魚腥草素鈉對中性粒細胞哮喘小鼠炎性細胞因子和黏蛋白表達的影響

黃晨鳳，李淼

（中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院小兒呼吸內(nèi)科，沈陽 110004）

支氣管哮喘（簡稱哮喘）是一種異質(zhì)性氣道慢性炎癥疾病，影響全球約3.34億人，我國則有2 000余萬人患有哮喘［1-2］。根據(jù)痰液炎癥細胞的不同，哮喘可分為嗜酸性粒細胞哮喘、中性粒細胞哮喘（neutrophilic asthma，NA）、寡粒細胞哮喘和混合性粒細胞哮喘［3］。腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）是哮喘中常見的炎性細胞因子，而黏蛋白5AC（mucin 5 subtype AC，MUC5AC）過度表達被認為是哮喘氣道黏液高分泌的標志，絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（serine/threo-nine protein kinase，AKT）參與以上三者的形成過程。魚腥草為食藥同源中藥，魚腥草素鈉（sodium houttuyfonate，SH）是魚腥草素的化合物，具有抗炎作用［4］。既往研究［5］表明，SH能抑制哮喘氣道高反應(yīng)（airway hyperresponsiveness，AHR）及氣道炎癥。本研究擬探討SH是否通過抑制AKT磷酸化減少炎性細胞因子及黏蛋白表達，從而緩解NA癥狀。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：SPF級Balb/c小鼠40只（購自北京華阜康生物科技股份有限公司），6～8周齡，體質(zhì)量18～20 g。

1.1.2 主要試劑和儀器：卵清蛋白（ovalbumin，OVA）購自美國 Sigma公司；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、SH購自大連美侖生物公司；免疫組織化學試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；RNAiso Plus購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR）試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)股份有限公司；兔抗TNF-α、GAPDH、AKT抗體、鼠抗p-AKT抗體購自美國Proteintech公司，鼠抗IL-1β抗體購自美國Cell Signaling Technology公司，鼠抗MUC5AC抗體購自美國ThermoFisher Scientific公司。壓縮空氣式霧化器（403M，中國魚躍醫(yī)療股份有限公司），qRT-PCR儀購自美國Applied Biosystems公司，多功能酶標儀購自美國BioTek公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組和模型建立：將小鼠隨機分為正常對照（NC）組、NA組、SH組、地塞米松（dexamethasone，DXM）組、聯(lián)合干預（SH+DXM）組，每組8只。建立小鼠NA模型［6］，NC組小鼠鼻腔滴入20 μL生理鹽水，其余組小鼠在實驗第1、7、14天分別鼻腔滴入等量50 μg OVA+15 μg LPS的混合致敏液。實驗第21～27天，對SH（10 mg/kg）組、DXM（2 mg/kg）組、SH+DXM（10 mg/kg+2 mg/kg）組小鼠腹腔注射相應(yīng)劑量的藥物，NA、NC組小鼠腹腔注射等量生理鹽水，1 h后將除NC組以外的其他4組小鼠分批放置于霧化箱中，5% OVA溶液空氣壓縮霧化，30 min/次，1次/d；NC組小鼠用等量生理鹽水霧化，余條件同前。

1.2.2 無創(chuàng)氣道阻力檢測：最后一次霧化激發(fā)48 h內(nèi)，用DSI Buxco無創(chuàng)雙腔檢測系統(tǒng)檢測各組小鼠的特殊氣道阻力（special resistance of airway，sRaw）。

1.2.3 單肺灌洗及細胞計數(shù)：將小鼠麻醉后行單肺灌洗，將回收的支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）離心（1 500 r/min，4 ℃）10 min，棄上清，加入200 μL 4%多聚甲醛重懸，吸取適量BALF滴在血細胞計數(shù)板上，鏡下計數(shù)白細胞總數(shù)；另取適量BALF根據(jù)瑞氏吉姆薩染色液試劑盒要求操作，鏡下分類計數(shù)白細胞。

1.2.4 標本采集：取小鼠右下肺，4%多聚甲醛固定，-80 ℃凍存，用于后續(xù)實驗。

1.2.5 HE、PAS、Masson染色：將固定好的肺組織制成石蠟切片，根據(jù)相應(yīng)試劑盒說明書進行染色，鏡下觀察各組小鼠氣道、氣道周圍、氣道黏膜下的生理病理形態(tài)。

1.2.6 免疫組織化學（immunohistochemistry，IHC）染色：石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，根據(jù)抗體說明書進行抗原修復，內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑滅活30 min，非特異染色阻斷劑封閉30 min，加入MUC5AC抗體（1∶200稀釋）4 ℃過夜，加入二抗孵育20 min，SABC孵育20 min，DAB顯色。

1.2.7 qRT-PCR檢測各組小鼠肺組織中MUC5ACmRNA表達水平：提取小鼠肺組織總RNA，按照試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后行PCR擴增。內(nèi)參照β-actin正向引物序列5’-CTACCTCATGAAGATCCTG ACC-3’，反向引物序列5’-CACAGCTTCTCTTTGATGT CAC-3’；MUC5AC正向引物序列5’-ATCTGTAAGGA AGCCACGCTAA-3’，反向引物序列5’-CTCCTCGTA TGTGACTATCAGG-3’。qRT-PCR反應(yīng)體系：qRT-PCR SuperMix 10 μL，上下游引物各0.4 μL，Dye 0.4 μL，cDNA模 板2.0 μL，RNase-free H2O 6.8 μL，共20 μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 30 s，94 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。用2-ΔΔCt法分析相對表達量。

1.2.8 Western blotting檢測各組小鼠肺組織中TNF-α、IL-1β、p-AKT/AKT蛋白表達量：提取總蛋白，按照BCA試劑盒說明書進行蛋白定量，制備蛋白樣品。經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，經(jīng)一抗（TNF-α、IL-1β抗體稀釋1∶1 000，GAPDH抗體稀釋1∶10 000，p-AKT/AKT抗體稀釋1∶3 000）4 ℃孵育、二抗（稀釋1∶10 000）室溫孵育后，ECL法發(fā)光顯影。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用GraphPad Prism 8.0軟件行統(tǒng)計學分析，符合正態(tài)分布的計量資料多組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用Dunnett’sT3檢驗。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。所有實驗均重復3次以上。

2 結(jié)果

2.1 各組氣道阻力比較

氣道阻力檢測結(jié)果顯示，NA組小鼠的sRaw［（3.11±1.00）cmH2O·s］明顯高于NC組［（0.85±0.06）cmH2O·s］，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.01）；SH組［（1.46±0.12）cmH2O·s］、DXM組［（1.20±0.23）cmH2O·s］、SH+DXM組［（0.89±0.13）cmH2O·s］均低于NA組，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜ 0.05）。

2.2 各組單肺灌洗及細胞計數(shù)比較

BALF白細胞總數(shù)計數(shù)結(jié)果顯示，NA組BALF中白細胞總數(shù)［（352.75±56.96）×104/mL］高于NC組［（19.54±11.52）×104/mL］，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。SH組、DXM組、SH+DXM組小鼠BALF中白細胞總數(shù)分別為（125.42±31.03）×104/mL、（55.96±10.29）×104/mL、（47.13±6.97）×104/mL，均高于NC組，但較NA組均明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；DXM組、SH+DXM組BALF中的白細胞總數(shù)較SH組均減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.01）。

BALF瑞氏吉姆薩染色白細胞分類計數(shù)結(jié)果顯示，NA組、SH組、DXM組的嗜酸性粒細胞數(shù)［（18.50±0.71）×104/mL、（9.42±0.58）×104/mL、（7.83±0.75）×104/mL］均高于NC組［（3.67±0.92）×104/mL］，中性粒細胞數(shù)［（71.08±5.93）×104/mL、（22.79±3.10）×104/mL、（5.79±0.89）×104/mL］亦均高于NC組［（2.17±1.10）×104/mL］，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.01）；SH+DXM組的嗜酸性粒細胞數(shù)［（4.42±0.89）×104/mL］及中性粒細胞數(shù)［（3.71±0.51）×104/mL］與SH組、DXM組的嗜酸性粒細胞數(shù)及中性粒細胞數(shù)較NA組均明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.01）；DXM組、SH+DXM組的嗜酸性粒細胞數(shù)及中性粒細胞數(shù)較SH組均減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.01）。NA組、SH組、DXM組、SH+DXM組的巨噬細胞數(shù)分別為（36.42±11.44）×104/mL、（31.38±11.01）×104/mL、（21.29±4.57）×104/mL、（15.54±3.02）×104/mL，均高于NC組［（7.46±4.26）×104/mL］，淋巴細胞數(shù)分別為（26.58 ±8.04）×104/mL、（30.00±11.84）×104/mL、（17.92±3.59）×104/mL、（16.17±2.06）×104/mL，亦高于NC組［（5.13±3.71）×104/mL］，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.01）。

2.3 各組肺組織和氣道組織染色結(jié)果比較

HE染色顯示，NC組小鼠氣道無炎癥表現(xiàn)，而NA組氣道上皮細胞肥大、管壁增厚、管腔狹窄，肺組織及氣道有明顯的炎癥細胞浸潤，SH組、DXM組、SH+DXM組肺組織及氣道炎癥明顯減輕。PAS染色顯示，NA組小鼠氣道有明顯的黏液高分泌，NC組則幾乎沒有，SH組、DXM組、SH+DXM組分泌明顯減少；Masson染色顯示，NA組小鼠肺組織及氣道黏膜下有明顯的纖維化，NC組幾乎沒有纖維化發(fā)生，SH組、DXM組、SH+DXM組纖維化顯著減少，見圖1。

圖1 各組小鼠肺組織及氣道組織 HE、PAS、Masson 染色 ×200Fig.1 HE，PAS，and Masson staining of lung tissues and airway of mice in each group ×200

2.4 各組小鼠肺組織中黏蛋白和炎性細胞因子表達水平比較

IHC染色顯示，NA組肺組織中MUC5AC的表達（0.076±0.022）明顯高于 NC組（0.011±0.002），SH組（0.025±0.005）、DXM組（0.024±0.008）、SH+DXM組（0.021±0.003）的表達量較 NA組明顯減少，見圖2。

圖2 各組小鼠肺組織及氣道IHC染色 ×200Fig.2 IHC staining of lung tissue and airway of mice in each group ×200

2.5 各組小鼠肺組織中MUC5AC mRNA表達水平比較

qRT-PCR結(jié)果顯示，NA組小鼠肺組織中MUC5ACmRNA表達水平（25.02±13.52）顯著高于NC組（0.85±0.44），差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.01），SH組（12.26±7.03）、DXM組（2.04±1.07）、SH+DXM組（5.17±2.81）均低于NA組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.6 各組小鼠肺組織中炎性細胞因子表達水平比較

Western blotting結(jié)果顯示，NA組小鼠肺組織中TNF-α蛋白相對表達量（1.38±0.17）高于NC組（1.00±0.69），SH組（1.01±0.10）、DXM組（0.85±0.12）、SH+DXM組（0.78±0.19）TNF-α相對表達量則 低于NA組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05）；NA組小鼠肺組織中IL-1β蛋白相對表達量（1.51±0.42）高于NC組（0.96±0.17），SH組（0.90±0.20）、DXM組（0.89±0.22）、SH+DXM組（0.80±0.30）IL-1β相對表達量低于NA組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05），見圖3。

圖3 Western blotting檢測各組小鼠肺組織中TNF-α、IL-1β蛋白表達水平Fig.3 TNF-α and IL-1β protein expression levels in lung tissues of mice in each group detected by Western blotting

Western blotting結(jié)果還顯示，NA組小鼠肺組織中p-AKT表達水平（1.51±0.30）高于NC組（0.75±0.10），SH組（0.99±0.31）、DXM組（0.80±0.28）、SH+DXM組（0.96±0.25）p-AKT表達水平低于NA組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05），見圖4。

圖4 各組小鼠肺組織中 p-AKT/AKT蛋白表達水平Fig.4 p-AKT/AKT protein expression in lung tissues of mice in each group

3 討論

NA是哮喘的表型之一［7］，其特征是多數(shù)中性粒細胞聚集于肺組織和氣道，釋放大量炎癥介質(zhì)（如TNF-α、IL-1β），從而引發(fā)炎癥反應(yīng)［8-9］。本研究發(fā)現(xiàn)，NA組小鼠sRaw、BALF中白細胞總數(shù)及中性粒細胞計數(shù)、肺組織TNF-α及IL-1β蛋白表達量均較NC組增加。研究［10］發(fā)現(xiàn)，MUC5AC在NA中高表達，IL-1β可增加人原代氣道上皮細胞中MUC5AC表達。研究［11］表明，NA氣道上皮細胞中TNF-α、MUC5AC 表達增加。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NA組小鼠肺組織中MUC5ACmRNA及蛋白表達量較NC組增多。本研究結(jié)果還顯示，SH組、DXM組、SH+DXM組小鼠肺組織中MUC5ACmRNA及蛋白表達量較NA組減少，說明SH、DXM及兩者聯(lián)合干預均可降低NA小鼠肺組織中MUC5ACmRNA及蛋白表達水平。

AKT是AGC蛋白家族成員之一，有研究［12］證明NA小鼠模型中AKT磷酸化信號增強。LI等［13］指出，TNF-α可能通過激活AKT磷酸化參與氣道炎癥。MA等［14］證實，車前草苷通過抑制AKT磷酸化降低MUC5AC及IL-1β的表達量。在本研究中，NA組小鼠肺組織中p-AKT/AKT蛋白表達量較NC組增多，SH組小鼠肺組織中p-AKT/AKT蛋白表達量較NA組明顯減少，提示SH可以抑制NA小鼠肺組織中AKT磷酸化。

魚腥草素是魚腥草的主要活性成分。因SH較魚腥草素注射液更安全穩(wěn)定，故臨床上通常使用SH。SH在多種細胞和動物模型中發(fā)揮抗炎作用，可抑制牛和小鼠乳腺上皮細胞中 TNF-α、IL-1β 的表達［15-16］；降低大鼠BALF中TNF-α、IL-1β的水平［17］，可通過抑制p38、JNK和ERK通路的磷酸化來抑制NF-κB活 化。本研究中，SH組、DXM組、SH+DXM組小鼠的sRaw、BALF中白細胞總數(shù)及中性粒細胞計數(shù)、肺組織中TNF-α和IL-1β的蛋白表達量均低于NA組，提示SH、DXM及兩者聯(lián)合干預均可抑制NA小鼠的炎癥。ZHU等［18］的研究結(jié)果表明，魚腥草可抑制肺纖維化p-AKT/AKT的表達。本研究發(fā)現(xiàn)，DXM組、SH+DXM組小鼠肺組織中p-AKT/AKT的蛋白表達量較NA組減少，提示DXM干預、SH聯(lián)合DXM干預均可抑制NA小鼠肺組織中AKT磷酸化。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)SH可通過抑制AKT磷酸化，減少炎性細胞因子及黏蛋白的表達，緩解 NA的炎癥表現(xiàn)，為NA的治療提供了一種新的策略。