基于氧化亞銅納米顆粒的光熱//化學動力協(xié)同策略體外抑制胃癌細胞的遷移

溫海飛，黃顯瑩

南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院第一臨床醫(yī)學院，廣東 廣州 510515

胃癌（GC）全球每年新發(fā)病例數(shù)超百萬，而其中中國患者約占半數(shù)［1,2］。我國80%胃癌患者在確診時已是進展期以及晚期［3］，針對此類患者而言，以鉑類和氟尿嘧啶類藥物為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療是首選的一線治療方案。盡管其研究工作取得了重大的進展，但傳統(tǒng)輔助化療治療選擇仍然有限、毒副作用大，目前總體5年生存率不足50%［4］。尋找一種既能提高療效又能避免傳統(tǒng)輔助化療帶來的毒副作用的新型治療方案，是目前突破胃癌治療瓶頸的關(guān)鍵。

光熱療法（PTT）是利用近紅外光（NIR）的光熱轉(zhuǎn)換作用，在無創(chuàng)的情況下通過熱效應誘導腫瘤細胞死亡［5］。NIR不僅可以直接引起腫瘤細胞死亡，同時可更為精準地促進藥物的釋放［6］。除此以外，研究證實在低于42 ℃的條件下進行熱療可增加腫瘤區(qū)域的血流灌注，從而提高藥物的有效濃度、增強藥物的細胞毒性［7,8］。光熱療法與化療相結(jié)合有望成為一種新型、有效的胃癌治療方案。銅基金屬納米材料，如銅納米顆粒（Cu NPs）、硫化銅（CuS）、硒化銅（Cu2Se）、氧化銅（CuO）等，其光熱轉(zhuǎn)換率高，介導的類芬頓反應可催化腫瘤微環(huán)境（TME）中的過氧化氫（H2O2）產(chǎn)生過量的羥自由基（?OH），從而重塑腫瘤相關(guān)微環(huán)境、誘導腫瘤細胞的死亡［9-11］，在乳腺癌、前列腺癌、惡性胸膜間皮瘤等治療中取得了一定的療效［12］。其中氧化亞銅（Cu2O）作為一種穩(wěn)定的銅基納米藥物，在黑色素細胞瘤、膀胱癌、宮頸癌細胞系中已被證實可通過產(chǎn)生活性氧（ROS）促進相關(guān)的腫瘤細胞凋亡［13-15］，但其用于胃癌的治療卻鮮有報道。基于此，本研究制備了Cu2O，探索了其物化表征以及在胃癌細胞系中的抗腫瘤效應，旨在初步探索Cu2O是否可通過光熱/化學動力協(xié)同作用在胃癌中起到療效。

1 材料和方法

1.1 Cu2O納米顆粒的合成

85 mg二水氯化銅（CuCl2-2H2O）與300 mg 聚乙烯吡咯烷酮（PⅤP，MW=6000）放在20 mL去離子水中以600 r/min攪拌1 h，隨后加入320 mg NaOH攪拌溶解。將上述溶液置入氮氣環(huán)境，逐漸加入176 mg抗壞血酸繼續(xù)1000 r/min攪拌1 h。經(jīng)過去離子水以10 000 r/min反復洗滌，離心3次，隨后在50 ℃真空干燥24 h后，得到30 mg氧化亞銅（Cu2O）。

1.2 Cu2O納米顆粒的形態(tài)大小

收集Cu2O納米并適當稀釋樣品溶液后，用移液槍吸取10 μL樣品滴加在鎳網(wǎng)上。室溫放置至溶液蒸發(fā)后，用離子濺射儀鍍上導電金膜，在200 kⅤ的加速電壓下，采用TEM觀察納米復合物的形貌特征（JeolJem-2100f TEM透射電鏡儀），并利用動態(tài)光散射原理測定Cu2O納米顆粒的粒徑和電勢。

1.3 Cu2O納米顆粒的光熱功能

收集成功合成的Cu2O納米，并按一定比例進行適當稀釋后，取不同濃度（20 μg/mL、40 μg/mL、60 μg/mL）的200 μL稀釋后的溶液加入到1.5 mL的EP管中（其中PBS作為陰性對照）。將樣品及激光儀（LR-MFJ-1064/5000；Bruke）固定后，打開近紅外（808 nm）激光儀光源對樣品進行照射（0.5 W/cm2，5 min），并通過紅外探測儀（Tensor 27 FT IR spectrometer;Bruke）進行拍照分析溫度變化水平，繪制升溫曲線。

1.4 Cu2O納米顆粒的化學動力功能

利用選擇性?OH捕獲后亞甲基藍（MB）降解的經(jīng)典比色法，在PBS（pH=6.5）中加入4 mmol/LH2O2的MB溶液（10 μg/mL），在不同溫度條件下（37 ℃和45 ℃），加入不同濃度的Cu2O 納米顆粒（0、20、40、60 μg/mL），檢測其λ=664 nm 的吸光度，用于檢測不同濃度材料的?OH生成量，即類芬頓效果。

1.5 細胞培養(yǎng)

使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基、置于37 ℃5%CO2培養(yǎng)箱中進行胃癌細胞（AGS 及MKN45）培養(yǎng)。每24 h更換1次培養(yǎng)基，細胞密度超過70%時，以0.25%胰酶消化進行傳代培養(yǎng)。

1.6 激光共聚焦實驗

將胃癌細胞（AGS及MKN45）鋪板于細胞培養(yǎng)板貼壁后，在每個微孔中加入不同濃度的Cu2O納米進行孵育，并進行光照或者非光照處理，繼續(xù)放置在孵育箱中培養(yǎng)24 h。最后用活性氧試劑盒染色、細胞核DAPI染色，再用激光共聚焦進行拍照。

1.7 CCK-8細胞毒性實驗

將胃癌細胞（AGS及MKN45）鋪板于細胞培養(yǎng)板貼壁后，在每個微孔中加入不同濃度的Cu2O納米（0、2、4、16、32以及64 μg/mL）進行孵育，并進行光照或者非光照處理，繼續(xù)放置在孵育箱中培養(yǎng)24 h；然后，去除培養(yǎng)基、并在每個待測微孔中加入100 μL預先配置好的10%CCK-8試劑；最后，用酶標儀測定每個測量孔在450 nm處吸光度，并記錄結(jié)果進行對比分析，24 h后用CCK-8檢測試劑盒處理，并用酶標儀檢測吸光度間接判斷細胞存活率。

1.8 Transwell細胞遷移實驗

將胃癌細胞（AGS及MKN45）鋪板于細胞培養(yǎng)板貼壁后，利用不同濃度的Cu2O納米（16 μg/mL）進行孵育，并進行光照或者非光照處理，24 h后去除培養(yǎng)基、胰酶消化重懸并收集細胞。用無血清培養(yǎng)基重懸細胞，按2×105/100 μL加入至Transwell上室，下室加500 μL含20%FBS的DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h后取出小室，棉簽拭掉上室內(nèi)側(cè)細胞，4%多聚甲醛固定細胞，0.5%結(jié)晶紫溶液染色，顯微鏡下選取5個視野進行拍照、計數(shù)。

1.9 統(tǒng)計學分析

所有數(shù)據(jù)均采用IBM SPSS 20.0處理。計數(shù)資料比較則采用卡方檢驗。采用Kaplan-Meier法進行生存分析，并用Log-rank檢驗比較組間差異。以α=0.05為檢驗水準，對以上結(jié)果均進行雙側(cè)檢驗。

2 結(jié)果

2.1 Cu2O納米顆粒的形貌

本實驗成功制備Cu2O納米顆粒，透射電鏡圖可見Cu2O納米顆粒是約為100 nm的光滑圓球形（圖1A）。對Cu2O納米顆粒的水合粒徑及Zeta電位進行分析，經(jīng)由馬爾文粒徑儀測得，Cu2O納米的平均Zeta電位為30±2.4 mⅤ，而其水合平均粒徑為84±14.1 nm（圖1B、C）。

圖1 氧化亞銅(Cu2O)納米顆粒的理化性質(zhì)Fig.1 Physical and chemical properties of Cu2O nanoparticles.A: Morphology of Cu2O nanoparticles under transmission electron microscope(TEM).B:Zeta potential of Cu2O nanoparticles.C:Particle size of Cu2O nanoparticles.Data are shown as Mean±SD(n=3).

2.2 Cu2O納米顆粒的光熱性能

在0.5 W/cm2的近紅外光照條件下，不同濃度的Cu2O納米顆粒展現(xiàn)出不同的光熱性能，濃度越高，光熱效果越強（圖2A）。而對于不同功率的近紅外光照條件下，隨著時間的延長，其溫度逐漸升高。其中0.5 W/cm2近紅外光照條件下，5 min后，Cu2O納米系統(tǒng)溫度可升高50 ℃（圖2B）。

圖2 Cu2O 納米顆粒的光熱性能Fig.2 Photothermal properties of Cu2O nanoparticles.A: Photothermal effect of different concentrations of Cu2O nanoparticles.B:Photothermal effect of Cu2O nanoparticles irradiated by near-infrared light with different powers.

2.3 Cu2O納米顆粒的類芬頓效應

在同樣過氧化氫濃度的條件下，不同濃度的Cu2O在37 ℃以及45 ℃條件下，均展示出不同的吸光度，隨著濃度的增加吸光度越低。在λ=664 nm條件下，吸光度最高（圖3A、B）。在同樣過氧化氫濃度的條件下，相比于37 ℃，45 ℃條件下的Cu2O展示出更低的吸光度，溫度的升高可提高Cu2O的類芬頓能力。

圖3 Cu2O 納米顆粒的類芬頓效應Fig.3 Fenton-like effect of Cu2O nanoparticles.A:Concentration of?OH produced by different concentrations of Cu2O nanoparticles at 37 ℃.B: Concentration of ?OH formed by different concentrations of Cu2O nanoparticles at 45 ℃.

2.4 Cu2O納米顆粒產(chǎn)生ROS的能力

為進一步評估Cu2O納米顆粒的活性氧能力，我們將胃癌AGS細胞系以及MKN45細胞系經(jīng)近紅外光照射下（0.5 W/cm2，5 min）后培養(yǎng)24 h后評估其產(chǎn)生ROS的能力。無論是AGS 細胞以及MKN45 細胞，在與Cu2O納米顆粒共孵育后均可產(chǎn)生ROS。而經(jīng)近紅外光照射下（0.5 W/cm2，5 min）后，AGS細胞何MKN45細胞產(chǎn)生的ROS量明顯增加（圖4A、B）。

圖4 近紅外光照射下(0.5 W/cm2，5 min)Cu2O 納米顆粒在胃癌AGS細胞系以及MKN45細胞系中的活性氧(ROS)生成能力Fig.4 Ability of Cu2O nanoparticles to induce reactive oxygen species (ROS) production in gastric cancer AGS cells and MKN45 cells under 0.5 W/cm2 near-infrared irradiation for 5 min(Original magnification:×100).

2.5 Cu2O納米顆粒抑制胃癌細胞增殖能力

為進一步評估Cu2O納米的體外抗腫瘤作用，我們用CCK-8實驗評估該納米復合物的細胞毒性。CCK-8細胞毒性實驗結(jié)果顯示，不同濃度Cu2O納米顆粒（0、2、4、16、32以及64 μg/mL）處理的AGS及MKN45細胞存活率均呈濃度依賴性降低，具有顯著抑制增殖作用。此外，在相同濃度Cu2O納米顆粒處理下，經(jīng)近紅外光照（0.5 W/cm2，5 mins）的細胞存活率更低（圖5A、B）。

圖5 Cu2O 納米顆粒對胃癌AGS細胞以及MKN45細胞活性的影響Fig.5 Effects of Cu2O nanoparticles on viability of gastric cancer AGS cells and MKN45 cells.A: Survival rate of AGS cells treated with different concentrations of Cu2O nanoparticles with or without near-infrared light(0.5 W/cm2,5 min).B:Survival rate of MKN45 cells treated with different concentrations of Cu2O nanoparticles with or without near-infrared light(0.5 W/cm2,5 min).***P＜0.001.Data are shown as Mean±SD(n=3).

2.6 Cu2O納米顆粒抑制胃癌細胞轉(zhuǎn)移能力

為進一步評估Cu2O納米的體外抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用，我們用Transwell 小室遷移實驗分析AGS 細胞以及MKN45細胞遷移潛能水平。相比于空白對照組，Cu2O納米顆粒處理的胃癌細胞遷移細胞數(shù)目明顯減少。此外，經(jīng)近紅外光照（0.5 W/cm2，5 min）的細胞遷移能力更低（圖6）。

圖6 Cu2O 納米顆粒對胃癌AGS細胞以及MKN45細胞遷移能力的影響Fig.6 Effect of Cu2O nanoparticles on migration of gastric cancerAGS cells and MKN45 cells(×100).

3 討論

胃癌在我國的發(fā)病率僅次于肺癌居第2位，死亡率居第3位，是威脅國民身心健康的重大疾?。?］。目前，進展期胃癌患者治療主要以根治性切除聯(lián)合術(shù)后輔助化療為主的綜合治療［16］。但是傳統(tǒng)的化療藥物（如奧沙利鉑，紫杉醇等）容易引發(fā)脫發(fā)、惡心嘔吐、骨髓抑制等全身多系統(tǒng)毒副作用，還易導致藥物化療耐藥，在一定程度上降低化療藥物的抗腫瘤作用［17-19］。因此在本研究中，我們構(gòu)建了納米載藥平臺Cu2O，隨后探索了Cu2O納米顆粒的物化表征，包括其形貌、光熱性能以及類芬頓效應。結(jié)果表明，與其余銅基納米材料類似，為一光滑圓球形，具有良好的光子特性［20,21］，包括光熱療法，硫族銅化合物在NIR范圍內(nèi)具有化學計量依賴的局部表面等離子體激元共振（LSPR）吸收［22］，因此，已得到了廣泛研究，同時，基于芬頓反應的催化納米療法通過轉(zhuǎn)化過氧化氫產(chǎn)生有毒的ROS，傳統(tǒng)的鐵基納米試劑芬頓反應的pH低（pH=3～4），反應速度慢（≈63 M-1s-1），在NIR的作用下銅基納米藥物具有更高的芬頓反應速率（≈1×104M-1s-1），反應具有更高的pH范圍，所產(chǎn)生的類芬頓效果可產(chǎn)生大量的活性氧用于殺傷腫瘤細胞的氧化應激過程［23］。PTT作為一種侵入性較小、且較為有效的抗腫瘤模式，近年來備受關(guān)注［24］。其中，在癌細胞上產(chǎn)生強的光照吸收以及高的光熱轉(zhuǎn)換效率是光熱療法能否成功的關(guān)鍵［25］。在納米材料中，銅基納米材料對光有很強的表面等離子共振吸收效應，有很強的光熱轉(zhuǎn)換效率，可以在局部范圍內(nèi)迅速加熱，從而在腫瘤的PTT中具有明顯的優(yōu)越性［26-28］。如在4T1細胞中，QCS/CuSNPs可有效地吸收NIR、產(chǎn)生熱效應，進而產(chǎn)生大量的ROS誘導腫瘤細胞凋亡［29］。PTT誘導的熱敏化效應（如抑制DNA合成和修復、損傷細胞膜和細胞骨架）可與其他治療模式之間產(chǎn)生協(xié)同作用［30］。

其中，化學動力治療（CDT）的治療模式，是指在腫瘤酸性微環(huán)境下，細胞中H2O2在金屬催化劑存在的前提下，發(fā)生芬頓或類芬頓反應并產(chǎn)生大量的?OH，產(chǎn)生的?OH可通過氧化還原反應損傷脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA等從而引起細胞死亡的一種新型治療模式［31,32］。單一的CDT 作用難以殺滅腫瘤，需輔以其他的治療。而PTT以及CDT均具有腫瘤選擇性、調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境等特點，在溫度升高的情況下可大大增加化學動力作用，因此，光熱治療聯(lián)合化學動力治療是一種新穎且有效的治療方法［33,34］。文獻報道一般是將一種具有光熱作用的材料與一種具有化學動力作用的材料相互結(jié)合從而達到光熱治療聯(lián)合化學動力治療的目［35-37］。選擇合適的光敏劑以及CDT反應底物是設(shè)計、優(yōu)化光熱聯(lián)合化學動力治療的關(guān)鍵。然而，通常來說選擇的PTT 以及CDT反應底物為兩種不同的納米材料，涉及到兩種材料的結(jié)合，因此存在著載體與配體是否能夠緊密結(jié)合、相互作用比例和兩者結(jié)合的復合物是否穩(wěn)定的問題。因此，探索一種既具有光熱治療效果亦具有化學動力效果的納米復合物尤為迫切。近年來，銅基納米材料在CDT中蓬勃發(fā)展，極大地提高了CDT的效率［38］。銅基納米材料作為無機納米材料具有獨特的電光聲磁性能；同時在制備過程中更易控制和調(diào)整其結(jié)構(gòu)、組成、形態(tài)和尺寸，因此在多種腫瘤成像和治療中起到了越來越大的作用［39］。尤其是Cu+，可與H2O2發(fā)生類芬頓反應生成大量的?OH，可用于腫瘤的CDT作用。除此以外，銅基納米材料還具有良好的光熱轉(zhuǎn)換能力，可將吸收的NIR有效轉(zhuǎn)換為熱能。PTT產(chǎn)生的熱能可促進銅參與的類芬頓反應，進而增強銅介導的CDT作用［40,41］。如，PEGCu2Se在乳腺癌的治療中，可通過介導PTT與CDT的協(xié)同治療，起到比單一的PTT或CDT更佳的抗腫瘤療效［41］。

在本研究中，我們利用Cu2O的光熱轉(zhuǎn)換性能以及類芬頓效應，探討其在胃癌細胞中的抗腫瘤效應。在我們的前期工作里，已對Cu2O納米顆粒進行表征，XPS證明了銅元素的價態(tài)［42］；在體外實驗中，我們證實了Cu2O可在胃癌細胞中產(chǎn)生ROS，而在NIR照射條件下可提高局部溫度，繼而在高條件下可產(chǎn)生更多的ROS。這表明，Cu2O可在胃癌細胞中引起CDT作用。進一步的，Cu2O在NIR照射下，較于無NIR照射條件下，明顯引起了更多胃癌細胞的死亡以及減少了胃癌細胞的遷移，這說明NIR介導的PTT可增加CDT作用。以上結(jié)果均表明Cu2O納米顆粒在胃癌細胞中可通過PTT/CDT協(xié)同作用產(chǎn)生ROS，從而抑制胃癌細胞增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移，并且與PDT或CDT單一治療方式相比，具有更高的抑瘤效果。這提示著Cu2O納米顆粒利用PTT/CDT協(xié)同作用產(chǎn)生ROS是一類新型的增強胃癌藥物療效的潛在治療策略，后續(xù)研究可進一步探討該治療策略的體內(nèi)抗腫瘤作用。然而，本研究仍缺少對于PTT/CDT協(xié)同作用引起胃癌細胞死亡過程中深層機制的探討，這仍需我們進一步探索。

綜上，本研究中，我們制備了Cu2O納米顆粒，其具有良好的光熱轉(zhuǎn)換能力、類芬頓效應，并初步驗證了Cu2O納米顆?？赏ㄟ^PTT/CDT協(xié)同作用在胃癌細胞中產(chǎn)生大量的ROS，從而介導胃癌細胞死亡以及抗胃癌細胞遷移。