MCC950對(duì)心肌梗死大鼠心功能的保護(hù)作用及其機(jī)制

王禹婷，石菲菲，張迪，馬淑梅

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院心功能科，沈陽(yáng) 110004）

心肌梗死（myocardial infarction，MI）是心肌缺氧和心肌細(xì)胞能量衰竭引起的心肌壞死，冠狀動(dòng)脈阻塞引起的長(zhǎng)期心肌缺血會(huì)加重MI。線粒體是真核生物產(chǎn)生能量和活性氧（reactive oxygen species，ROS）的主要場(chǎng)所，參與細(xì)胞凋亡和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，正常線粒體功能對(duì)調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡至關(guān)重要。MI后線粒體因心肌缺氧和再灌注而受損，ROS形成、線粒體分裂/融合平衡破壞、線粒體自噬異常、線粒體膜通透性增加和線粒體超微結(jié)構(gòu)改變都會(huì)引起線粒體功能障礙，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡。因此，改善線粒體功能障礙對(duì)于改善和維持MI后心肌細(xì)胞的正常功能至關(guān)重要。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）炎癥小體在MI的病理生理過(guò)程中起至關(guān)重要的作用，抑制NLRP3炎癥小體可減輕炎癥反應(yīng)并改善MI誘導(dǎo)的心肌功能障礙。研究［1］表明，線粒體功能障礙和ROS產(chǎn)生可激活NLRP3炎癥小體，其激活進(jìn)一步破壞線粒體的結(jié)構(gòu)和功能。因此，靶向抑制NLRP3炎癥小體激活可能是MI的有效治療方案。MCC950是一種NLRP3抑制劑，可改善與NLRP3有關(guān)的多種炎癥疾病。研究［2］表明，MCC950可通過(guò)抑制MI后的早期炎癥反應(yīng)，緩解MI小鼠心肌纖維化并改善心臟功能。MCC950能否通過(guò)改善MI導(dǎo)致的心肌線粒體功能障礙從而改善心功能，有待進(jìn)一步研究。本研究建立大鼠MI模型，探究MCC950在MI導(dǎo)致的心肌損傷和心功能障礙中的保護(hù)作用，及其對(duì)氧化應(yīng)激和線粒體功能的影響，為MCC950在MI治療中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

HE染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）ELISA試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司）；冰凍切片ROS檢測(cè)試劑盒（北京百奧萊博科技有限公司）；RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（上海碧云天生物科技有限公司）；NLRP3、pro-caspase-1、cleaved caspase-1、pro-IL-1β、pro-IL-18、GSDMD-N、Drp1、Fis1、OPA1、Mfn2、PGC-1α、TFAM、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein，ASC）和GAPDH抗體（美國(guó)Abcam公司）；石蠟包埋機(jī)及切片機(jī)、冰凍切片機(jī)（德國(guó)Leica公司）；組織研磨儀（德國(guó)IKA公司）；熒光顯微鏡（日本Olympus公司）；酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio Tek公司）；全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）。

1.2 動(dòng)物分組和大鼠MI模型建立

將30只SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、MI組和MCC950組，每組10只。假手術(shù)組大鼠麻醉后僅打開胸腔后縫合。MI組和MCC950組建立MI模型，大鼠麻醉后打開胸腔，結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支。MCC950組于術(shù)前30 min尾靜脈注射3 mg/kg MCC950。

1.3 超聲心動(dòng)圖檢查大鼠心功能

對(duì)各組大鼠進(jìn)行超聲心動(dòng)圖檢查，記錄大鼠左心室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）、左心室短軸縮短率（left ventricular fractional shortening，LVFS）、左心室收縮末期內(nèi)徑（left ventricular end systolic diameter，LVESD）和左心室舒張末期內(nèi)徑（left ventricular end diastolic diameter，LVEDD）。

1.4 HE染色檢測(cè)大鼠心肌組織病理形態(tài)變化

將大鼠心肌組織在4%多聚甲醛中固定48 h后，蒸餾水清洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋并制成厚4 μm的石蠟切片。切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化及蒸餾水洗滌后，進(jìn)行HE染色。染色后的切片經(jīng)梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。光學(xué)顯微鏡觀察并拍照，放大倍數(shù)為200倍。

1.5 ROS熒光探針檢測(cè)大鼠心肌組織ROS水平

將大鼠心肌組織制成冰凍切片，嚴(yán)格按照冰凍切片ROS檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書操作，檢測(cè)大鼠心肌組織ROS水平。將冰凍切片用DHE探針37℃避光孵育30 min，PBS洗滌，DAPI染色液室溫避光孵育30 min，PBS洗滌，抗熒光淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.6 ELISA檢測(cè)大鼠心肌組織SOD和MDA水平

嚴(yán)格按照檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書操作，檢測(cè)大鼠心肌組織勻漿SOD和MDA水平。將標(biāo)準(zhǔn)品和大鼠心肌組織勻漿樣本加入酶標(biāo)板中，37 ℃孵育1 h，棄液，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗體，37 ℃孵育1 h，棄液，PBST洗板3次，加入生物素標(biāo)記的親和素，37 ℃孵育1 h，棄液，PBST洗板5次，加入TMB底物，37 ℃避光孵育15 min，加入終止液，酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm吸光度值。

1.7 Western blotting檢測(cè)大鼠心肌組織NLRP3炎癥小體相關(guān)蛋白及線粒體分裂、融合和生物發(fā)生相關(guān)蛋白表達(dá)

使用RIPA裂解液提取心肌組織總蛋白，BCA法定量蛋白，將蛋白配置成蛋白樣品，煮樣使其充分變性，將樣品上樣于聚丙烯酰胺凝膠上樣孔中，電泳分離蛋白，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，NLRP3、pro-caspase-1、cleaved caspase-1、pro-IL-1β、pro-IL-18、GSDMD-N、Drp1、Fis1、OPA1、Mfn2、PGC-1α、TFAM和GAPDH一抗4 ℃孵育過(guò)夜，PBST洗膜，二抗室溫孵育1 h，PBST洗膜，ECL化學(xué)發(fā)光，使用ImageJ軟件進(jìn)行灰度分析，并計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.8 免疫熒光染色檢測(cè)大鼠心肌組織ASC斑點(diǎn)形成

將大鼠心肌組織制成冰凍切片，實(shí)驗(yàn)前將切片置于室溫平衡30 min，PBS洗滌3次，2%牛血清蛋白室溫封閉1 h，ASC一抗4 ℃孵育過(guò)夜，PBS洗滌3次，熒光二抗室溫避光孵育1 h，PBS洗滌3次，DAPI染色液室溫孵育30 min，PBS洗滌3次，抗熒光淬滅液封片，熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布，以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Tukey事后檢驗(yàn)。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠心功能指標(biāo)比較

與假手術(shù)組比較，MI組大鼠LVEF和LVFS明顯降低，LVESD和LVEDD明顯升高（P＜ 0.05）；與MI組比較，MCC950組大鼠LVEF和LVFS明顯升高，LVESD和LVEDD明顯降低（P＜ 0.05）。見表1。

表1 各組大鼠心功能指標(biāo)Tab.1 Cardiac function indexes of rats in each group

2.2 各組大鼠心肌組織病理形態(tài)變化

假手術(shù)組大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞均勻分布，輪廓清晰，胞核與胞質(zhì)邊緣分明。MI組大鼠心肌組織細(xì)胞紊亂，部分細(xì)胞可見不清晰及破裂現(xiàn)象，可見大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。MCC950組大鼠心肌組織損傷較MI組損傷減輕，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少。見圖1。

圖1 各組大鼠心肌組織病理形態(tài)表現(xiàn) HE×200Fig.1 Pathomorphology of cardiac muscle tissue from rats in each group HE×200

2.3 各組大鼠心肌組織ROS水平

與假手術(shù)組比較，MI組大鼠心肌組織ROS熒光強(qiáng)度明顯升高（P＜ 0.05）；與MI組比較，MCC950組大鼠心肌組織ROS熒光強(qiáng)度明顯降低（P＜ 0.05）。見圖2。

圖2 各組大鼠心肌組織ROS水平Fig.2 ROS levels in myocardial tissue from rats in each group

2.4 各組大鼠心肌組織氧化應(yīng)激因子水平

與假手術(shù)組比較，MI組大鼠心肌組織MDA含量明顯升高，SOD含量明顯降低（P＜ 0.05）；與MI組比較，MCC950組大鼠心肌組織MDA含量明顯降低，SOD含量明顯升高（P＜ 0.05）。見表2。

表2 各組大鼠氧化應(yīng)激因子水平Tab.2 Levels of oxidative stress factors in rats from each group

2.5 各組大鼠心肌組織NLRP3炎癥小體相關(guān)蛋白表達(dá)

與假手術(shù)組比較，MI組大鼠心肌組織NLRP3、pro-caspase-1、cleaved caspase-1、pro-IL-1β、pro-IL-18和GSDMD-N蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯升高（P＜ 0.05）；與MI組比較，MCC950組大鼠心肌組織NLRP3、procaspase-1、cleaved caspase-1、pro-IL-1β、pro-IL-18和GSDMD-N蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯降低（P＜ 0.05）。見圖3。

圖3 各組大鼠心肌組織NLRP3炎癥小體相關(guān)蛋白表達(dá)檢測(cè)結(jié)果Fig.3 Expression of NLRP3 inflammasome-related proteins in myocardial tissue from rats in each group

2.6 各組大鼠心肌組織ASC斑點(diǎn)形成

與假手術(shù)組比較，MI組大鼠心肌組織ASC斑點(diǎn)形成數(shù)明顯升高（P＜ 0.05）；與MI組比較，MCC950組大鼠心肌組織ASC斑點(diǎn)形成數(shù)明顯降低（P＜ 0.05）。見圖4。

圖4 各組大鼠心肌組織ASC斑點(diǎn)形成檢測(cè)結(jié)果Fig.4 ASC speck formation in myocardial tissue from rats in each group

2.7 各組大鼠心肌組織線粒體分裂、融合和生物發(fā)生相關(guān)蛋白表達(dá)

與假手術(shù)組比較，MI組大鼠心肌組織OPA1、Mfn2、PGC-1α和TFAM蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯降低，Drp1和Fis1蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯升高（P＜ 0.05）；與MI組比較，MCC950組大鼠心肌組織OPA1、Mfn2、PGC-1α和TFAM蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯升高，Drp1和Fis1蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯降低（P＜ 0.05）。見圖5。

圖5 各組大鼠心肌組織線粒體分裂、融合和生物發(fā)生相關(guān)蛋白表達(dá)Fig.5 Expression of proteins related to mitochondrial division，fusion，and biogenesis in myocardial tissue from rats in each group

3 討論

MI是世界上發(fā)病率和死亡率最高的疾病之一，其特征是心肌細(xì)胞丟失和纖維化瘢痕形成，心臟肥大和纖維化在很大程度上導(dǎo)致心室壁增厚和變硬，最終導(dǎo)致心臟功能受損和隨后的心力衰竭。MI期間的無(wú)菌炎癥反應(yīng)在瘢痕形成和受損心肌的重塑中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，早期的炎癥反應(yīng)可能會(huì)增加基質(zhì)降解，導(dǎo)致梗死的心肌組織愈合并形成疤痕，然而炎癥反應(yīng)加重和延長(zhǎng)導(dǎo)致MI后心室重構(gòu)和功能障礙。因此，適度調(diào)節(jié)MI后的炎癥反應(yīng)對(duì)預(yù)防心力衰竭至關(guān)重要。

MCC950是NLRP3的選擇性抑制劑之一，具有緩解疼痛、抗氧化、調(diào)節(jié)自噬和抗衰老等作用。CHENG等［3］的研究表明，將MCC950加載到基質(zhì)金屬蛋白酶9水解微球中可抑制粒細(xì)胞中炎性因子的分泌，改善心功能。本研究發(fā)現(xiàn)，MCC950可改善MI大鼠心功能和心肌組織病理?yè)p傷，提示MCC950對(duì)MI的潛在治療作用。此外，本研究還檢測(cè)了MCC950對(duì)MI大鼠心肌組織NLRP3炎癥小體相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果顯示，MCC950降低MI大鼠心肌組織中NLRP3、pro-caspase-1、cleaved caspase-1、pro-IL-1β、pro-IL-18和GSDMD-N蛋白表達(dá)，并抑制ASC斑點(diǎn)形成。GSDMD是參與細(xì)胞焦亡發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵蛋白，可裂解為GSDMD-N 和GSDMD-C 結(jié)構(gòu)域，GSDMD-N寡聚化并穿透質(zhì)膜以引發(fā)細(xì)胞焦亡，從而誘導(dǎo)心肌損傷［4］。因此，MCC950對(duì)MI大鼠的心臟保護(hù)作用可能與其抑制心肌細(xì)胞焦亡有關(guān)，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

ROS是線粒體呼吸或代謝的副產(chǎn)品，線粒體功能障礙時(shí)會(huì)產(chǎn)生過(guò)多的ROS，并對(duì)線粒體造成不可逆的損害，當(dāng)其釋放超過(guò)內(nèi)源性抗氧化能力時(shí)會(huì)誘發(fā)氧化應(yīng)激，導(dǎo)致細(xì)胞死亡，這是MI發(fā)展的重要因素［5］。本研究發(fā)現(xiàn)，MCC950降低MI大鼠心肌組織ROS水平和MDA含量，并增加SOD含量，提示MCC950抑制MI誘導(dǎo)的心肌氧化應(yīng)激，這可能與其改善線粒體功能障礙有關(guān)。線粒體分裂、融合以及線粒體生物發(fā)生是調(diào)節(jié)線粒體形態(tài)、大小、質(zhì)量、數(shù)量和生物活性的主要控制方法，保護(hù)線粒體免受損傷。Drp1是線粒體分裂的主要介質(zhì)，其通過(guò)與線粒體外膜上的Mff、Fis1、MiD49和MiD51 結(jié)合促進(jìn)線粒體裂變［6-7］。研究發(fā)現(xiàn)，抑制 Drp1 的表達(dá)和活性可以改善心功能，LI等［8］的研究表明，黃芩素可通過(guò)KLF4-MARCH5-Drp1通路上調(diào)心肌細(xì)胞膜相關(guān)的MARCH5表達(dá)，下調(diào)Drp1表達(dá)，從而緩解心肌缺血再灌注損傷。LIU等［9］發(fā)現(xiàn)，注射microRNA-138抑制劑后MI小鼠Drp1表達(dá)下調(diào)，MI面積減小。本研究發(fā)現(xiàn)，MCC950降低MI大鼠心肌組織Drp1和Fis1蛋白表達(dá)，表明MCC950抑制MI導(dǎo)致的線粒體分裂。線粒體融合與分裂一起維持線粒體的正常結(jié)構(gòu)和功能，融合依賴于線粒體跨膜GTP酶，包括介導(dǎo)線粒體外膜融合的Mfn1和Mfn2，以及介導(dǎo)線粒體內(nèi)膜融合的OPA1［10］。OPA1分為具有較高分子量的L-OPA1和具有較低分子量的S-OPA1。再灌注損傷時(shí)，L-OPA1過(guò)度切割導(dǎo)致線粒體內(nèi)膜嵴完整性喪失，細(xì)胞色素C和其他促凋亡因子釋放到細(xì)胞質(zhì)中，并激活細(xì)胞凋亡［11］。OKATAN等［12］發(fā)現(xiàn)，心肌缺血再灌注導(dǎo)致Mfn2表達(dá)大幅下降，從而減少線粒體融合，表明Mfn2的異常表達(dá)與MI后線粒體融合的減少有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，MCC950增加MI大鼠心肌組織OPA1和Mfn2表達(dá)，表明MCC950增加MI大鼠線粒體融合。線粒體生物發(fā)生是指增加線粒體體積以滿足細(xì)胞能量需求的增加，從而補(bǔ)償線粒體的損失［13］。線粒體生物發(fā)生主要受PGC-1α調(diào)節(jié)，它可以激活TFAM等線粒體生物發(fā)生相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子［14］。本研究發(fā)現(xiàn)，MCC950增加MI大鼠心肌組織PGC-1α和TFAM蛋白表達(dá)，表明其增加MI大鼠心肌線粒體生物發(fā)生。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，MCC950降低MI大鼠心肌組織氧化應(yīng)激，促進(jìn)線粒體融合和生物發(fā)生并抑制線粒體分裂，從而改善心肌損傷，保護(hù)心功能，這可能與其抑制NLRP3炎癥小體激活有關(guān)。