LINC01285促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移

朱顯軍，羅喜俊，李 濤，梁俊杰，何嘉琳，唐興奎

廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院普通外科，廣東 廣州 510000

結(jié)直腸癌（CRC）是世界上最常見的消化道惡性腫瘤之一［1］。近年來，我國CRC發(fā)病率和死亡率呈明顯上升趨勢［2-4］。目前，結(jié)直腸癌的治療方式主要有外科治療、術(shù)后輔助治療和轉(zhuǎn)化治療等多種方式，手術(shù)切除仍是治療CRC的主要方式，腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移對患者長期生存有著極大影響［5］，針對失去手術(shù)機(jī)會(huì)的患者，改進(jìn)的化療方案顯示出一定療效［6］，但總的來說并未顯著改善患者的生存預(yù)后。因此，深入了解結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)更多相關(guān)診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物，對于改善結(jié)直腸癌患者的預(yù)后具有重要意義。

近年來，分子靶向治療由于具備特異性高、毒副損傷小等優(yōu)點(diǎn)而備受臨床醫(yī)生和科研工作者的重視［7-9］，lncRNA作為一類新型的生物學(xué)遺傳分子，其長度大于200 bp［10-13］，在調(diào)節(jié)一系列生物學(xué)過程包括基因轉(zhuǎn)錄與翻譯、表觀遺傳修飾、細(xì)胞增殖與分化、細(xì)胞周期與凋亡等過程中發(fā)揮重要作用［14,15］。研究顯示，惡性腫瘤中存在lncRNA 異常表達(dá)，包括HOTAIR、MALAT1、PⅤT1在內(nèi)的大量lncRNA被證實(shí)在腸癌、胃癌及乳腺癌等多種惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中起著促癌或抑癌作用［16-18］。深入研究lncRNA在CRC發(fā)生發(fā)展中的生物學(xué)作用及其分子機(jī)制有助于尋找潛在的腫瘤標(biāo)志物，開發(fā)新型的靶向治療策略［19,20］。

LINC01285 是一個(gè)定位于染色體Xq24，長度為837 bp的lncRNA分子，其在CRC中的功能和作用尚無任何報(bào)道。本研究檢索公共數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)LINC01285在CRC中的表達(dá)量遠(yuǎn)高于癌旁組織，但對于該基因的功能作用相關(guān)研究尚缺乏報(bào)道。本研究擬手機(jī)本中心組織生物樣本庫探索其基礎(chǔ)表達(dá)量、與患者臨床病理參數(shù)及無瘤生存時(shí)間的相關(guān)性，并探究其對CRC細(xì)胞生物學(xué)功能的影響，同時(shí)探討潛在的分子機(jī)制，為CRC預(yù)后判斷及靶向治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 組織標(biāo)本

組織標(biāo)本選自行我院行根治性手術(shù)治療的70例結(jié)腸癌患者，所有患者術(shù)后均經(jīng)病理學(xué)檢查確診，術(shù)前未行放化療等抗腫瘤治療（倫理號：PYRC-2021-113）。

1.2 主要試劑和儀器

逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒（Takara），引物序列（上海生工公司），細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清及Matrigel基質(zhì)膠（Corning），Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑（Invitrogen），LINC01285-siRNA 干擾序列（廣州銳博公司），CCK-8細(xì)胞增殖試劑盒、細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（上海凱基公司），E-cadherin、N-cadherin、Ⅴimentin、GAPDH兔抗人單克隆抗體（CST），熒光定量PCR檢測系統(tǒng)（Roche）、蛋白質(zhì)印跡檢測系統(tǒng)（Bio-rad）、流式細(xì)胞儀（BD）。

1.3 方法

1.3.1 生物信息學(xué)分析 在本實(shí)驗(yàn)中，我們利用Starbase數(shù)據(jù)庫獲取TCGA-COAD 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，同時(shí)將LINC01285在結(jié)直腸癌中的表達(dá)水平進(jìn)行分析。

1.3.2 熒光定量PCR反應(yīng) Trizol法提取總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將總RNA擬轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以cDNA為模板按照SYBR Green I法進(jìn)行靶基因的熒光定量PCR反應(yīng)。采用2-ΔΔCT法表示靶基因的相對表達(dá)水平，以GAPDH作為內(nèi)參。LINC01285引物上游：5'-C CTGGATTTCCTCAGCCTAAA-3'，下 游5'-CATGGG CTTCCAGTTCTCTT-3'；GAPDH 引物上游：5'-CCC TTCATTGACCTCAACTACA-3'，下 游5'-ATGACAA GCTTCCCGTTCTC-3'（江蘇吉瑪公司）。

1.3.3 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 FHC細(xì)胞均使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基、置于37 ℃5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

取處于對數(shù)生長期的CRC細(xì)胞接種于6孔板，密度為5×105/孔。當(dāng)細(xì)胞生長至匯合度70%～80%時(shí)，按照Lipofectamine 3000說明書將siRNA分別轉(zhuǎn)染至CRC細(xì)胞，設(shè)置分組為si-LINC01285-1、si-LINC01285-2和si-Control。

1.3.4 CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 取轉(zhuǎn)染24 h的CRC細(xì)胞接種于96孔板，密度為1000/孔，分別在第1、2、3、4天加入10 μL CCK-8試劑，然后避光培養(yǎng)2 h，酶聯(lián)免疫檢測儀檢測450 nm波長處的吸光度，繪制細(xì)胞生長曲線。

1.3.5 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) 取轉(zhuǎn)染48 h的CRC細(xì)胞，按照凋亡檢測試劑盒的方法進(jìn)行處理，使用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞的早期、晚期及總凋亡率。

1.3.6 Transwell遷移、侵襲實(shí)驗(yàn) 遷移實(shí)驗(yàn)：取轉(zhuǎn)染48 h的CRC 細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按2×105/100 μL 加入至上室，下室加500 μL 含20%FBS 的DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h后取出小室，棉簽拭掉上室內(nèi)側(cè)細(xì)胞，4%多聚甲醛固定細(xì)胞，0.5%結(jié)晶紫溶液染色，顯微鏡下選取5個(gè)視野進(jìn)行拍照、計(jì)數(shù)。侵襲實(shí)驗(yàn)：小室經(jīng)10%Matrigel基質(zhì)膠預(yù)處理，按遷徙實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行侵襲實(shí)驗(yàn)。

1.3.7 蛋白印跡法 取轉(zhuǎn)染48 h的CRC細(xì)胞，RIPA總蛋白裂解液裂解細(xì)胞，提取總蛋白，BCA檢測試劑盒測定總蛋白濃度，總蛋白經(jīng)10%分離膠的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，蛋白分離后轉(zhuǎn)移至PⅤDF膜，5%脫脂牛奶進(jìn)行封閉，E-cadherin（1∶1000）、N-cadherin（1∶1000）、Ⅴimentin（1∶1000）及GAPDH（1∶5000）等一抗孵育過夜，次日孵育二抗，ECL法顯色，采集蛋白條帶圖像后進(jìn)行半定量分析。

1.3.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)均采用IBM SPSS 20.0處理。計(jì)數(shù)資料比較則采用卡方檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析，并用Log-rank檢驗(yàn)比較組間差異。以α=0.05為檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，對以上結(jié)果均進(jìn)行雙側(cè)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 LINC01285高表達(dá)于CRC組織

Starbasev3.0公共數(shù)據(jù)庫獲取TCGA-COAD轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，檢索發(fā)現(xiàn)LINC01285在癌組織中的表達(dá)量明顯高于對照組的癌旁組織（P=0.00016，圖1）；隨機(jī)選取70對CRC組織和癌旁組織，采用熒光定量PCR驗(yàn)證LINC01285的表達(dá)情況，結(jié)果顯示LINC01285在癌組織中的表達(dá)量顯著高于癌旁組織（P=0.0002，圖2），表明LINC01285在人CRC組織中異常高表達(dá)。

圖1 LINC01285在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)水平（TCGA隊(duì)列）Fig.1 Expression of LINC01285 in colorectal cancer tissues(TCGAcohort).

圖2 LINC01285在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)水平（臨床隊(duì)列）Fig.2 Expression of LINC01285 in colorectal cancer tissues(clinical cohort).

2.2 結(jié)直腸癌中LINC01285的表達(dá)量與臨床病理參數(shù)及無瘤生存時(shí)間的關(guān)系

取LINC01285的表達(dá)量中位數(shù)，將CRC患者分為高表達(dá)LINC01285（表達(dá)量大于中位數(shù)）及低表達(dá)LINC01285（表達(dá)量小于中位數(shù)）兩個(gè)患者組別。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析LINC01285的表達(dá)量與CRC患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系，結(jié)果表明LINC01285的表達(dá)量與腫瘤的組織學(xué)分化程度（P=0.036），T分期（P=0.000），淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.001），TNM 分期（P=0.000）以及Duke 分期（P=0.009）顯著相關(guān)，而與年齡（P＞0.05）或性別（P＞0.05）無關(guān)（表1）；生存分析顯示，高表達(dá)LINC01285的患者無瘤生存時(shí)間較低表達(dá)者顯著縮短（P=0.0102，圖3）。

圖3 LINC01285高表達(dá)組和低表達(dá)組術(shù)后無瘤生存時(shí)間的比較Fig.3 Kaplan-Meier relapse-free survival curves of patients with high and low expressions of LINC01285.

表1 LINC01285表達(dá)水平與結(jié)腸癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系Tab.1 Correlation between LINC01285 expression and clinicopathologic parameters of patients with colorectal cancer

2.3 LINC01285低表達(dá)CRC細(xì)胞的構(gòu)建與驗(yàn)證

采用熒光定量PCR檢測5株CRC細(xì)胞和人正常結(jié)直腸粘膜細(xì)胞中的LINC01285 表達(dá)水平，結(jié)果顯示CRC細(xì)胞內(nèi)LINC01285的表達(dá)水均高于人正常結(jié)直腸粘膜細(xì)胞，其中SW620和HT-29細(xì)胞的表達(dá)水平最高（P＜0.001，圖4A）。

采用siRNA干擾技術(shù)敲低SW620和HT-29細(xì)胞內(nèi)LINC01285的表達(dá)量，通過熒光定量PCR驗(yàn)證敲低水平，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染siRNA后SW620和HT-29細(xì)胞中的LINC01285 表達(dá)量明顯下調(diào)（P＜0.001，圖4B），表明LINC01285表達(dá)成功敲減，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖4 LINC01285在人正常結(jié)直腸粘膜細(xì)胞（FHC）、結(jié)直腸癌細(xì)胞（A）及轉(zhuǎn)染siRNA后的結(jié)腸癌細(xì)胞中的表達(dá)情況（B）Fig.4 Expression of LINC01285 in normal epithelial cell lines(FHC),colorectal cancer cells(A)and colorectal cancer cells with siRNAtransfection(B).***P＜0.001 vs si-Control.

2.4 LINC01285對CRC細(xì)胞增殖的影響

采用CCK-8實(shí)驗(yàn)分析LINC01285對CRC細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果表明si-LINC01285-1和si-LINC01285-2組SW620和HT-29細(xì)胞的增殖能力明顯低于si-Control組（P＜0.001，圖5）。

圖5 LINC01285對SW620（A）和HT-29（B）細(xì)胞增殖能力的影響Fig.5 Effect of LINC01285 on cell proliferation in SW620(A)and HT-29(B)cells.***P＜0.001 vs si-control.

2.5 LINC01285對CRC細(xì)胞凋亡的影響

采用流式細(xì)胞儀分析LINC01285對CRC細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果表明si-LINC01285-1和si-LINC01285-2組SW620和HT-29細(xì)胞的早期凋亡率、晚期凋亡率以及總凋亡率均較si-Control組明顯增加（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001，圖6）。

圖6 LINC01285對SW620（A）和HT-29（B）細(xì)胞凋亡比例的影響。Fig.6 Effect of LINC01285 on apoptosis in SW620(A)and HT-29(B)cells.*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001 vs si-control.

2.6 LINC01285對CRC細(xì)胞遷移、侵襲的影響

采用Transwell 法分析LINC01285 對CRC 細(xì)胞遷移、侵襲的影響，結(jié)果表明LINC01285-1 和si-LINC01285-2組SW620和HT-29細(xì)胞的遷移數(shù)量和侵襲數(shù)量均明顯低于si-Control組（P＜0.001，圖7）。

圖7 LINC01285 對SW620（A）和HT-29（B）細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響Fig.7 Effect of LINC01285 on migration and invasion in SW620(A)and HT-29(B)cells(Original magnification:×200).***P＜0.001 vs si-control.

2.7 LINC01285對CRC細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）特性的影響

采用免疫印跡法分析LINC01285對CRC細(xì)胞EMT特性的影響，結(jié)果顯示，LINC01285-1和si-LINC01285-2組SW620和HT-29細(xì)胞與si-Control組相比較，上皮型標(biāo)志物E-Cadherin表達(dá)明顯增加，而間質(zhì)型標(biāo)志物N-Cadherin表達(dá)明顯下降（P＜0.001，圖8）。

圖8 LINC01285對SW620（A和B）和HT-29（C和D）細(xì)胞EMT表型的影響Fig.8 Effect of LINC01285 on EMT phenotype in SW620(A and B)and HT-29(C and D)cells.***P＜0.001 vs si-Control.

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，包括結(jié)直腸癌在內(nèi)的癌癥的腫瘤組織和正常組織中l(wèi)ncRNA表達(dá)量存在顯著性差異，提示其在腫瘤演變過程中起重要作用，有望成為惡性腫瘤診斷、治療及預(yù)后監(jiān)測的生物學(xué)標(biāo)志物［21］。經(jīng)典的CRC腫瘤標(biāo)志物包括癌胚抗原（CEA）和糖類抗原199（CA199），血清CEA和CA199水平有助于判斷CRC療效、監(jiān)測病情發(fā)展以及評估預(yù)后，可以作為術(shù)后隨訪期間參考的生物學(xué)指標(biāo)，但存在特異性不強(qiáng)，靈敏度不高的缺點(diǎn)［22-24］。既往研究發(fā)現(xiàn)，包括結(jié)直腸癌在內(nèi)的癌癥的腫瘤組織和正常組織中l(wèi)ncRNA表達(dá)量存在顯著性差異，提示其在腫瘤演變過程中起重要作用，越來越多新型的lncRNA被作為CRC生物學(xué)診斷指標(biāo)和預(yù)后影響因素［25］。在結(jié)直腸癌中，lncRNA TINCR 被發(fā)現(xiàn)可調(diào)控miR-107/cdd36 信號軸而促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖［26］；lncRNA Ccsc1可促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲［27］。本研究首次證實(shí)LINC01285是CRC潛在的預(yù)后標(biāo)志物，其高表達(dá)于CRC組織，并且與組織低分化、進(jìn)展T分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等惡性特征密切相關(guān)，而LINC01285高表達(dá)的患者較低表達(dá)者明顯縮短，進(jìn)一步提示了LINC01285在疾病進(jìn)展評估和生存預(yù)后判斷方面具有重要指導(dǎo)意義。

惡性腫瘤的共同特征是細(xì)胞生長失控和細(xì)胞凋亡受抑，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞永生化。異常表達(dá)的lncRNA在調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移等惡性特征方面發(fā)揮重要作用［6］。本研究首次從細(xì)胞學(xué)水平探究了LINC01285對CRC細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。功能學(xué)實(shí)驗(yàn)顯示，敲低LINC01285表達(dá)能夠顯著抑制CRC細(xì)胞的增殖特性，并同時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡；另外，敲低LINC01285表達(dá)也能夠抑制CRC遷移和侵襲能力，證實(shí)了LINC01285在CRC轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)過程中起著關(guān)鍵的調(diào)控作用。

EMT是指上皮型細(xì)胞轉(zhuǎn)為間質(zhì)型細(xì)胞的生物學(xué)行為，EMT機(jī)制被認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞在獲得高遷移和侵襲能力的關(guān)鍵過程，在腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。EMT在分子層面通常表現(xiàn)為上皮行標(biāo)志物表達(dá)下調(diào)和間質(zhì)型標(biāo)志物表達(dá)上調(diào)，上皮型細(xì)胞失去極性，細(xì)胞黏附能力下降，遷徙運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展和復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移［28］。眾多研究已表明lncRNA的異常表達(dá)可以促進(jìn)EMT進(jìn)程，從而調(diào)控腫瘤進(jìn)展［29］。本研究顯示，LINC01285表達(dá)敲低后細(xì)胞上皮型蛋白E-Cadherin表達(dá)上調(diào)，間質(zhì)型蛋白N-Cadherin表達(dá)下調(diào)，提示LINC01285可能是通過EMT調(diào)控機(jī)制來增強(qiáng)CRC細(xì)胞的遷移和侵襲能力，并且進(jìn)一步引出猜想：LINC01285可能是有效的防止CRC復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的藥物作用靶點(diǎn)。

綜上所述，本研究表明LINC01285 可以作為CRC 潛在的預(yù)后指標(biāo)。LINC01285 高表達(dá)于CRC，并提示患者的疾病進(jìn)展和不良預(yù)后。LINC01285 可能通過調(diào)節(jié)CRC 增殖、遷移以及侵襲特性而發(fā)揮促癌作用；LINC01285參與調(diào)節(jié)腫瘤EMT進(jìn)程，是其促進(jìn)結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的可能機(jī)制之一。然而，本研究也存在樣本量不足、機(jī)制實(shí)驗(yàn)深度不夠等諸多缺點(diǎn)，LINC01285 究竟通過何種機(jī)制調(diào)控CRC 進(jìn)展，仍有待繼續(xù)深入研究。