程氏蠲痹湯通過抑制PI3K/Akt/mTOR 信號軸促進(jìn)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞的自噬

孫廣瀚，許 霞，萬 磊，南淑玲，王玉鳳，趙 黎，程 卉，王 坤，劉 瑩，方妍妍，孫 朗，朱 俊

安徽中醫(yī)藥大學(xué)1中醫(yī)學(xué)院，3科研技術(shù)中心，安徽 合肥 230012；2安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，安徽 合肥 230031

程氏蠲痹湯（JBT）出自新安醫(yī)家程國彭《醫(yī)學(xué)心悟》，主治因風(fēng)、寒、濕三氣合而成痹［1］?，F(xiàn)代多應(yīng)用于治療神經(jīng)根型頸椎病［2］、急性期臂叢神經(jīng)炎［3］、肩周炎［4］、坐骨神經(jīng)痛［5］等，其中在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎動物實(shí)驗(yàn)中論證最多［6,7］，具有較好的抗炎鎮(zhèn)痛作用［8］。本課題組前期研究中選擇的是佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠FLS［9］，故本文選擇人關(guān)節(jié)FLS希望能進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)JBT作用機(jī)制。

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）是一種炎癥性關(guān)節(jié)病，可導(dǎo)致多臟器病變，其主要特征包括滑膜炎和骨關(guān)節(jié)破壞。失調(diào)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)是引發(fā)RA的主要因素，但其中的精細(xì)分子機(jī)制仍不清楚。自噬在維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)從而使細(xì)胞適應(yīng)外界環(huán)境中的作用日益凸顯［10］。RA-FLS的自噬增加，以抵抗細(xì)胞凋亡，改善RA的癥狀，而RA-FLS自噬功能紊亂將導(dǎo)致滑膜組織增生［11,12］。本團(tuán)隊(duì)在前期研究中發(fā)現(xiàn)滑膜成纖維細(xì)胞（FLS）中Beclin-1、LC3B mRNA及蛋白表達(dá)水平，提高細(xì)胞自噬水平有關(guān)［9］。細(xì)胞自噬信號通路可被多種途徑激活，在這些途徑中，PI3K/Akt/mTOR 通路是調(diào)節(jié)自噬功能的經(jīng)典上游信號通路。PI3K可被激素、生長因子等刺激激活。激活的PI3K產(chǎn)生信使PIP3，使非活性Akt 發(fā)生構(gòu)象轉(zhuǎn)變。然后Ser124/Thr450和Thr308/Ser473位點(diǎn)相繼磷酸化，導(dǎo)致Akt信號被激活?；罨腁kt進(jìn)一步觸發(fā)mTOR的磷酸化激活，mTOR激酶直接作用于Atg等蛋白來調(diào)節(jié)自噬體的形成。RA模型中PI3K/Akt/mTOR通路研究，大多集中在細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、凋亡、自噬等方面［13］，而且中醫(yī)藥在此基礎(chǔ)上有一定的研究成果［14,15］，但是JBT在PI3K/Akt/m TOR信號通路中扮演的角色，目前尚無相關(guān)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)從自噬依賴的PI3K/Akt/mTOR信號通路探討了JBT 治療RA 的機(jī)制，觀察JBT 是否通過PI3K/Akt/mTOR信號軸調(diào)控RA-FLS自噬，為RA的臨床用藥提供理論。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞及藥物來源

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)滑膜成纖維細(xì)胞（HUM-iCell-s010）購自上海賽百慷生物技術(shù)股份有限公司，纖維連接蛋白或波形蛋白免疫熒光染色為陽性，經(jīng)上海賽百慷生物技術(shù)股份有限公司鑒定細(xì)胞純度高于90%。結(jié)合《醫(yī)學(xué)心悟》原方和臨床中的藥物用量比例，本研究中選用的程氏蠲痹湯（JBT）劑量為羌活10 g，獨(dú)活10 g，桂枝9 g，當(dāng)歸9 g，秦艽10 g，海風(fēng)藤20 g，川芎10 g，桑枝30 g，乳香9 g，木香6 g，炙甘草5 g。藥物由安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑中心提供并制成藥液。

1.2 凍干粉制備

將所得藥液3000×g離心30 min 祛除雜質(zhì)，放置于-80 ℃冷凍過夜。用冷凍干燥機(jī)將冷凍過夜的藥液進(jìn)行冷凍干燥，得凍干粉，放置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 CCK8法檢測細(xì)胞抑制率

胰酶消化對數(shù)期細(xì)胞，離心收集制成細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)調(diào)整其濃度至5～10×104/mL。接種至96孔培養(yǎng)板，每孔100 μL，邊緣孔用無菌PBS填充。將接種好的細(xì)胞培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，5%CO2，37 ℃孵育過夜，倒置顯微鏡下觀察。培養(yǎng)不同時(shí)間后，每孔加入10 μL CCK8，繼續(xù)培養(yǎng)1～4 h。酶聯(lián)免疫檢測儀A450nm處測量各孔的吸光值。同時(shí)設(shè)置空白孔（培養(yǎng)基、CCK8）。抑制率=[(對照孔A值－實(shí)驗(yàn)孔A值)/(對照孔A值－空白孔A值)]×100%，實(shí)驗(yàn)組為含待測物，對照孔為不含待測物，空白孔為僅有培養(yǎng)基。

1.4 電鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

收集的細(xì)胞團(tuán)塊采用2.5%戊二醛固定24 h。吸除培養(yǎng)液，經(jīng)消化、離心收集細(xì)胞。加入預(yù)冷的PBS，置于離心機(jī)離心5 min，棄去上清液，加入固定液（2.5%戊二醛）固定細(xì)胞，低溫保存，委托安徽中抗生物技術(shù)有限公司進(jìn)行后續(xù)處理并通過透射電鏡觀察、拍照記錄細(xì)胞亞顯微結(jié)構(gòu)。

1.5 自噬雙標(biāo)腺病毒實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞內(nèi)自噬流

將細(xì)胞接種于共聚焦培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞鋪滿50%時(shí)采用自噬雙標(biāo)腺病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，按照說明書觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染情況并對細(xì)胞進(jìn)行換液。36～48 h后按照上述分組進(jìn)行干預(yù)，在共聚焦顯微鏡下觀察。每孔取5個(gè)視野觀察并拍照。mRFP-GFP-LC3串聯(lián)熒光蛋白腺病毒中表達(dá)的GFP和mRFP用于標(biāo)記及追蹤LC3，最后將處理好的標(biāo)本在共聚焦顯微鏡下在顯微鏡成像后紅綠熒光merge后通過merge后出現(xiàn)的黃色斑點(diǎn)即是自噬小體，紅色的斑點(diǎn)即是自噬溶酶體。

1.6 RT-qPCR檢測細(xì)胞對PI3K、Akt和mTOR的mRNA表達(dá)水平

根據(jù)制造商的方案使用1 mL TRIzol 試劑從培養(yǎng)的細(xì)胞中提取總RNA。使用PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser進(jìn)行RT-qPCR。使用Ct（2-△△C）t方法計(jì)算相對基因表達(dá)水平，并將PI3K、Akt和mTOR的mRNA 標(biāo)準(zhǔn)化為mRNA 的β-actin 量。物合成由Sangon Biotech公司設(shè)計(jì)，引物的序列見表1。

表1 PI3K、Akt和mTOR的mRNA的引物Tab.1 Primers used for RT-qPCR

1.7 Western blot分析細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白及PI3K/Akt/mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)蛋白表達(dá)

各組細(xì)胞采用RIPA裂解液1 mL（內(nèi)含1 mmol/L PMSF）裂解。使用SDS-PAGE 電泳后采用濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜，NLRP3轉(zhuǎn)膜時(shí)間為90 min；Caspase-1轉(zhuǎn)膜時(shí)間為40 min；IL-1β轉(zhuǎn)膜時(shí)間為35 min；IL-18 轉(zhuǎn)膜時(shí)間為25 min。PI3K、Akt、mTOR、p-mTOR、p-PI3K、P62、Beclin-1、LC3B一抗稀釋比例為1∶1000，p-Akt稀釋比例為1∶2000，于4度冰箱孵育過夜后PBST 洗滌NC膜3次，10 min/次。二抗孵育（稀釋比例：10 000），PBST洗滌10 min，共3次。使用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑盒在化學(xué)發(fā)光成像儀上對條帶進(jìn)行可視化，并通過Image J軟件分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，采用GraphPad Prism 9.0軟件作圖，多組間均值的比較采用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CCK8檢測JBT對RA-FLS細(xì)胞抑制作用

以25%為倍數(shù)篩選0.1、0.25、0.5、0.75、1 mg/mL JBT凍干粉培養(yǎng)液，F(xiàn)LS組未加藥物。加入JBT組與RAFLS組相比，細(xì)胞抑制率增加（P＜0.05）；與加入0.1 mg/mL JBT相比，加入0.25、0.5、0.75 mg/mL JBT后細(xì)胞抑制率增加（P＜0.05），加入1 mg/mL JBT后細(xì)胞抑制率降低（P＜0.05），而且加入0.5 mg/mL JBT細(xì)胞抑制率最高，因此JBT最佳作用濃度為0.5 mg/mL；與0 h和12 h相比，24 h、48 h及72 h細(xì)胞抑制率增加（P＜0.05），且24 h、48 h及72 h細(xì)胞活力無明顯差異（P＞0.05），因此JBT最佳作用時(shí)間為12 h（圖1）。

圖1 以25%為倍數(shù)篩選JBT最佳劑量Fig.1 Determination of the optimal JBT concentration for cell treatment.

2.2 電鏡觀察JBT對細(xì)胞自噬的影響

FLS組線粒體模糊不清，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)斷裂增多、糖原顆粒明顯減少，自噬體少量存在。FLS+JBT組中能看到線粒體明顯皺縮，線粒體膜模糊不清，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)減少，自噬體大量存在。FLS+RAPA組中線粒體明顯減少，線粒體空泡變性嚴(yán)重，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕微擴(kuò)張，自噬體較多。FLS+RAPA+JBT組中線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器豐富，糖原顆粒密集，線粒體有輕微損傷，嵴清晰可見，自噬體較多（圖2）。

圖2 電鏡觀察自噬體變化Fig.2 Transmission electron microscopy for observing autophagosome changes in RA-FLS with different treatment.indicates the autophagosomes,the mitochondria,and the rough endoplasmic reticulum.A:FLS group.B:FLS+JBT group.C:FLS+RAPAgroup.D:FLS+RAPA+JBT group.

2.3 細(xì)胞自噬流的變化

自噬雙標(biāo)腺病毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，F(xiàn)LS+RAPA+JBT組較FLS組、FLS+JBT組、FLS+RAPA組相比，黃色斑點(diǎn)明顯增多，且黃色斑點(diǎn)多于紅色斑點(diǎn)，即自噬小體顯著增多，且自噬溶酶體較少；FLS 組較FLS+JBT 組、FLS+RAPA組、FLS+RAPA+JBT組相比，紅色斑點(diǎn)增多、黃色斑點(diǎn)減少，即自噬溶酶體增多自噬小體減少（圖3）。

圖3 mRFP-GFP-LC3腺病毒檢測自噬流情況Fig.3 mRFP-GFP-LC3 adenovirus for detecting autophagic flow(Original magnification: ×600).The yellow dots indicate autophagosomes,and the red dots indicate autophagolysosomes in the merged images.A:FLS group.B:FLS+JBT group.C:FLS+RAPAgroup.D:FLS+RAPA+JBT group.

2.4 JBT對PI3K/Akt/mTOR 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響

RT-qPCR結(jié)果顯示，F(xiàn)LS+JBT組、FLS+RAPA組、FLS+RAPA+JBT組較FLS組相比，PI3K、Akt和mTOR的mRNA的水平明顯降低（P＜0.01）。FLS+RAPA+JBT組較FLS組、FLS+JBT組、FLS+RAPA組相比，PI3K、Akt 和mTOR 的mRNA 的水平降低更明顯（P＜0.01，圖4）。Western blotting分析顯示，F(xiàn)LS+JBT組、FLS+RAPA 組、FLS+RAPA+JBT 組與FLS 組相比，F(xiàn)LS+RAPA+JBT組較FLS組、FLS+JBT組、FLS+RAPA組相比，PI3K、Akt、mTOR蛋白的水平無明顯差異（P＞0.05）。FLS+JBT 組、FLS+RAPA 組、FLS+RAPA+JBT 組較FLS組相比，p-Akt、p-mTOR、p-PI3K蛋白水平明顯降低（P＜0.05），F(xiàn)LS+RAPA+JBT組較FLS組、FLS+JBT組、FLS+RAPA組相比，p-Akt、p-mTOR、p-PI3K蛋白水平降低更明顯（P＜0.05，圖4、5）。

圖4 PI3K/Akt/mTOR相關(guān)基因的表達(dá)Fig.4 Expression of mRNAs of PI3K/Akt/mTOR-related genes.*P＜0.05,**P＜0.01 vs FLS group.##P＜0.01 vs FLS+RAPA+JBT group.

圖5 PI3K/Akt/mTOR通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平Fig.5 PI3K/Akt/mTOR pathway-related protein expression levels detected by Western blotting.A:FLS group.B:FLS+JBT group.C:FLS+RAPA group.D:FLS+RAPA+JBT group.*P＜0.05,**P＜0.01 vs FLS group.#P＜0.05,##P＜0.01 vs FLS+RAPA+JBT group.

2.5 細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

FLS+RAPA+JBT組較FLS組、FLS+JBT組、FLS+RAPA 組相比，P62 蛋白表達(dá)量明顯下降，Beclin-1、LC3B蛋白表達(dá)量明顯上升（P＜0.05）；FLS組較FLS+JBT組、FLS+RAPA組、FLS+RAPA+JBT組相比，P62蛋白表達(dá)量高，Beclin-1、LC3B 蛋白表達(dá)量明顯較低（P＜0.05，圖6）。

圖6 P62、Beclin-1、LC3B蛋白表達(dá)水平Fig.6 Expression levels of P62,Beclin-1,and LC3B proteins in the FLS.A:FLS group.B:FLS+JBT group.C:FLS+RAPA group.D:FLS+RAPA+JBT group.*P＜0.05,**P＜0.01 vs FLS group;#P＜0.05,##P＜0.01 vs FLS+RAPA+JBT group.

3 討論

近年來圍繞著自噬如何影響RA發(fā)病的研究逐年增加，但具體機(jī)制尚不明確。本文研究程氏蠲痹湯通過PI3K/Akt/mTOR信號軸調(diào)控RA-FLS自噬的影響及相關(guān)機(jī)制，研究結(jié)果表明JBT可抑制RA-FLS的存活率，并可提高細(xì)胞自噬水平，其機(jī)制可能與下調(diào)PI3K/Akt/mTOR信號通路有關(guān)。

同屬溫性藥物為主的五味溫通除痹膠囊［16］、具有溫通作用的艾灸［17］也能促進(jìn)細(xì)胞自噬，緩解炎癥。電鏡是檢測自噬的金標(biāo)準(zhǔn)，自噬體的特征是雙層膜狀的包裹著胞漿和線粒體等細(xì)胞器的空泡結(jié)構(gòu)，當(dāng)自噬體與溶酶體融合形成自噬溶酶體后，空泡內(nèi)的細(xì)胞器會被溶酶體降解，形成黑色顆粒狀物質(zhì)的單層膜狀空泡結(jié)構(gòu)［18］。電鏡及自噬雙標(biāo)腺病毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，JBT加入后自噬小體顯著增多，且自噬溶酶體較少，CCK8結(jié)果顯示JBT能夠抑制RA-FLS增殖，并且具有濃度依賴性。說明JBT提高保護(hù)細(xì)胞的功能，對于各種應(yīng)激導(dǎo)致的細(xì)胞損傷能有效應(yīng)對。

研究證實(shí)，PI3K/Akt/mTOR信號通路是調(diào)節(jié)自噬的主要信號通路［19,20］。PI3K激活后，將其底物3,4 二磷酸磷脂酰肌醇磷酸化為3,4,5 三磷酸磷脂酰肌醇，與Akt結(jié)合，使其活化，活化的Akt進(jìn)一步與TSC1/2復(fù)合物結(jié)合，激活下游分子mTOR。mTOR是自噬啟動階段的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，活化后可抑制自噬發(fā)生［21］。啟動階段的靶點(diǎn)主要為mTOR相關(guān)靶點(diǎn)，包括TOR復(fù)合體1（TORC1）和Ⅰ型PI3K。Beclin-1、p62、LC3B 是細(xì)胞自噬的標(biāo)志性蛋白［22］。Beclin-1在自噬起始階段發(fā)揮重要作用，是形成自噬體的必需分子之一。Beclin-1蛋白表達(dá)水平與自噬成正相關(guān)［23］，本研究表明，JBT 能提高Beclin-1蛋白表達(dá)水平，增強(qiáng)細(xì)胞自噬。最經(jīng)典的自噬相關(guān)藥物，雷帕霉素（RAPA）的作用靶點(diǎn)即為TORC1［24］，TORC1可以影響mTOR的活性，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬的活性。有研究表明，加入RAPA后巨噬細(xì)胞中的自噬明顯增強(qiáng)［25］。本研究結(jié)果顯示JBT能夠使細(xì)胞中PI3K、Akt和mTOR的mRNA的水平降低，PI3K、p-Akt及pmTOR蛋白的表達(dá)下調(diào)，提示其促進(jìn)結(jié)RA-FLS自噬，抑制細(xì)胞增殖，與抑制PI3K/Akt/mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活性密切相關(guān)。

綜上所述，本研究首先通過CCK8選取JBT抑制RA-FLS增殖的最佳濃度，JBT干預(yù)后明顯增強(qiáng)了RAFLS 細(xì)胞的自噬水平，進(jìn)一步應(yīng)用RAPA 阻斷PI3K/Akt/mTOR 信號，發(fā)現(xiàn)JBT 可能是通過PI3K/Akt/mTOR 信號增強(qiáng)自噬，并與RAPA起協(xié)同作用，進(jìn)一步增強(qiáng)自噬作用，更為深入的機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。