基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究補(bǔ)陽還五湯治療心力衰竭的機(jī)制

石志堅(jiān)， 魯文濤， 張軍鵬， 鄭 軼

(鄭州市中醫(yī)院，河南 鄭州 450007)

心力衰竭是各種心臟疾病的終末階段，是心臟結(jié)構(gòu)或功能的異常[1]。在過去的十年中，心血管疾病是全球主要的死亡原因之一，嚴(yán)重威脅著人類的生命和健康[2]。目前全世界約有2 600萬人患有心力衰竭，美國和歐洲的心力衰竭年發(fā)病率超過100萬[3]。中國有超過450萬名心力衰竭患者，35～74歲成年人的患病率為0.9%[4]。由于衰老、高血壓、糖尿病等多種心力衰竭危險(xiǎn)因素和人口老齡化不斷增加，心血管疾病死亡率占中國全因死亡人數(shù)的40%以上，并且這一數(shù)字正在迅速增加[5-6]。近20年來，心力衰竭藥物治療的概念發(fā)生了很大變化，從改善血流動(dòng)力學(xué)的角度到生物學(xué)調(diào)整，各種新的治療方法和優(yōu)化的心力衰竭管理方法不斷被提出。盡管取得了不少進(jìn)展，但目前心力衰竭的患病率和死亡率仍然很高。

補(bǔ)陽還五湯主要由赤芍、桃仁、黃芪、紅花、當(dāng)歸、川芎和地龍組成，具有活血化瘀、補(bǔ)氣通絡(luò)的功效。薈萃分析顯示，相對(duì)于單純西藥治療，補(bǔ)陽還五湯能夠有效改善患者癥狀，提高心臟射血分?jǐn)?shù)[7]。但中藥方劑成分復(fù)雜的因素限制其具體起效機(jī)制及起效成分的揭示。因此，本研究借助轉(zhuǎn)錄組學(xué)與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，對(duì)補(bǔ)陽還五湯干預(yù)心力衰竭的網(wǎng)絡(luò)化機(jī)制進(jìn)行分析，并設(shè)計(jì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證，為后續(xù)研究提供一定依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù) 根據(jù)關(guān)鍵詞“heart failure”在GEO數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索，選擇物種為“Musmusculus”，結(jié)果選取GSE5500數(shù)據(jù)集，從中選取假手術(shù)組大鼠心臟樣本5例，以及主動(dòng)脈縮窄環(huán)植入(TAC)手術(shù)造模的心衰大鼠心臟樣本6例。使用R語言“l(fā)imma”程序包[8]對(duì)芯片信息進(jìn)行矯正并注釋，按照logFC≥1，Pvalue<0.05標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行二次差異分析以獲取明顯差異基因，“clusterProfiler”程序包對(duì)明顯差異基因進(jìn)行基因本體(GO)富集分析與京都基因與基因組百科全書(KEGG)信號(hào)通路富集分析，“ggplot”程序包對(duì)差異分析結(jié)果進(jìn)行可視化操作。

1.2 核心藥物有效成分及靶點(diǎn)獲取 在TCMSP數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行檢索，獲取補(bǔ)陽還五湯藥物的有效成分及靶點(diǎn)，根據(jù)ADME原則以口服生物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選。由于TCMSP網(wǎng)站未收錄“地龍”，故采用文獻(xiàn)檢索法獲取其有效成分及靶點(diǎn)。將靶點(diǎn)全稱輸入到Uniprot網(wǎng)站(https://www.uniprot.org/)，轉(zhuǎn)化為相應(yīng)基因簡(jiǎn)稱。

1.3 疾病-藥物交集靶基因與PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將上述心力衰竭差異基因與補(bǔ)陽還五湯靶基因進(jìn)導(dǎo)入到Draw Venn Diagram網(wǎng)站(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)中繪制韋恩圖，得到疾病-藥物交集靶基因。將交集靶基因?qū)氲絊TRING網(wǎng)站(https://string-db.org/)進(jìn)行蛋白質(zhì)互作(Protein protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)分析，并利用Cytoscape軟件中的cytohub插件獲取度值前10的靶點(diǎn)。

1.4 GO/KEGG富集分析與藥理網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將上述交集基因?qū)氲紻avid數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行GO/KEGG富集分析，根據(jù)富集結(jié)果利用R語言進(jìn)行可視化操作，將其與上述轉(zhuǎn)錄組差異基因富集結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，結(jié)合前期文獻(xiàn)研究結(jié)果，選取apoptosis(細(xì)胞凋亡)信號(hào)通路進(jìn)行驗(yàn)證。將上述信息進(jìn)行匯總，導(dǎo)入到Cytoscape軟件構(gòu)建補(bǔ)陽還五湯治療心力衰竭的藥物-成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1.5.1 試劑與藥物 黃芪、當(dāng)歸尾、赤芍、地龍、川芎、紅花、桃仁購自河南省中醫(yī)院中藥飲片室，經(jīng)鄭州市中醫(yī)院主管中藥師李玉芬鑒定為正品，將上述藥材等比例合并后在100 ℃下煎煮0.5 h，取過濾液，配制成每1 mL含2 g生藥的濃縮液。血清肌酸激酶同工酶CKMB(批號(hào)BS-0649R)、肌鈣蛋白I(cTnI，批號(hào)WO118)、肌紅蛋白(Myo，批號(hào)K12868)、B型腦鈉肽(BNP，批號(hào)D3462)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；caspase-8(批號(hào)2020N2BC1034)、caspase-3(批號(hào)2020N2AW1260)、PARP(批號(hào)2020A1HN1367)蛋白抗體均購自上海中韜生物科技有限公司。

1.5.2 分組與給藥 SPF級(jí)雄性大鼠30只，體質(zhì)量(200±20)g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(京)2020-0011，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、補(bǔ)陽還五湯組，每組10只，給予清潔自來水和標(biāo)準(zhǔn)飼料，自由進(jìn)食飲水，飼養(yǎng)條件為溫度22～24 ℃，相對(duì)濕度50%～60%，12 h/12 h明暗交替。手術(shù)前禁食，模型組和補(bǔ)陽還五湯組大鼠按照TAC法進(jìn)行主動(dòng)脈縮窄環(huán)置入，術(shù)后24 h死亡7只，3組分別存活8、7、8只，其中補(bǔ)陽還五湯組灌胃給予補(bǔ)陽還五湯藥液，按人體表面積計(jì)算給藥量為10 mL/kg，干預(yù)28 d。本研究方案已通過河南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核并批準(zhǔn)(編號(hào)DWLL202103067)，并在實(shí)驗(yàn)過程中嚴(yán)格遵守動(dòng)物倫理學(xué)3R原則。

1.5.3 心功能指標(biāo)檢測(cè) 大鼠末次灌胃給藥12 h后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，檢測(cè)左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)、短軸縮短率(LVFS)、左室舒張末內(nèi)徑(LVIDd)、左室收縮末內(nèi)徑(LVIDs)。

1.5.4 血清生化指標(biāo)檢測(cè) 大鼠內(nèi)眥靜脈叢取血并分離心臟，3 000 r/min離心10 min后取上清，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，采用全自動(dòng)化儀檢測(cè)血清CKMB、cTnI、Myo、BNP水平。

1.5.5 HE染色 甲醛固定大鼠心臟組織，進(jìn)行脫水、包埋、切片、脫蠟等操作，HE染色觀察其病理變化。

1.5.6 Western Blot法檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá) 取適量冷凍的大鼠心臟組織于冰上剪碎，加蛋白裂解液進(jìn)行裂解，離心取上清，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，乙酸纖維素轉(zhuǎn)膜，加入稀釋后的一抗，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，加入HRP標(biāo)記的二抗孵育2 h，TBST洗膜3次，加ECL顯示劑顯色，暗室膠片曝光。采用Image J軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行量化處理，目標(biāo)蛋白表達(dá)量通過β-actin校正。

2 結(jié)果

2.1 基因芯片差異基因 芯片批次矯正結(jié)果見圖1A，中線在同一水平，符合差異分析要求。共獲得心力衰竭差異基因20 700個(gè)，其中明顯差異基因共401個(gè)，包括上調(diào)基因319個(gè)，下調(diào)基因82個(gè)，見圖1B，紅色代表上調(diào)基因，綠色代表下調(diào)基因，黑色為其他差異基因。圖1C縱坐標(biāo)為前50個(gè)差異基因，橫坐標(biāo)代表不同樣本。

2.2 明顯差異基因GO/KEGG富集分析 GO富集分析顯示，心力衰竭病理機(jī)制主要涉及regulation of cell development(細(xì)胞發(fā)育的調(diào)控)、proteasomal protein catabolic process(蛋白酶體蛋白質(zhì)分解代謝過程)等生物過程；cell-cell junction(細(xì)胞-細(xì)胞連接)、neuronal cell body(神經(jīng)元細(xì)胞體)、presynapse(突觸前)等細(xì)胞組分；與GTPase regulator activity(GTP酶調(diào)節(jié)活性)、ATPase activity(ATP酶活性)、transcription coregulator activity(轉(zhuǎn)錄協(xié)同調(diào)節(jié)活性)等分子功能，見圖2。KEGG分析主要富集到MAPK、Ras、PI3K-Akt、神經(jīng)變性疾病等信號(hào)通路，見圖3。

2.3 補(bǔ)陽還五湯與心力衰竭交集靶基因 中藥有效成分分別為赤芍28種，桃仁2種，黃芪20種，紅花22種，當(dāng)歸2種，川芎7種，地龍18種，主要包括ellagic acid(鞣花酸)、paeoniflorin(芍藥苷)、isorhamnetin(異鼠李素)、formononetin(芒柄花素)、calycosin(花萼素)、quercetin(槲皮素)、baicalin(黃芩苷)、luteolin(木犀草素)，靶基因去重后共192個(gè)，交集靶基因共177個(gè)，見圖4。

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)與GO/KEGG分析 靶基因的蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)見圖5，越靠近中心的度值越高，顏色也越偏紅色，其中度值排名前10的為ALB、IL6、caspase-3、MAPK8、MYC、JUN、VEGFA、EGFR、HSP90AA1、ESR1，度值分別為77、74、72、72、68、67、66、66、64、61，見圖6。GO富集分析主要涉及response to steroid hormone(對(duì)類固醇激素的反應(yīng))、response to oxidative stress(對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng))、response to drug(對(duì)藥物的反應(yīng))等生物過程；transcription regulator complex(轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合物)、membrane microdomain(膜微區(qū))、membrane raft(膜筏)等細(xì)胞組分；ubiquitin-like protein ligase binding(泛素-類蛋白連接酶結(jié)合)、RNA polymerase Ⅱ-specific DNA-binding transcription factor binding(RNA聚合酶Ⅱ-特異性DNA-結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合)、DNA-binding transcription factor binding(脫氧核糖核酸-結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合)等分子功能，見圖7。KEGG分析主要涉及l(fā)ipid and atherosclerosis(脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化)、fluid shear stress and atherosclerosis(流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化)、apoptosis(細(xì)胞凋亡)、TNF signaling pathway(腫瘤壞死因子信號(hào)通路)等信號(hào)通路，見圖8。

2.5 細(xì)胞凋亡信號(hào)通路與待驗(yàn)證靶點(diǎn) 細(xì)胞凋亡信號(hào)通路見圖9，紅色節(jié)點(diǎn)為所富集到的靶點(diǎn)，其中caspase-8可上調(diào)caspase-3表達(dá)，進(jìn)而抑制PARP的保護(hù)作用來激活細(xì)胞凋亡進(jìn)程；在KEGG富集結(jié)果中，與心力衰竭發(fā)生較為相關(guān)并具有前期文獻(xiàn)支撐的為細(xì)胞凋亡信號(hào)通路，同時(shí)在HUB基因中caspase-3的度值較高，故本研究選取這3個(gè)主要靶點(diǎn)用于后續(xù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

2.6 補(bǔ)陽還五湯干預(yù)心力衰竭的網(wǎng)絡(luò)機(jī)制 網(wǎng)絡(luò)機(jī)制圖見圖10，相互聯(lián)系的節(jié)點(diǎn)以線連接，其中褐色橢四邊形代表方劑，綠色六邊形代表中藥，黃色六邊形代表有效成分，藍(lán)色圓形代表靶基因，紅色V形代表信號(hào)通路，紫色四邊形代表疾病，可知補(bǔ)陽還五湯從多成分、多靶點(diǎn)、多通路干預(yù)心力衰竭。

2.7 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

2.7.1 補(bǔ)陽還五湯對(duì)大鼠心功能指標(biāo)的影響 3組大鼠基礎(chǔ)體質(zhì)量、體長(zhǎng)等參數(shù)基本一致，造模完成后，模型組、補(bǔ)陽還五湯組大鼠行動(dòng)遲緩，不喜活動(dòng)。末次給藥24 h后，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠LVIDs、LVIDd升高(P<0.05)，LVEF、LVFS降低(P<0.05)；與模型組比較，補(bǔ)陽還五湯組大鼠LVIDs、LVIDd降低(P<0.05)，LVEF、LVFS升高(P<0.05)，見表1。

表1 補(bǔ)陽還五湯對(duì)大鼠心功能指標(biāo)的影響

2.7.2 補(bǔ)陽還五湯對(duì)大鼠血清生化指標(biāo)的影響 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清CKMB、cTnI、Myo、BNP水平升高(P<0.05)；與模型組比較，補(bǔ)陽還五湯組大鼠血清CKMB、cTnI、Myo、BNP水平降低(P<0.05)，見表2。

表2 補(bǔ)陽還五湯對(duì)大鼠血清生化指標(biāo)的影響

2.7.3 補(bǔ)陽還五湯對(duì)大鼠心肌組織病理形態(tài)的影響 假手術(shù)組大鼠可見心肌細(xì)胞排列緊密整齊，結(jié)構(gòu)正常，無炎性浸潤(rùn)和壞死，無間質(zhì)水腫；模型組大鼠可見心肌纖維排列紊亂、呈條索狀改變，心肌細(xì)胞變性、水腫，橫紋消失，部分細(xì)胞核溶解，心肌間質(zhì)明顯水腫、疏松，出現(xiàn)明顯炎性浸潤(rùn)和壞死灶；補(bǔ)陽還五湯組大鼠心肌細(xì)胞排列較為整齊，結(jié)構(gòu)大致正常，心肌細(xì)胞變性、水腫明顯減輕，橫紋有所恢復(fù)，細(xì)胞核完整且大致處于細(xì)胞中央，間質(zhì)水腫明顯減輕，可見部分新生細(xì)胞，見圖11。

2.7.4 補(bǔ)陽還五湯對(duì)大鼠心臟組織caspase-8、caspase-3、PARP蛋白表達(dá)的影響 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心臟組織caspase-8、caspase-3蛋白表達(dá)升高(P<0.05)，PARP蛋白表達(dá)降低(P<0.05)；與模型組比較，補(bǔ)陽還五湯組大鼠心臟組織caspase-8、caspase-3蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，PARP蛋白表達(dá)升高(P<0.05)，見圖12。

3 討論

補(bǔ)陽還五湯是中醫(yī)經(jīng)典方劑，臨床上主要用于中風(fēng)之氣虛血瘀證，而其在心血管疾病方面的治療作用被大大低估。心力衰竭歸屬于中醫(yī)藥學(xué)“心悸、水腫、喘證、痰飲”等范疇[9]?，F(xiàn)代研究表明心力衰竭的發(fā)生除了與冠脈供血不足有關(guān)外，微循環(huán)障礙也是導(dǎo)致心肌重構(gòu)的重要原因[10]。補(bǔ)陽還五湯中黃芪為君藥以補(bǔ)氣利水，伍之赤芍、桃仁、紅花、川芎等藥活血化瘀，另有地龍一藥具備通絡(luò)之功，符合中西醫(yī)心力衰竭發(fā)病之機(jī)。芍藥苷預(yù)處理對(duì)大鼠心肌缺血后再灌注損傷具有保護(hù)作用，減輕心梗后心力衰竭癥狀，其機(jī)制與抑制細(xì)胞凋亡相關(guān)信號(hào)通路的表達(dá)進(jìn)而減少氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡有關(guān)[11]；槲皮素作為一種植物成分，體內(nèi)外和臨床研究均表明其具有心臟保護(hù)作用[12-13]；黃芩苷可改善慢性炎癥、免疫失衡、脂質(zhì)代謝紊亂、細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激[14]。

中藥起效成分與作用機(jī)制復(fù)雜，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為傳統(tǒng)“還原主義”藥物研究策略的補(bǔ)充與完善，對(duì)揭示中藥方劑多成分、多靶點(diǎn)、多通路的多層次作用具有重要意義[15]。通過對(duì)疾病與藥物的交集靶基因進(jìn)行GO/KEGG富集分析，發(fā)現(xiàn)補(bǔ)陽還五湯能夠從多個(gè)細(xì)胞組分、分子功能、生物過程干預(yù)心力衰竭，涉及到多個(gè)信號(hào)通路。氧化應(yīng)激下，細(xì)胞膜和脂蛋白中含有多不飽和脂肪酸(PUFA)的磷脂和膽固醇酯很容易通過自由基誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化(LPO)，形成復(fù)雜的氧化產(chǎn)物，進(jìn)而導(dǎo)致冠脈狹窄及心肌供血供氧不足加劇[16]。TNF、IL6、IL17等促炎細(xì)胞因子合成和分泌的增加是心力衰竭發(fā)展的主要標(biāo)志[17]。腫瘤壞死因子(TNF)-α或Fas配體(FasL)等與其受體結(jié)合以激活caspase-8，可導(dǎo)致線粒體釋放細(xì)胞色素C，從而激活caspase-9，兩者可共同調(diào)節(jié)一系列下游靶點(diǎn)，包括caspase-3、PARP等[18]。同時(shí)，在HUB基因中caspase-3的度值較高，因此，本研究通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)這caspase-8、caspase-3和PARP這3個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證。

由于在預(yù)實(shí)驗(yàn)中采用傳統(tǒng)用藥比例并未取得預(yù)期療效，而“分子配伍”或者“分子處方”這一概念早已有之，即在分子水平，通常從入血成分上去研究中藥有效成分，建立組效關(guān)系，優(yōu)化有效分子配伍處方比例[19-21]，故而初步采用等比例配伍進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)陽還五湯能升高大鼠心臟LVIDd、LVIDs，降低LVEF、LVFS，并改善血清CKMB、cTnI、Myo、BNP水平，表明其對(duì)大鼠心功能改善作用明顯，并能增加心肌供血供氧。通過觀察大鼠心臟組織病理學(xué)，發(fā)現(xiàn)補(bǔ)陽還五湯組心肌細(xì)胞排列較為整齊，結(jié)構(gòu)大致正常，心肌細(xì)胞變性、水腫明顯減輕，橫紋有所恢復(fù)，表明其對(duì)心肌重構(gòu)的改善效果明顯。Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示，補(bǔ)陽還五湯能夠增加caspase-8、caspase-3蛋白表達(dá)，并降低PARP蛋白表達(dá)，表明可能對(duì)細(xì)胞凋亡具有抑制作用。

綜上所述，本研究通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)補(bǔ)陽還五湯可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡等信號(hào)通路，從而發(fā)揮干預(yù)心力衰竭的作用。通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)補(bǔ)陽還五湯可以有效改善大鼠心功能，并調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡信號(hào)通路上的多個(gè)靶蛋白表達(dá)。