自噬與炎癥小體相互作用對(duì)干性年齡相關(guān)性黃斑變性影響的研究進(jìn)展

畢鴻昊，郭惠怡，陳強(qiáng)

年齡相關(guān)性黃斑變性（age-related maculardegeneration，AMD）被認(rèn)為是造成全世界約9%的失明病例的原因[1]，臨床上分為干性AMD 與濕性AMD。干性AMD的早期會(huì)出現(xiàn)玻璃膜疣與脂褐素沉積等病理表現(xiàn)，隨著病情進(jìn)展還會(huì)出現(xiàn)地圖樣萎縮等變化。近年來(lái)關(guān)于AMD 的研究雖然逐漸增多，但是AMD 的發(fā)病機(jī)制尚不明確，現(xiàn)在仍未發(fā)現(xiàn)有效治療AMD 的方法。自噬是真核生物體內(nèi)維持機(jī)體生命活動(dòng)正常進(jìn)行的途徑之一，核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein3，NLRP3）炎癥小體是機(jī)體內(nèi)的促炎物質(zhì)，兩者之間存在相互作用[2]，且都在干性AMD 的發(fā)病中發(fā)揮著重要作用。本文將針對(duì)自噬與NLRP3 炎癥小體的相互作用對(duì)干性AMD 產(chǎn)生的影響進(jìn)行綜述，探討兩者在治療干性AMD 方面的潛在應(yīng)用前景。

1 自噬與干性AMD

1.1 自噬的分子機(jī)制

自噬廣泛存在于真核生物中，是指溶酶體對(duì)細(xì)胞內(nèi)的大分子物質(zhì)以及受損細(xì)胞器進(jìn)行降解的過(guò)程，降解之后的部分代謝產(chǎn)物可被細(xì)胞重新利用，繼續(xù)參與細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)循環(huán)。自噬分為巨自噬、微自噬和分子伴侶介導(dǎo)的自噬。本研究主要介紹的是巨自噬與干性AMD的關(guān)系及其相互作用。

巨自噬的整個(gè)過(guò)程分3 個(gè)階段：起始/成核階段、伸長(zhǎng)和成熟階段、融合和降解階段[3],不同的自噬相關(guān)蛋白（autophagy-related protein，Atg）在不同階段發(fā)揮著重要作用。在營(yíng)養(yǎng)缺乏等條件下，機(jī)體的自噬水平會(huì)迅速升高。自噬的啟動(dòng)需要unc51 樣激酶1（UNC-51-like kinase 1，ULK1）復(fù)合體的參與。ULK1 是一種細(xì)胞質(zhì)激酶，其復(fù)合體組成包括ULK1 以及自噬相關(guān)蛋白Atg13、FIP200（Atg17 同系物）與Atg101[4]。自噬開(kāi)始后首先有分隔膜的形成，ULK1復(fù)合體與III 類(lèi)磷脂酰肌醇-3-激酶復(fù)合物（class III PI3K complex，PI3KC3）共同輔助這個(gè)階段的進(jìn)行。人卷曲螺旋肌球蛋白樣Bcl-2 結(jié)合蛋白（coiled-coil myosin-like Bcl-2-interacting protein，Beclin1）、Atg14、空泡分選蛋白15（vacuolar protein sorting15，VPS 15）、空泡分選蛋白34（vacuolar protein sorting 34，VPS 34）組成了PI3KC3，該物質(zhì)能將磷脂酰肌醇磷酸化成磷脂酰肌醇3 磷酸（phosphatidylinositol 3-phosphate，PI3P），用于成核和形成杯狀雙層膜[5]。分隔膜伸長(zhǎng)階段需Atg5-Atg12-Atg16L-1 復(fù)合物與微管相關(guān)蛋白輕鏈3Ⅰ/Ⅱ-磷脂形成的共軛系統(tǒng)來(lái)發(fā)揮作用[6]，分隔膜延長(zhǎng)后逐漸包裹待降解產(chǎn)物，最終形成擁有雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬體，自噬體與溶酶體結(jié)合形成自噬溶酶體，在溶酶體酶的作用下對(duì)自噬底物進(jìn)行降解。

1.2 自噬在干性AMD中的作用

1.2.1 自噬、氧化應(yīng)激與干性AMD 干性AMD 存在多種病理改變，包括視網(wǎng)膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）變性、玻璃膜疣出現(xiàn)、脂褐素沉積等。自噬對(duì)這些病理改變有調(diào)控作用，在某種程度上可以通過(guò)減弱這些病理改變對(duì)RPE 細(xì)胞的損傷，從而延緩疾病的發(fā)生與發(fā)展。視網(wǎng)膜是眼睛中耗氧量較多的部位，在生命活動(dòng)中會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧（reactive oxygen species，ROS)。一般情況下細(xì)胞內(nèi)存在ROS 的清除體系，抗氧化酶如過(guò)氧化氫酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶[7]等均可維持細(xì)胞內(nèi)ROS 的生成與清除平衡。細(xì)胞出現(xiàn)饑餓等應(yīng)激情況會(huì)造成ROS 的積累，繼而出現(xiàn)損傷。BAEK A 等[8]研究發(fā)現(xiàn)，自噬可防止視網(wǎng)膜受氧化應(yīng)激損傷，而慢性氧化應(yīng)激降低了RPE 細(xì)胞自噬能力，加重細(xì)胞損傷。MITTER SK 等[9]的實(shí)驗(yàn)通過(guò)將ARPE-19 細(xì)胞暴露在H2O2中建立了急性和慢性AMD 模型，經(jīng)過(guò)14 d 的觀察后發(fā)現(xiàn)急性氧化應(yīng)激刺激自噬活性，而慢性氧化應(yīng)激降低自噬活性，可見(jiàn)氧化應(yīng)激對(duì)自噬的影響要根據(jù)其緩急程度來(lái)確定。此外，氧化應(yīng)激能導(dǎo)致脂褐素的形成，脂褐素的主要成分為N-亞視黃基-N-視黃基乙醇胺（N-retinyliden-Nretinylethanolamine，A2E），SAADAT KA 等[10]的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)ARPE-19 細(xì)胞與A2E 一起孵育時(shí)，會(huì)有自噬誘導(dǎo)的發(fā)生。A2E單獨(dú)給藥時(shí)不會(huì)導(dǎo)致RPE 細(xì)胞死亡，A2E與自噬抑制劑共同作用則會(huì)促進(jìn)細(xì)胞死亡，證明了自噬對(duì)RPE 細(xì)胞的保護(hù)作用。總之，在氧化應(yīng)激的過(guò)程中，自噬能通過(guò)抑制ROS的產(chǎn)生減緩干性AMD的發(fā)生。

1.2.2 自噬、炎癥與干性AMD 炎癥在干性AMD 發(fā)病中的作用也不可忽視，炎癥反應(yīng)是指機(jī)體在遭受內(nèi)部或外部刺激后對(duì)細(xì)胞和組織損傷做出的防御性反應(yīng)[11]。在干性AMD中，急性炎癥一般不作為主要致病因素，相對(duì)于急性炎癥來(lái)說(shuō)，慢性炎癥對(duì)RPE 細(xì)胞有更加長(zhǎng)期而持續(xù)的作用。在它的持續(xù)作用下，RPE細(xì)胞逐漸發(fā)生病理改變。玻璃膜疣是干性AMD 的主要特征之一，沉積在RPE 基底膜與Bruch 膜之間，內(nèi)含多種炎性成分，如免疫球蛋白、C 反應(yīng)蛋白、補(bǔ)體成分等。補(bǔ)體作為在免疫和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用的蛋白，被激活后相繼產(chǎn)生C3 轉(zhuǎn)化酶、膜攻擊復(fù)合物（membrane attack complex，MAC）[12]，后者能對(duì)RPE 細(xì)胞產(chǎn)生攻擊，參與RPE 細(xì)胞死亡，這些證據(jù)都表明炎癥在干性AMD 的發(fā)病中占據(jù)重要地位。自噬可以調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，PU Q 等[13]通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，膿毒癥小鼠被敲除自噬基因Atg7 后，自噬功能相較于野生型小鼠受到抑制，且伴有嚴(yán)重的肺損傷和炎癥反應(yīng)的增強(qiáng)，說(shuō)明了自噬能對(duì)炎癥進(jìn)行調(diào)節(jié)。此外，炎癥因子對(duì)自噬也存在影響，WU MX 等[14]用實(shí)驗(yàn)證明了白細(xì)胞介素-33（interleukin-33，IL-33）能逆轉(zhuǎn)db/db 小鼠以及棕櫚酸（palmitic acid，PA）處理的細(xì)胞中出現(xiàn)的自噬損害，且能促進(jìn)自噬。氧化應(yīng)激與炎癥是影響干性AMD 發(fā)病的兩大因素，自噬通過(guò)對(duì)活性氧的清理以及對(duì)炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)在干性AMD的疾病進(jìn)程中發(fā)揮作用。

2 NLRP3炎癥小體與干性AMD

2.1 NLRP3炎癥小體的概述

炎癥小體在炎癥反應(yīng)中起重要作用，NLRP3炎癥小體是由NLRP3 蛋白、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD domain，ASC）以及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1（cysteinyl aspartate specific protease-1，Caspase-1）共同組成的高分子蛋白復(fù)合物[15]。NLRP3 是NLRP3炎癥小體的核心蛋白，包含一個(gè)中心核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域，C 端的亮氨酸重復(fù)序列（leucinerich repeat，LRR）結(jié)構(gòu)域、以及N 端熱蛋白（pyrin domain，PYD）結(jié)構(gòu)域[16]。NLRP3 蛋白含有PYD 結(jié)構(gòu)域，ASC 蛋白含有PYD 結(jié)構(gòu)域和CARD 結(jié)構(gòu)域。NLRP3 蛋白通過(guò)自身的PYD 與ASC 相互作用，然后ASC 的CARD 結(jié)構(gòu)域與前Caspase-1 的CARD 結(jié)構(gòu)域結(jié)合后形成炎癥小體，ASC在整個(gè)過(guò)程中起銜接作用。炎癥小體形成后通過(guò)切割pro-Caspase-1 生成Caspase-1。這種具有成熟酶活性的物質(zhì)，可將白細(xì)胞介素前體pro-IL-1β和pro-IL-18 剪切為促炎因子白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）和IL-18，促進(jìn)炎癥的發(fā)生。炎癥小體的激活有多種途徑，線粒體ROS 的大量生成、細(xì)胞中鉀離子外流造成的低鉀環(huán)境、溶酶體破裂釋放組織蛋白酶B 等[17-18]均能激活NLRP3 炎癥小體。它的激活分為啟動(dòng)和激活2 個(gè)階段。NLRP3 和pro-IL-1β 的轉(zhuǎn)錄、翻譯在啟動(dòng)階段發(fā)揮著重要作用，NLRP3 的去泛素化也與該階段有關(guān)。Toll 樣受體（tolllike receptor，TLR）激活核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear transcription factor-κB，NF-κB）后，NLRP3、pro-IL-1β、pro-IL-18 的表達(dá)也隨之增加，有利于之后的炎癥小體形成。NLRP3易被泛素化，泛素化使NLRP3 活性被抑制[19]。啟動(dòng)信號(hào)出現(xiàn)后，NLRP3在去泛素化酶的作用下去泛素化，重新具備活性并參與炎癥小體的組裝。激活階段有許多刺激源，如細(xì)胞外三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）、尼日利亞菌素[20]、氧化硅、鋁鹽[21]等都是NLRP3 炎癥小體的激活因素，激活后的炎癥小體能促進(jìn)機(jī)體的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致許多疾病的發(fā)生。

2.2 炎癥小體對(duì)干性AMD的影響

研究[22-23]表明，炎癥小體在糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化、阿爾茨海默癥、自身炎癥性疾病以及各種神經(jīng)退行性疾病中均發(fā)揮重要作用，其中NLRP3 在AMD 中表達(dá)顯著上調(diào)[24]。NLRP3炎癥小體屬于多蛋白復(fù)合物[25]，激活后能促進(jìn)促炎因子IL-1β，IL-18 的成熟和分泌，擴(kuò)大炎癥反應(yīng)的影響。炎癥小體一般由免疫細(xì)胞合成[26]，RPE 雖然不是免疫細(xì)胞，但也能產(chǎn)生NLRP3 炎癥小體，參與炎癥反應(yīng)與RPE 變性。研究[27]表明，以NLRP3 炎癥小體或IL-18 為靶點(diǎn)能抑制RPE 變性。目前有實(shí)驗(yàn)證實(shí)了x-連鎖凋亡抑制蛋白（x-linked inhibitor of apoptosis，XIAP）是炎癥小體介導(dǎo)的IL-18 和IL-1β 分泌過(guò)程的負(fù)調(diào)控因子，XIAP 位于Caspase-1 的下游，對(duì)RPE細(xì)胞中細(xì)胞因子的分泌有調(diào)節(jié)作用，炎癥小體的激活可能導(dǎo)致XIAP 的減少[28]，進(jìn)而影響XIAP 對(duì)炎癥過(guò)程和RPE 細(xì)胞分泌細(xì)胞因子過(guò)程的調(diào)節(jié)，在某種程度上造成AMD 的發(fā)病。IL-1β，IL-18的分泌需要NLRP3炎癥小體，但I(xiàn)L-1β相比于IL-18更加嚴(yán)格依賴(lài)NLRP3炎癥小體。BHATTARAI N[29]的實(shí)驗(yàn)研究了氫醌對(duì)人RPE 細(xì)胞中NLRP3 炎癥小體的激活及相關(guān)炎癥因子的分泌，發(fā)現(xiàn)氫醌能夠誘導(dǎo)ARPE-19 細(xì)胞分泌IL-18，而不激活NLRP3 炎癥小體，探明了吸煙過(guò)程中IL-18 的分泌為非NLRP3 依賴(lài)途徑。此外，機(jī)體存在一種病理機(jī)制稱(chēng)為“細(xì)胞焦亡”，是指一種促炎程序性細(xì)胞死亡途徑，該機(jī)制需要NLRP3 炎癥小體的中心酶Caspase-1 的作用[30]，NLRP3 炎癥小體激活后會(huì)活化Caspase-1，介導(dǎo)細(xì)胞的程序性死亡，導(dǎo)致AMD 的發(fā)生。HUANG P 等[31]的實(shí)驗(yàn)探究了E3泛素連接酶31（tripartite motif-containing protein 31，TRIM31）對(duì)ARPE‐19 細(xì)胞的影響，發(fā)現(xiàn)TRIM31 與ARPE‐19細(xì)胞中的NLRP3存在相互作用，能促進(jìn)NLRP3的泛素化，抑制炎癥小體的形成，TRIM31 通過(guò)促進(jìn)該泛素過(guò)程抑制了人RPE 細(xì)胞中的NLRP3 炎癥小體表達(dá)和細(xì)胞焦亡。NLRP3 炎癥小體還能參與他莫昔芬誘導(dǎo)的RPE 細(xì)胞死亡，HWANG N等[32]的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)柳氮磺吡啶能抑制Caspase-1 介導(dǎo)的炎癥，減輕他莫昔芬誘導(dǎo)的RPE 細(xì)胞的死亡，證明NLRP3 炎癥小體作為AMD 的治療靶點(diǎn)是可行的。炎癥作為干性AMD 的致病因素之一，與NLRP3 炎癥小體關(guān)系密切，NLRP3 炎癥小體也因?yàn)樵贏MD中的重要作用，所以具有較好的研究前景。

3 自噬與炎癥小體在干性AMD中的作用

NLRP3炎癥小體作為促進(jìn)炎癥因子分泌的物質(zhì)，與自噬的相互作用過(guò)程對(duì)干性AMD 的發(fā)病有重要影響。干性AMD 屬于退行性疾病，它的發(fā)病與視網(wǎng)膜重要功能部分的退化有關(guān)，主要是由RPE 細(xì)胞、光感受器和脈絡(luò)膜毛細(xì)血管的老化造成[33]。自噬具有維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的作用，自噬出現(xiàn)紊亂會(huì)導(dǎo)致視網(wǎng)膜細(xì)胞死亡，加速AMD 的病理進(jìn)程[34]。RPE 細(xì)胞自噬失敗時(shí)，可能導(dǎo)致脂褐素的聚集和NLRP3 炎癥小體的激活，促進(jìn)視網(wǎng)膜核仁形成和低度慢性炎癥的發(fā)生，促進(jìn)機(jī)體和細(xì)胞衰老[35]。NLRP3炎癥小體與自噬之間的相互作用，首先表現(xiàn)在自噬能去除NLRP3 炎癥小體激活因子，如細(xì)胞內(nèi)源性激活物、NLRP3 炎癥小體成分、細(xì)胞因子等，減輕炎癥小體激活和炎性反應(yīng)[36]，自噬也可以通過(guò)去除有缺陷的線粒體下調(diào)炎癥體的激活[37]，此外，炎癥小體不僅被自噬抑制，也能反過(guò)來(lái)抑制自噬。LPS 誘導(dǎo)的炎癥會(huì)導(dǎo)致NLRP3炎癥小體蛋白增加，這是由于自噬通量受損所致。褪黑素可以通過(guò)恢復(fù)LPS 誘導(dǎo)的自噬通量阻斷，發(fā)揮抗炎作用，證明了自噬與NLRP3 炎癥小體之間的相互作用[38]。研究[39]證明，使用極化的人RPE 細(xì)胞片進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，A2E 會(huì)引起明顯的自噬損害，并同時(shí)上調(diào)自噬的負(fù)性調(diào)節(jié)因子Rubicon。由于A2E是脂褐素的主要成分，證明了脂褐素對(duì)自噬的抑制作用。同時(shí)，脂褐素樣物質(zhì)能使體外培養(yǎng)的RPE 細(xì)胞對(duì)溶酶體的光毒性更敏感，導(dǎo)致NLRP3 炎癥小體活化和炎性細(xì)胞因子的分泌[40]。白藜蘆醇是一種自噬激動(dòng)劑[41]，具有抗氧化與抗炎的作用。白藜蘆醇在眼病的相關(guān)治療中能有效防止細(xì)胞內(nèi)活性氧（intracellular reactive oxygen species，iROS）和炎性標(biāo)志物IL-6、IL-8的產(chǎn)生增加，減少脂褐素表達(dá)[42]，且具有抑制NLRP3炎癥小體激活的作用[43]，表明自噬抑制了脂褐素誘導(dǎo)的NLRP3 炎癥小體的激活?？铝崃岬萚44]在探究駐景丸加減方對(duì)干性AMD 小鼠視網(wǎng)膜的保護(hù)作用時(shí)，發(fā)現(xiàn)駐景丸加減方可激活核因子E2 相關(guān)因子2（nuclear factorerythroid2-related factor2，Nrf2）通路，促進(jìn)自噬，減少代謝廢物在RPE下的沉積。研究[45]證明，雷帕霉素通過(guò)誘導(dǎo)自噬的發(fā)生來(lái)抑制NLRP3 炎癥小體激活，而Nrf2 能部分介導(dǎo)雷帕霉素抑制線粒體活性氧（mitochondrial reactive oxygen species，mtROS）的作用[46]，調(diào)控NLRP3 炎癥小體的激活。故此可以推測(cè)駐景丸發(fā)揮作用的機(jī)制之一是通過(guò)自噬對(duì)NLRP3炎癥小體的抑制作用來(lái)實(shí)現(xiàn)的。至于干性AMD 的病理表現(xiàn)之一玻璃膜疣，其成分中的β-淀粉樣蛋白（amyloidβ，Aβ）也與NLRP3 及自噬有關(guān)。研究[47]表明，Aβ 沉積能促使小膠質(zhì)細(xì)胞活化，激活NLRP3炎癥小體，而NLRP3炎癥小體又能進(jìn)一步促進(jìn)Aβ 沉積，對(duì)細(xì)胞造成損傷。抑制小膠質(zhì)細(xì)胞自噬后能增強(qiáng)NLRP3炎癥小體活化[48]，促進(jìn)自噬能抑制NLRP3炎癥小體的活化，證明了自噬可以通過(guò)抑制炎癥小體減少Aβ 的沉積[49]。從以上分析可知，自噬與NLRP3 炎癥小體都在干性AMD 的疾病進(jìn)程中發(fā)揮著重要作用，且它們兩者之間存在相互影響，這種相互的作用機(jī)制與干性AMD 的發(fā)病有關(guān)。

4 小結(jié)

干性AMD是與NLRP3炎癥小體及自噬關(guān)系密切的黃斑疾病。NLRP3 炎癥小體能促進(jìn)機(jī)體炎癥的發(fā)生，加劇干性AMD 的發(fā)病，而干性AMD 中表現(xiàn)出的玻璃膜疣及脂褐素等病理改變又能進(jìn)一步激活NLRP3 小體，促進(jìn)炎癥因子的分泌。自噬可以通過(guò)抑制NLRP3小體的激活減緩其對(duì)AMD的影響。自噬與NLRP3炎癥小體都對(duì)AMD的發(fā)生發(fā)展意義重大，目前正在探索治療AMD 更為有效的方法，自噬與炎癥小體間的相互作用可能會(huì)為這種探索提供新的治療思路，為干性AMD患者帶來(lái)新的希望。