溫清飲HPLC指紋圖譜建立及7種成分同時測定

司徒惠君， 王 誼， 王 宓， 唐銘蔚， 任孟月

(廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

為了推動經(jīng)典名方復(fù)方制劑的穩(wěn)步發(fā)展，建立其質(zhì)量控制評價方法是基礎(chǔ)[1]。溫清飲為《萬病回春》中經(jīng)典名方，是四物湯與黃連解毒湯的合方，由當(dāng)歸、川芎、白芍、熟地、黃連、黃柏、黃芩、梔子8味中藥組成[2]，方中當(dāng)歸養(yǎng)血活血，白芍、熟地養(yǎng)血柔陰，川芎活血行氣，四藥表其“溫”；黃連清熱瀉火，黃芩、黃柏清熱養(yǎng)陰，梔子清火解毒，四藥表其“清”，共奏溫補氣血、清熱解毒之功效，用于治療虛熱血崩[3]，現(xiàn)代臨床也常用于治療痛經(jīng)[4]、銀屑病[5]、痤瘡[6]、接觸性皮炎[7]、慢性濕疹[8-9]、復(fù)發(fā)性口瘡[10]、潰瘍[11]等疾病，療效顯著。

目前，對溫清飲藥理活性、臨床應(yīng)用的研究較為豐富，但尚未涉及成分分析等質(zhì)量控制方面。因此，本實驗建立溫清飲HPLC指紋圖譜，并同時測定沒食子酸、藥根堿、黃芩苷、小檗堿、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素的含量，有助于制定該方質(zhì)量標準，也可為其臨床應(yīng)用及新藥開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 LC-20AS型高效液相色譜儀(日本島津公司)；SK8200H型超聲波清洗器(上海五久自動化設(shè)備有限公司)；SHZ-D(Ⅲ)型循環(huán)水式真空泵(廣州市星爍儀器有限公司)；溶劑過濾器(天津市科億隆實驗設(shè)備有限公司)；BSA224S型電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司]。

1.2 試劑與藥物 沒食子酸(批號B21433，純度98%)、黃芩苷(批號B20570，純度98%)對照品購于上海源葉生物科技有限公司；綠原酸(批號L00701908029，純度99%)、梔子苷(批號Z00311802022，純度99%)、阿魏酸(批號A00211812016，純度98%)、藥根堿(批號Y05211704013，純度98%)、小檗堿(批號B21379，純度99%)、漢黃芩苷(批號H01911808023，純度99%)、黃芩素(批號H01811804026，純度98%)、漢黃芩素(批號H02911809013，純度99%)對照品均購于成都瑞芬思生物科技有限公司。溫清飲中各藥材分別購于康美藥業(yè)股份有限公司、廣東匯群中藥飲片股份有限公司、廣西紫云軒中藥科技有限公司、廣州采芝林藥業(yè)有限公司、廣州至信中藥飲片有限公司，具體信息見表1，經(jīng)廣東藥科大學(xué)劉基柱教授鑒定為正品。乙腈、磷酸、甲醇均為色譜純，購于北京邁瑞達科技有限公司；水為超純水。

表1 樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Agilent Polaris 3 C18-A色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相0.2%磷酸(A)-乙腈(B)，梯度洗脫(0～10 min，5%～20%B；10～30 min，20%B；30～35 min，20%～24%B；35～42 min，24%B；42～50 min，24%～36%B；50～55 min，36%～38%B；55～60 min，38%B；60～62 min，38%～72%B；62～70 min，72%～80%B)；體積流量0.8 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長270 nm；進樣量10 μL。

2.2 全方及溶液制備

2.2.1 全方 取黃連、黃柏、黃芩、梔子、當(dāng)歸、川芎、白芍、熟地黃飲片各3 g，加10倍量水浸泡30 min，武火煮沸后文火微沸60 min，4層100目紗布過濾藥液，擠渣，濾液定容至240 mL，即得，平行制備10批。

2.2.2 供試品溶液 精密量取全方2 mL，甲醇定容至10 mL，超聲處理15 min，在4 ℃下靜置12 h，0.45 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.2.3 對照品溶液 精密稱取沒食子酸、綠原酸、梔子苷、阿魏酸、藥根堿、黃芩苷、小檗堿、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素對照品適量，50%甲醇定容至10 mL量瓶中，即得(質(zhì)量濃度分別為0.525、0.525、1.040、1.070、0.980、1.066、1.134、0.577、1.142、0.504 mg/mL)。

2.3 HPLC指紋圖譜建立

2.3.1 精密度試驗 按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液1份(S1)，在“2.1”項色譜條件下進樣測定6次，以19號峰為參照(S)，測得共有峰相對保留時間、相對峰面積RSD分別為0.01%～0.90%、0.66%～1.58%，表明儀器精密度良好。

2.3.2 重復(fù)性試驗 按“2.2.1”項下方法平行制備6份供試品溶液(S1)，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，以19號峰為參照(S)，測得共有峰相對保留時間、相對峰面積RSD分別為0.01%～1.07%、0.81%～2.98%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗 按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液1份(S1)，于0、2、4、8、12、24 h在“2.1”項色譜條件下進樣測定，以19號峰為參照(S)，測得共有峰相對保留時間、相對峰面積RSD分別為0.01%～0.60%、0.49%～1.99%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.4 圖譜生成及相似度評價 取10批樣品，按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，將相關(guān)數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012A版)”軟件，采用中位數(shù)法，將色譜圖S1設(shè)置為參照，時間窗寬度設(shè)置為0.5，結(jié)果見圖1，可知共有30個共有峰，以19號峰為參照(S)，測得各共有峰相對保留時間、相對峰面積RSD分別為0.01%～0.51%、8.25%～47.69%。再進行相似度評價，結(jié)果見表2，可知均大于0.963，表示各批樣品來源相似度高，質(zhì)量穩(wěn)定。

表2 10批樣品相似度

2.3.5 色譜峰鑒定 取對照品溶液適量，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，與HPLC指紋圖譜共有模式圖進行比對，結(jié)果見圖2。由此可知，1、6、7、14、17、19、20、27～29號色譜峰分別為沒食子酸、綠原酸、梔子苷、阿魏酸、藥根堿、黃芩苷、小檗堿、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素。

2.3.6 共有峰歸屬 取同一批藥材，按“2.2.1”“2.2.2”項下方法分別制備全方及缺黃芩、缺黃連、缺黃柏、缺梔子、缺熟地黃、缺川芎、缺白芍、缺當(dāng)歸的陰性樣品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，結(jié)果見圖3。由此可知，各藥材對共有色譜圖均有貢獻，其中11～12、16、18～19、22～29號峰來自黃芩，2、13～15、17號峰來自黃連，21號峰為黃柏特征峰，7號峰為梔子特征峰，1號峰來自白芍，30號峰來自川芎，5號峰來自當(dāng)歸，3～4號峰來自熟地黃，6號峰為黃柏、梔子共有，8～10、20號峰為黃連、黃柏共有。

2.4 各成分含量測定

2.4.1 全方及溶液制備 同“2.2.1”“2.2.2”項。

2.4.2 色譜條件 同“2.1”項。

2.4.3 線性關(guān)系考察 取對照品溶液適量，50%甲醇制成含沒食子酸11.42 μg/mL、藥根堿41.6 μg/mL、黃芩苷420 μg/mL、小檗堿107.2 μg/mL、漢黃芩苷92.32 μg/mL、黃芩素21 μg/mL、漢黃芩素10.08 μg/mL，逐級稀釋后在“2.1”項色譜條件下進樣測定。以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)進行回歸，結(jié)果見表 3，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表3 各成分線性關(guān)系

2.4.4 精密度試驗 取“2.4.3”項下對照品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定6次，測得沒食子酸、藥根堿、黃芩苷、小檗堿、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素峰面積RSD分別為0.35%、0.60%、0.88%、0.79%、0.68%、1.99%、1.82%，表明儀器精密度良好。

2.4.5 重復(fù)性試驗 按“2.2.1”項下方法平行制備6份供試品溶液(S1)，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，測得沒食子酸、藥根堿、黃芩苷、小檗堿、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素峰面積RSD分別為0.69%、0.90%、1.75%、2.07%、1.80%、1.48%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.6 穩(wěn)定性試驗 按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液1份(S1)，于0、2、4、8、12、24 h在“2.1”項色譜條件下進樣測定，測得沒食子酸、藥根堿、黃芩苷、小檗堿、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素峰面積RSD分別為1.88%、1.48%、1.76%、0.49%、1.86%、1.71%、1.83%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.7 加樣回收率試驗 精密量取各成分含量已知的全方，按高、中、低質(zhì)量濃度(0.8、1.0、1.2倍)分別加入一定量對照品，按2.2.1”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結(jié)果，沒食子酸、藥根堿、黃芩苷、小檗堿、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素平均加樣回收率分別為96.99%、97.94%、97.91%、98.13%、100.17%、98.40%、97.71%，RSD分別為1.72%、1.34%、1.24%、1.77%、1.05%、1.71%、1.85%。

2.4.8 樣品含量測定 按“2.2.1”項下方法制備10批供試品溶液，每批平行3份，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，計算含量，結(jié)果見表4。

表4 各成分含量測定結(jié)果

3 討論

3.1 流動相、檢測波長選擇 本實驗分別考察了甲醇-水、乙腈-水、0.1%磷酸-乙腈、0.1%磷酸-甲醇、0.01 mol/mL磷酸二氫鉀-乙腈，發(fā)現(xiàn)有機相為甲醇時系統(tǒng)壓力明顯升高，而且磷酸二氫鉀鹽會導(dǎo)致色譜峰穩(wěn)定性下降，故選擇0.1%磷酸-乙腈作為流動相，此時基線平穩(wěn)，各成分分離度良好，峰形穩(wěn)定。再考察了230、260、270、290、320 nm波長處色譜信息，發(fā)現(xiàn)在270 nm處各成分色譜峰分離度均較好。

3.2 含量分析 黃芩苷、小檗堿含量最高，其中前者是黃芩主要黃酮類成分，可抗炎[12]、抗菌[13]、抗腫瘤[14-15]、調(diào)節(jié)免疫[16]，而后者是黃連、黃柏中含量最高的生物堿類成分，具有明顯的降血糖[17]、抗腫瘤[18]、抗菌[19]等作用，此外漢黃芩苷含量也較高。雖然不同批次溫清飲中藥材來源較穩(wěn)定，但主要成分含量仍存在一定差異，可能與原料產(chǎn)地、采收時間有關(guān)。

4 結(jié)論

本實驗首次建立溫清飲HPLC指紋圖譜，并同時測定食子酸、藥根堿、黃芩苷、小檗堿、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素的含量，該方法準確可靠，穩(wěn)定性好，可為該方質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)，也為其臨床使用及新藥開發(fā)提供參考。