二甲雙胍對(duì)單側(cè)輸尿管梗阻小鼠腎臟纖維化的影響及其作用機(jī)制

張愛，張君杰，高琳琳，袁亦彤，周華，王艷秋

（1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院第一腎臟內(nèi)科，沈陽(yáng) 110004；2.遼寧電力中心醫(yī)院醫(yī)療服務(wù)保障部，沈陽(yáng) 110002；3.沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院病理科，沈陽(yáng) 110024）

腎纖維化是慢性腎臟?。╟hronic kidney disease，CKD）的共同特征，其機(jī)制復(fù)雜，包括細(xì)胞外基質(zhì)蛋白（纖連蛋白和Ⅰ型膠原）產(chǎn)生及降解不平衡［1］、腎小管上皮細(xì)胞凋亡和萎縮、小管上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化、免疫細(xì)胞浸潤(rùn)和分泌炎癥介質(zhì)［轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）等］多個(gè)環(huán)節(jié)［2］。目前腎纖維化尚無(wú)有效治療方法，因此，探索新的有效干預(yù)靶點(diǎn)預(yù)防和治療腎纖維化尤為重要。

已有研究顯示，二甲雙胍在癌癥和心血管疾?。?］、非酒精性脂肪性肝炎［4］的治療中也發(fā)揮重要作用。在小鼠模型中二甲雙胍可以通過(guò)抑制TGF-β信號(hào)通路緩解葉酸誘導(dǎo)的腎間質(zhì)纖維化［5］。在單側(cè)輸尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction，UUO）小鼠模型中，二甲雙胍也能通過(guò)抑制TGF-β信號(hào)通路減輕腎臟的纖維化［6］。

Hippo/YAP通路不但調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂、增殖、分化和凋亡，還在機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育及調(diào)控器官大小等方面發(fā)揮重要作用。正常機(jī)體內(nèi)，處于活化狀態(tài)的Mst1/2能夠磷酸化并激活其底物L(fēng)ATs1/2，進(jìn)一步磷酸化其下游YAP，導(dǎo)致其無(wú)法入核，喪失轉(zhuǎn)錄輔助因子的功能。生理狀態(tài)下的Hippo/YAP通路能夠負(fù)調(diào)控其下游效應(yīng)分子YAP的轉(zhuǎn)錄活性，以限制組織過(guò)度生長(zhǎng)，從而在維持細(xì)胞增殖和凋亡穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮作用。而在病理狀態(tài)下，YAP發(fā)生去磷酸化并進(jìn)入細(xì)胞核與其下游靶蛋白TEAD結(jié)合，促進(jìn)Hippo/YAP通路下游靶基因的轉(zhuǎn)錄［7］。近年來(lái)Hippo/YAP通路的研究多集中于抗腫瘤領(lǐng)域［8］。近期研究［9］發(fā)現(xiàn)Hippo/YAP信號(hào)通路可能參與心血管疾病的血管重塑，與心血管疾病和腎臟疾病發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系。也有研究［10］提示Hippo/YAP信號(hào)通路可能參與缺血性急性腎損傷并促進(jìn)腎纖維化。本研究探討二甲雙胍對(duì)UUO誘導(dǎo)的小鼠腎臟纖維化的影響及其作用機(jī)制，旨在為腎臟疾病的治療提供新方案。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑

30只5～7月齡C57BL/6小鼠，體質(zhì)量20～25 g，SPF級(jí)，購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司。本研究已獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（2020PS664K）。主要試劑包括二甲雙胍（美國(guó)Sigma公司），p-YAP（AP0489）、LATs1（A17992）、TEAD（武漢愛博泰克公司，A5218），YAP1（武漢賽維爾公司，GB11542），β-actin（武漢亞科因公司，A01011），F(xiàn)4/80（Sc-52664）、TGF-β1（美國(guó)Santa Cruz公司，Sc-1700），CD68（上海碧云天公司，AF6432）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型的制備及分組：小鼠隨機(jī)均分為假手術(shù)組、UUO組、二甲雙胍組，每組10只。采用單側(cè)輸尿管結(jié)扎術(shù)法［11］建立UUO小鼠模型，UUO組、二甲雙胍組小鼠5%異戊巴比妥鈉（50 mg/kg）腹腔注射麻醉，腹部消毒、備皮，取左側(cè)腹部腎區(qū)切口進(jìn)入腹腔，游離左側(cè)輸尿管，在其上1/3處及腎門處以4-0手術(shù)線結(jié)扎。假手術(shù)組小鼠僅分離左側(cè)輸尿管但不結(jié)扎。二甲雙胍組手術(shù)前1 d開始采用二甲雙胍灌胃［200 mg/（kg·d），溶劑為生理鹽水］，連續(xù)7 d。UUO組和假手術(shù)組同時(shí)間給予等量生理鹽水灌胃。然后處死小鼠，膀胱穿刺收集尿樣，心臟穿刺留取血標(biāo)本。生理鹽水灌注腎臟后，留取腎上極并進(jìn)行石蠟固定，剩余腎組織及血、尿標(biāo)本于-80 ℃冰箱儲(chǔ)存。

1.2.2 血尿標(biāo)本檢測(cè)：按試劑說(shuō)明書應(yīng)用比色法檢測(cè)尿N-乙酰-β-D-葡萄糖苷酶（N-acetyl-β-D-glucosidase，NAG），肌氨酸氧化酶法檢測(cè)血肌酐，脲酶法檢測(cè)尿素氮。

1.2.3 HE染色：腎臟組織石蠟切片（厚度4 μm）后HE染色，脫水封片，應(yīng)用正置顯微鏡觀察腎臟組織纖維化程度的變化。

1.2.4 Masson染色：腎臟組織石蠟切片（厚度4 μm），烤片，脫蠟水化，Masson染色封片。顯微鏡（200倍）觀察并拍照。腎間質(zhì)纖維化程度評(píng)分［12］：每張切片觀察20～30個(gè)視野并拍照，采用IPP軟件計(jì)算，纖維化程度評(píng)分=纖維化面積/總面積×100%。

1.2.5 免疫組化染色：腎臟石蠟切片（厚度4 μm），烤片、脫蠟，抗原修復(fù)，加一抗4 ℃過(guò)夜。二抗37 ℃反應(yīng)45 min。DAB顯色劑，脫水，封片。200倍鏡下隨機(jī)選取5張圖像，使用 ImageJ 軟件測(cè)量并計(jì)算平均光密度。

1.2.6 免疫熒光染色：石蠟切片烤片、脫蠟，抗原修復(fù)，BSA封閉，一抗4 ℃過(guò)夜。二抗室溫避光染色1 h。DAPI染核，封片，固定。200倍鏡下隨機(jī)選取5張圖像，使用 ImageJ 軟件測(cè)量并計(jì)算平均光密度。

1.2.7 Western blotting檢測(cè)：提取腎臟組織蛋白，BCA法測(cè)定總蛋白濃度。SDS-PAGE膠制備、上樣、跑膠、轉(zhuǎn)膜、封閉，一抗4 ℃過(guò)夜，二抗37 ℃ 60 min，ECL顯色。應(yīng)用ImageJ采集圖像，以目的蛋白灰度值與內(nèi)參蛋白灰度值比值來(lái)進(jìn)行半定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 3組小鼠尿NAG、血尿素氮和血肌酐水平比較

結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，UUO組尿NAG顯著升高（P＜ 0.05），提示UUO模型建模成功。與UUO組比較，二甲雙胍組尿NAG顯著降低（P＜ 0.05）。血尿素氮和血肌酐3組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＞ 0.05），見表1。

表1 3組小鼠尿NAG、血尿素氮和血肌酐水平比較Tab.1 Comparison of urinary NAG，blood urea nitrogen，and serum creatinine levels among the three groups

2.2 3組小鼠腎臟組織HE和Masson染色比較

HE染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)基本正常，無(wú)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。UUO組腎小管明顯擴(kuò)張，呈不規(guī)則狀，甚至融合成空洞，腎小管刷狀緣完整性被破壞；集合管、遠(yuǎn)曲小管擴(kuò)張呈囊狀甚至消失；腎間質(zhì)有較多炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，纖維組織增生。與UUO組比較，二甲雙胍組腎間質(zhì)病變改善，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少，見圖1。

Masson染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組藍(lán)色膠原沉積少，小管間質(zhì)范圍窄。UUO組大量膠原纖維沉積，間質(zhì)范圍增寬。而二甲雙胍組較UUO組膠原沉積減少。見圖1、表2。

圖1 3組小鼠腎臟病理HE和Masson染色結(jié)果×200Fig.1 HE staining and Masson staining of renal tissue in the three group ×200

2.3 3組免疫組化檢測(cè)及免疫熒光染色結(jié)果比較

免疫組化結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，UUO組TGF-β1、CD68和YAP1表達(dá)顯著增加（均P＜ 0.05）；與UUO組比較，二甲雙胍組TGF-β1、CD68和YAP1表達(dá)均明顯下降（均P＜ 0.05）。見圖2、表2。

圖2 3組TGF-β1、CD68和YAP1表達(dá)比較×200Fig.2 Comparison of TGF-β1，CD68，and YAP1 expression in renal tissues among the three groups using immunohistochemical staining ×200

免疫熒光染色結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，UUO組F4/80表達(dá)明顯增加（P＜ 0.05）；與UUO組比較，二甲雙胍組F4/80表達(dá)顯著降低（P＜ 0.05）。見表2、圖3。

圖3 3組免疫熒光染色結(jié)果×200Fig.3 Immunofluorescence staining of renal tissue among the three group ×200

表2 3組小鼠腎臟組織纖維化及TGF-β1、CD68、YAP1、F4/80表達(dá)比較（%）Tab.2 Comparison of renal fibrosis and the expression of TGF-β1，CD68，YAP1，and F4/80 among the three groups（%）

2.4 3 組Western blotting 檢測(cè)結(jié)果比較

結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，UUO組腎臟組織中YAP1及下游靶蛋白TEAD的表達(dá)水平顯著增加（均P＜ 0.05），p-YAP和YAP1上游負(fù)調(diào)控分子LATs1的表達(dá)水平顯著減少（均P＜ 0.05）。與UUO組比較，二甲雙胍組YAP1及TEAD表達(dá)水平下降，p-YAP、LATs1表達(dá)水平增加（均P＜ 0.05），見圖4。

圖4 3組小鼠腎臟組織中YAP1、p-YAP、LATs1、TEAD蛋白表達(dá)Fig.4 Protein expression of YAP1，p-YAP，LATs1，and TEAD in renal tissues among the three groups

3 討論

研究［13］顯示，正常腎臟組織結(jié)構(gòu)損傷、纖維化的發(fā)生和發(fā)展是導(dǎo)致CKD的主要原因。在纖維化過(guò)程中肌成纖維細(xì)胞和炎癥細(xì)胞被認(rèn)為是關(guān)鍵因素，而TGF-β尤為重要［14］。腎臟含有多種固有免疫細(xì)胞（樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和NK淋巴細(xì)胞等），在維持組織穩(wěn)態(tài)方面起著重要作用，一旦被激活，就會(huì)產(chǎn)生炎癥介質(zhì)，引發(fā)腎臟疾?。?5］。有證據(jù)［16］表明腎組織中巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)參與腎移植轉(zhuǎn)歸、腎間質(zhì)纖維化和腎小管萎縮；而且其浸潤(rùn)水平和腎小球硬化、間質(zhì)纖維化程度密切相關(guān)［17］。

關(guān)于UUO小鼠模型和進(jìn)行性CKD患者的研究［18］顯示，骨髓來(lái)源的單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞能夠轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維細(xì)胞，并通過(guò)巨噬細(xì)胞標(biāo)志物（F4/80、CD68）和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）的共表達(dá)以及膠原蛋白的產(chǎn)生來(lái)鑒定。巨噬細(xì)胞的聚集和分化在腎損傷的各個(gè)階段都至關(guān)重要［19］。巨噬細(xì)胞的過(guò)度積累是誘導(dǎo)腎損傷發(fā)生的重要因素，去除巨噬細(xì)胞可減少腎臟組織中的巨噬細(xì)胞募集及巨噬細(xì)胞來(lái)源的炎性細(xì)胞因子，降低腎臟的炎癥、氧化應(yīng)激反應(yīng)以及腎纖維化過(guò)程，從而減少腎臟組織損傷［20］。

UUO模型是較成熟的研究腎小管間質(zhì)纖維化的模型。本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，UUO組尿NAG水平具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜ 0.05）；而血肌酐、血尿素氮3組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＞ 0.05），考慮可能與小鼠造模時(shí)間短、腎小管間質(zhì)損傷時(shí)間短以及機(jī)體代償有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，與UUO組比較，二甲雙胍組TGF-β1、CD68、F4/80的表達(dá)顯著減少（均P＜ 0.05），推測(cè)二甲雙胍可能通過(guò)抑制單核/巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)來(lái)降低腎臟炎癥反應(yīng)，從而進(jìn)一步抑制腎間質(zhì)纖維化。

Hippo/YAP信號(hào)通路作為一種進(jìn)化保守的通路，在從果蠅到人類的細(xì)胞增殖、凋亡和分化過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。本研究結(jié)果顯示，UUO模型能夠顯著上調(diào)腎組織中YAP、TEAD的表達(dá)，并顯著下調(diào)其上游調(diào)控因子LATs和p-YAP的表達(dá)，而二甲雙胍治療能夠逆轉(zhuǎn)上述變化，提示腎組織中YAP信號(hào)通路的激活可能參與腎纖維化。

本研究結(jié)果顯示，二甲雙胍治療能顯著降低UUO小鼠的腎間質(zhì)纖維化，而腎間質(zhì)纖維化是CKD的共同特征，是進(jìn)展為終末期腎病的病理基礎(chǔ)。因此推測(cè)二甲雙胍可能通過(guò)降低腎間質(zhì)纖維化參與改善CKD的病理過(guò)程。Hippo/YAP信號(hào)通路在UUO模型腎組織中能顯著激活，并能通過(guò)上調(diào)促纖維化因子TGF-β1的表達(dá)水平促進(jìn)腎纖維化過(guò)程，通過(guò)上調(diào)巨噬細(xì)胞抗原CD68、F4/80，激活巨噬細(xì)胞系統(tǒng)和炎癥反應(yīng)，促進(jìn)腎纖維化，進(jìn)而導(dǎo)致腎臟結(jié)構(gòu)和功能異常。

綜上所述，二甲雙胍可能通過(guò)干預(yù)Hippo/YAP信號(hào)通路來(lái)改善UUO模型小鼠的腎臟結(jié)構(gòu)和功能異常。但本研究未獲得二甲雙胍通過(guò)抑制單核/巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)來(lái)降低腎臟炎癥反應(yīng)的直接證據(jù)，因此結(jié)論有待進(jìn)一步研究論證。