期阻滯率高于單藥組，表明苦參堿和LY294002通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞凋亡和阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程協(xié)同抑制K562細(xì)胞的生長(zhǎng)。

進(jìn)一步研究了苦參堿和LY294002聯(lián)合作用增強(qiáng)抑制K562細(xì)胞增殖的分子機(jī)制。PI3K、Akt這兩個(gè)分子是PI3K/Akt信號(hào)通路最關(guān)鍵的兩個(gè)分子，它們相互作用的過(guò)程是這一通路的核心步驟［8］。PI3K可以被多個(gè)上游通路激活，PI3K相關(guān)激酶家族成員在Akt絲氨酸473位點(diǎn)將其磷酸化，活化的Akt通過(guò)磷酸化抑制或增強(qiáng)靶蛋白的活性，從而調(diào)節(jié)多種類(lèi)型的下游通路［29］?；罨腁kt 通過(guò)磷酸化TSC2 切入mTOR 通路，阻止TSC1/2 對(duì)小G 蛋白R(shí)heb 的負(fù)調(diào)控，從而間接激活mTOR復(fù)合物1(mTORC1)來(lái)促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，抑制細(xì)胞自噬和凋亡。活化的Akt可以通過(guò)下游多種途徑發(fā)揮抑制凋亡的作用，活化的Akt 磷酸化Bcl-2 家族成員BAD，使BAD與14-3-3結(jié)合而阻止BAD與Bcl-2/Bcl-XL結(jié)合，從而保持Bcl-2/Bcl-XL的抑制凋亡作用［30］。Bcl-2是目前研究最廣泛的抑制凋亡蛋白之一，能與促凋亡蛋白BAX形成異源二聚體，阻斷凋亡信號(hào)，促進(jìn)細(xì)胞的存活和增殖［31］?；罨腁kt還能抑制蛋白水解酶Caspase-9的活性從而阻止凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)的啟動(dòng)，發(fā)揮抑制凋亡作用。Akt的激活還可以使GSK-3β磷酸化而失活，從而激活c-myc和Cyclin D1等信號(hào)分子，促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)與存活。Cyclin D1為調(diào)控細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期的關(guān)鍵蛋白，其表達(dá)水平降低，細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢［32］。LY294002 是PI3K的抑制劑，間接抑制Akt活化，Mat能通過(guò)多條通路抑制Akt 活性和抑制細(xì)胞增殖促進(jìn)凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，Mat 和LY294002組單藥組PI3K 和Akt的磷酸化水平下調(diào)，同時(shí)mTOR的磷酸化修飾水平下調(diào)，Bcl-2和CyclinD1的表達(dá)均下調(diào)，Caspase-9 的表達(dá)均上調(diào)。苦參堿聯(lián)合LY294002的治療效果較單一藥物治療有顯著性差異（P＜0.01），特別是p-Ak（tP＜0.001），兩者聯(lián)用起到了生物學(xué)上的協(xié)同和增強(qiáng)效應(yīng)。

綜上所述，在體外聯(lián)合運(yùn)用Mat和LY294002能顯著抑制K562 細(xì)胞系增殖和促進(jìn)K562細(xì)胞周期阻滯及細(xì)胞凋亡。其可能原因之一是加強(qiáng)了抑制PI3K/Akt通路中Akt的活化，從而抑制下游事件的發(fā)生，導(dǎo)致K562細(xì)胞的增殖抑制和凋亡增加。因此有多種抗腫瘤活性的中藥與靶點(diǎn)信號(hào)通路抑制劑聯(lián)合應(yīng)用理論上應(yīng)能成為AML患者治療的新方向，本實(shí)驗(yàn)也為臨床中西醫(yī)聯(lián)合用藥提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。