黃芪甲苷對慢性間歇性缺氧誘導血管內(nèi)皮功能障礙的保護作用

趙 芳， 王洪新， 魯美麗， 孟 巖

(錦州醫(yī)科大學心腦血管藥物研究重點實驗室，遼寧 錦州 121001)

阻塞性睡眠呼吸暫停是指在睡眠過程中上氣道部分或完全堵塞[1]，導致間歇性缺氧、復氧，這些病理生理改變通過引發(fā)氧化應激、內(nèi)皮功能障礙，進而促進心血管疾病的發(fā)展[2-4]。內(nèi)皮功能障礙的主要特征是一氧化氮(nitric oxide，NO)的生成或生物利用度降低及血管張力改變[5]，內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)是一種組成性表達的酶，調(diào)控著血管系統(tǒng)中NO生成。Calpain-1作為calpain家族中的主要研究對象，是一種Ca2+依賴性半胱氨酸蛋白酶，在內(nèi)皮細胞中表達，其過度激活參與多種疾病的生物過程，并被證明影響NO的生成[6]。研究已表明，抑制calpain可減輕心血管疾病的內(nèi)皮功能障礙[7]。

黃芪甲苷是從黃芪中提取純化的天然小分子化合物，具有抗炎、抗纖維化、抗氧化應激、抗糖尿病等多種藥理活性[8]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷對高糖誘導內(nèi)皮損傷具有保護作用[9]，也有研究報道，其能抑制阻塞性睡眠呼吸暫停導致的心肌損害及炎癥[10-11]，但在血管內(nèi)皮功能方面的研究尚不明確。因此，本實驗主要探討黃芪甲苷對阻塞性睡眠呼吸暫停引起的血管內(nèi)皮功能障礙的影響，并研究其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 試劑與藥物 黃芪甲苷(純度≥98.0%, 批號JZ2018011017，南京景竹生物科技有限公司)。超氧化物陰離子熒光探針(dihydroethidium，DHE)、總超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、總谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)檢測試劑盒(批號S0063、S0101S、S0131S、S0056，上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；calpain-1兔多克隆抗體(批號10538-1-AP，武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)；eNOS兔多克隆抗體、β-actin兔單克隆抗體(批號A1548、AC026，武漢愛博泰克生物科技有限公司)；L-NAME(批號S2877，上海藍木化工有限公司)；蘇木素-伊紅(HE)染料、NO試劑盒(批號D006-1-3、A012-1-2，南京建成生物工程研究所)；腎上腺素(phenylephrine，PE)、乙酰膽堿(acetylcholine，ACh)[批號P1240000、A6625，西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司]。

1.2 動物 健康雄性C57BL/6小鼠40只，10～12周齡，體質(zhì)量(25±5)g，由遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司提供，動物生產(chǎn)許可證號SCXK(遼)2020-0001。

1.3 儀器 ProOx-100型編程式間歇氧濃度實驗系統(tǒng)(上海塔望智能科技有限公司)；DMT720M型離體微血管張力測定儀(丹麥Myotechnology公司)；高速臺式大容量離心機(德國Hermle公司)；電泳系統(tǒng)、半干轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜儀、化學發(fā)光成像儀(美國Bio-Rad公司)；NM-9602G 型酶標分析儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)；DMI3000B型顯微鏡(德國Leica公司)；SIM-F140AY65-PC型制冰機(日本大阪松下電器產(chǎn)業(yè)株式會社)。

1.4 分組及給藥 將小鼠隨機分為空白組、模型組和黃芪甲苷低、高劑量(40、80 mg/kg)組，每組10只，適應飼養(yǎng)3 d后，將模型組和黃芪甲苷各劑量組小鼠放入間歇氧濃度實驗系統(tǒng)動物艙，交替給予90 s低氧(5% O2)及常氧(21% O2)，每天重復8 h，共4周[10]，空白組小鼠置于正常氧濃度的同等條件動物艙中。于造模第1天開始，黃芪甲苷各劑量組小鼠灌胃給予黃芪甲苷(溶于0.5%羧甲基纖維素鈉中)，空白組和模型組小鼠灌胃給予等體積0.5%羧甲基纖維素鈉，連續(xù)4周。

1.5 樣本采集 小鼠使用20%烏拉坦(7 mL/kg)進行麻醉，摘眼球取血，3 600 r/min離心5 min，取血清，保存待測。再取出胸主動脈組織，部分用于HE、DHE染色，部分進行離體血管環(huán)實驗，部分置于-80 ℃冰箱中保存。

1.6 小鼠離體血管環(huán)實驗 將收集的胸主動脈置入提前預冷的PSS營養(yǎng)液[NaCl(130 mmol/L)、KCl(4.7 mmol/L)、KH2PO4(1.18 mmol/L)、MgSO4(1.17 mmol/L)、CaCl2(1.16 mmol/L)、NaHCO3(14.9 mmol/L)、EDTA(0.026 mmol/L)、glucose(11.1 mmol/L)]中，在顯微鏡下去除周圍脂肪及結(jié)締組織，并切割成約2 mm長的血管環(huán)，采用離體微血管張力測定儀測量記錄各血管環(huán)張力變化。在正式實驗前，使用K-PSS(PSS溶液中加入60 mmol/L KCl)激活血管環(huán)，如果2次收縮幅度差小于10%，則認為血管收縮相對穩(wěn)定，可用于后續(xù)實驗。再用1.0×10-5mol/L PE預收縮血管環(huán)，待曲線達到平臺期后加入累積濃度(1.0×10-8、3.0×10-8、1.0×10-7、3.0×10-7、1.0×10-6、3.0×10-6、1.0×10-5mol/L)ACh，繪制劑量依賴曲線。為確定NO對血管舒張的影響，各組血管環(huán)加入eNOS抑制劑L-NAME(100 μmol/L)，并于預收縮前孵育30 min。

1.7 小鼠胸主動脈HE染色 胸主動脈固定于4%多聚甲醛中，24 h后包埋于石蠟中，切片后HE染色，觀察主動脈細胞排列狀態(tài)，測量中膜厚度。

1.8 小鼠胸主動脈ROS水平檢測 DHE染色用于檢測胸主動脈中活性氧(reactive oxygen species，ROS)生成情況。將各組胸主動脈組織進行冰凍切片，厚度為5 μm，然后滴加DHE染色液(5 μmol/L)，在37 ℃下孵育30 min，PBS洗滌3次，每次5 min，再對細胞核進行染色，在熒光顯微鏡下觀察，通過Image J軟件進行分析。

1.9 小鼠血清GSH-Px、SOD活性和MDA、NO水平檢測 采用相應試劑盒，按照說明書步驟分別檢測血清GSH-Px、SOD活性和MDA、NO水平。

1.10 Western blot法檢測小鼠胸主動脈中calpain-1、eNOS蛋白表達 取100 mg胸主動脈組織于1 mL裂解緩沖液(RIPA+1% PMSF)中裂解、均勻化，冰上超聲30 s后，4 ℃、12 000 r/min離心20 min，取上清液用BCA法檢測蛋白濃度，加入適量5×SDS上樣緩沖液，100 ℃煮沸4 min，將樣品置于8%～10% SDS-PAGE膠中，電泳槽中85 V電泳2 h，再置于轉(zhuǎn)膜儀器中使其轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，加入1% BSA，室溫搖床封閉1.5 h，隨后加入calpain-1(1∶1 000)、eNOS(1∶1 000)、β-actin(1∶100 000)一抗，4 ℃孵育過夜，TBST洗滌3次，加入二抗，室溫搖床孵育2 h，最后通過Image J軟件分析各條帶的灰度值。

2 結(jié)果

2.1 黃芪甲苷對慢性間歇性缺氧小鼠胸主動脈形態(tài)學的影響 與空白組比較，模型組小鼠胸主動脈內(nèi)皮細胞及血管平滑肌細胞的排列稍紊亂，中膜厚度增加(P<0.01)；與模型組比較，黃芪甲苷各劑量組小鼠胸主動脈內(nèi)皮細胞及血管平滑肌細胞排列較整齊，中膜厚度降低(P<0.01)，見圖1。

2.2 黃芪甲苷對慢性間歇性缺氧小鼠血管內(nèi)皮依賴性舒張的影響 與空白組比較，模型組小鼠血管內(nèi)皮依賴性舒張功能降低(P<0.01)；與模型組比較，黃芪甲苷各劑量組小鼠血管內(nèi)皮依賴性舒張功能提高(P<0.01)，見圖2。

2.3 eNOS抑制劑對黃芪甲苷保護慢性間歇性缺氧小鼠血管舒張的影響 為了證明黃芪甲苷對慢性間歇性缺氧小鼠的血管舒張的保護機制，各組血管環(huán)中加入eNOS抑制劑(L-NAME)預孵育30 min，結(jié)果如圖3所示，各組小鼠的血管環(huán)對ACh均無舒張作用，表明L-NAME抵消了黃芪甲苷對間歇性缺氧小鼠血管舒張的保護作用，其動脈對ACh的舒張反應呈NO依賴性。

2.4 黃芪甲苷對慢性間歇性缺氧小鼠胸主動脈組織中ROS及血清NO水平的影響 與空白組比較，模型組小鼠胸主動脈組織中ROS水平升高(P<0.01)，血清中NO水平降低(P<0.01)；與模型組比較，黃芪甲苷各劑量組小鼠胸主動脈組織中ROS水平降低(P<0.01)，血清中NO水平升高(P<0.05)，見圖4。

2.5 黃芪甲苷對慢性間歇性缺氧小鼠氧化應激的影響 與空白組比較，模型組小鼠血清中SOD、GSH-Px活性降低(P<0.01)，MDA水平升高(P<0.01)；與模型組比較，黃芪甲苷各劑量組小鼠血清中SOD、GSH-Px活性升高(P<0.01)，MDA水平降低(P<0.01)，見圖5。

2.6 黃芪甲苷對慢性間歇性缺氧小鼠胸主動脈組織中calpain-1、eNOS蛋白表達的影響 與空白組比較，模型組小鼠胸主動脈組織中calpain-1蛋白表達升高(P<0.01)，eNOS蛋白表達降低(P<0.01)；與模型組比較，黃芪甲苷各劑量組小鼠胸主動脈組織中calpain-1蛋白表達降低(P<0.01)，eNOS蛋白表達升高(P<0.01)，見圖6。

3 討論

流行病學數(shù)據(jù)表明阻塞性睡眠呼吸暫停與心血管疾病有關(guān)[12-13]，內(nèi)皮功能障礙、氧化應激在其中發(fā)揮著重要作用[14]。持續(xù)正壓通氣作為阻塞性睡眠呼吸暫?；颊叩囊痪€治療方案，由于依從率低、對心血管事件的預防效果欠佳[15-16]，故而迫切需要新的藥物方法來提高患者的生活質(zhì)量，并對心血管并發(fā)癥進行預防。本實驗結(jié)果表明，經(jīng)過黃芪甲苷治療后，小鼠動脈細胞排列狀態(tài)及中膜厚度改善，說明黃芪甲苷對慢性間歇性缺氧小鼠動脈形態(tài)學改變具有保護作用；小鼠動脈組織ROS水平和血清MDA水平降低，SOD、GSH-Px活性均增加，說明黃芪甲苷能減輕慢性間歇性缺氧小鼠氧化應激；通過離體微血管張力檢測，ACh誘導的血管舒張得到改善，且血清NO水平提升，說明黃芪甲苷改善了慢性間歇性缺氧小鼠內(nèi)皮功能障礙。

calpain-1作為calpain家族的亞型之一，存在于內(nèi)皮細胞中，其過度激活與NO介導的糖尿病、動脈粥樣硬化的內(nèi)皮功能障礙有著密切聯(lián)系[17-19]。eNOS是一種組成性表達的酶，調(diào)控NO的生成，NO通過內(nèi)皮細胞膜，擴散到鄰近的平滑肌細胞中，從而促進血管舒張和血管張力降低[20]。據(jù)報道，eNOS是一種高度敏感的calpain底物，calpain介導后廣泛降解，并抑制NO的產(chǎn)生[6]。因此，本課題組推斷黃芪甲苷可能通過calpain-1/NO改善慢性間歇性缺氧誘導的內(nèi)皮功能障礙。實驗結(jié)果表明，eNOS抑制劑抵消了黃芪甲苷對慢性間歇性缺氧小鼠血管內(nèi)皮依賴性舒張的保護作用,說明黃芪甲苷對慢性間歇性缺氧小鼠血管舒張功能障礙的保護作用是通過NO介導的，通過檢測小鼠動脈組織calpain-1和eNOS蛋白表達，黃芪甲苷能降低慢性間歇性缺氧小鼠calpain-1蛋白表達，并增加eNOS蛋白表達，說明其能通過calpain-1/NO信號通路改善間歇性缺氧誘導的血管內(nèi)皮功能障礙。

綜上所述，黃芪甲苷能改善慢性間歇性缺氧誘導的血管內(nèi)皮功能障礙和氧化應激，可能與calpain-1/NO信號通路有關(guān)，這可為黃芪甲苷治療阻塞性睡眠呼吸暫停提供了新的理論基礎(chǔ)和依據(jù)。