RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子近端暫停/釋放的動(dòng)態(tài)調(diào)控及生理作用研究進(jìn)展

喬朝輝，陳亮

武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，武漢430072

生物體的發(fā)育過(guò)程中，組織特異性基因在不同細(xì)胞中表達(dá)以建立不同類型的組織與器官，這一過(guò)程需要細(xì)胞對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行精確調(diào)控。基因轉(zhuǎn)錄是基因表達(dá)的第一步，也是細(xì)胞分化和響應(yīng)環(huán)境信號(hào)的關(guān)鍵調(diào)控步驟。真核生物RNA聚合酶Ⅱ（RNA polymerase，RNAPⅡ）從結(jié)合至基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（transcriptional start site，TSS）到轉(zhuǎn)錄結(jié)束經(jīng)歷了轉(zhuǎn)錄起始、轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)下游近端區(qū)域的暫停/釋放、在基因體的連續(xù)前進(jìn)與轉(zhuǎn)錄、離開(kāi)轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)后在下游結(jié)束轉(zhuǎn)錄并脫離基因組DNA等過(guò)程［1-3］。這些不同的轉(zhuǎn)錄過(guò)程涉及不同的調(diào)控機(jī)制，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)轉(zhuǎn)錄的精確調(diào)控。真核生物轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究主要集中在預(yù)轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物（preinitiation complex，PIC）的形成和RNAPⅡ在啟動(dòng)子近端暫停/釋放階段。如果暫停的RNAPⅡ成功進(jìn)入到轉(zhuǎn)錄延伸階段，即有可能產(chǎn)生有功能的全長(zhǎng)mRNA。因此深入了解RNAPⅡ啟動(dòng)子近端暫停/釋放的調(diào)控過(guò)程至關(guān)重要。本文總結(jié)了RNAPⅡ啟動(dòng)子近端暫停/釋放的具體分子調(diào)控過(guò)程，重點(diǎn)綜述了RNAPⅡ啟動(dòng)子近端暫停/釋放對(duì)生物體的發(fā)育調(diào)控及其與其他基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制的偶聯(lián)，并對(duì)RNAPⅡ啟動(dòng)子近端暫停/釋放的研究進(jìn)行了展望，以期為基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控提供新的研究方向。

1 RNAPⅡ啟動(dòng)子近端暫停/釋放的調(diào)控機(jī)制

轉(zhuǎn)錄起始后，RNAPⅡ在轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)和通用轉(zhuǎn)錄因子TFⅡA［RNAPⅡ的轉(zhuǎn)錄因子（transcription factor for RNAPⅡ），單獨(dú)的因子以A、B等加以區(qū)分］、TFⅡB、TFⅡD、TFⅡE、TFⅡF、TFⅡH及轉(zhuǎn)錄中介體復(fù)合物等共同組裝成PIC啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，在新生RNA長(zhǎng)度達(dá)到9～10個(gè)核苷酸后，RNAPⅡ的C末端結(jié)構(gòu)域（C-terminal domain，CTD）Ser5位點(diǎn)發(fā)生磷酸化修飾，RNAPⅡ進(jìn)入啟動(dòng)子下游，并在轉(zhuǎn)錄20～60個(gè)核苷酸后暫停［4］。RNAPⅡ這種暫停狀態(tài)的維持和釋放受到多種RNA聚合酶輔助因子和轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控［2］。

1.1 RNAPⅡ啟動(dòng)子近端暫停的維持

RNAPⅡ啟動(dòng)子近端暫停發(fā)生在TSS下游，受RNAPⅡ活性位點(diǎn)內(nèi)的DNA和RNA序列的影響，并主要通過(guò)負(fù)延伸因子（negative elongation factor，NELF）、DRB敏感性誘導(dǎo)因子（DRB sensitivity inducing factor，DSIF）共同作用來(lái)維持［5］。DSIF由SPT4和SPT5兩個(gè)亞基組成。NELF由4個(gè)亞基（NELF-A、NELF-B、NELF-C或NELF-D）和NELFE）組成。在PIC進(jìn)入TSS下游的暫停區(qū)域后，DSIF首先結(jié)合到PIC上并替代TFⅡB、TFⅡE、TFⅡF和轉(zhuǎn)錄中介體復(fù)合物，并進(jìn)一步募集NELF。結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究表明，結(jié)合在RNAPⅡ上的NELF亞基NELF-A、NELF-E能夠與SPT5直接發(fā)生接觸并使RNAPⅡ中的核酸處于部分易位的狀態(tài)，阻止新的核苷酸結(jié)合［6］。另外，降解NELF并不能釋放RNAPⅡ，而是導(dǎo)致其在下游繼續(xù)暫停并可能提前終止，說(shuō)明NELF對(duì)RNAPⅡ在正確位置暫停的維持發(fā)揮重要作用［7］。NELF和DSIF與RNAPⅡ的結(jié)合穩(wěn)定了暫停的RNAPⅡ構(gòu)象，抑制了TFⅡS和RNAPⅡ相關(guān)因子1復(fù)合物（RNAPⅡassociated factor complex，PAF1C）的結(jié)合，從而阻止了轉(zhuǎn)錄延伸復(fù)合物的組裝。但是NELF和DSIF與RNAPⅡ結(jié)合導(dǎo)致啟動(dòng)子近端暫停的具體機(jī)制尚不完全清楚。

越來(lái)越多的蛋白被發(fā)現(xiàn)在維持RNAPⅡ啟動(dòng)子近端暫停中發(fā)揮作用，如Gdown1蛋白通過(guò)結(jié)合RNAPⅡ阻斷其與TFⅡF的結(jié)合，從而穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄暫停［8］。GAGA因子是序列特異性的DNA結(jié)合因子，能夠?qū)ELF募集至啟動(dòng)子附近促進(jìn)NELF和RNAPⅡ結(jié)合［9］。PAF1C參與啟動(dòng)子近端暫停，但其作用存在爭(zhēng)議。有報(bào)道認(rèn)為，PAF1C通過(guò)抑制超級(jí)延伸復(fù)合物（super elongation complex，SEC）與基因的互作來(lái)加強(qiáng)暫停［10］。但也有研究表明，PAF1C可通過(guò)將P-TEFb引入暫停延伸復(fù)合物來(lái)刺激暫停釋放［11］。TFⅡD也是建立RNAPⅡ啟動(dòng)子近端暫停所必需的，其TAF1和TAF2亞基的耗竭導(dǎo)致RNAPⅡ啟動(dòng)子近端的釋放和轉(zhuǎn)錄重新啟動(dòng)。另外RNAPⅡ與PIC，特別是TFⅡD的相互作用可以導(dǎo)致其暫停，這說(shuō)明NELF和DSIF并非RNAPⅡ啟動(dòng)子近端暫停所必需的［12］。

1.2 RNAPⅡ從啟動(dòng)子近端暫停中釋放的調(diào)控

處于轉(zhuǎn)錄暫停階段的RNAPⅡ在進(jìn)入基因體之前會(huì)發(fā)生一系列分子事件，完成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物到轉(zhuǎn)錄延伸復(fù)合物的轉(zhuǎn)變。參與RNAPⅡ釋放的蛋白主要包括正轉(zhuǎn)錄延伸因子b（positive transcription elongation factor b，P-TEFb）、CDK8-中介體、溴結(jié)構(gòu)域蛋白4（bromodomain-containing protein 4，BRD4）等。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，P-TEFb是由催化亞基細(xì)胞周期依賴性激酶9（cyclin dependent kinase 9，CDK9）和調(diào)節(jié)亞基細(xì)胞周期蛋白T1/2（cyclin T1/2）組成的異源二聚體，主要與7SK核內(nèi)小核糖核蛋白（7SK small nuclear ribonucleoprotein，7SK snRNP）轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合物在啟動(dòng)子近端區(qū)域和增強(qiáng)子處結(jié)合，從而處于非活性狀態(tài)［13］。目前研究已表明存在多種機(jī)制促進(jìn)P-TEFb的釋放及激活，如在應(yīng)激情況下，蛋白磷酸酶PP2B和PP1α信號(hào)通路激活，P-TEFb從7SK snRNP中釋放。激活的PP1α信號(hào)通路與Ⅰ類組蛋白脫乙酰酶HDAC1/2/3（class I histone deacetylase 1/2/3，）共同作用，實(shí)現(xiàn)H3S10ph的去磷酸化，釋放染色質(zhì)結(jié)合的BRD4、BRD4和SEC實(shí)現(xiàn)PTEFb從7SK snRNP中的解離和激活，促進(jìn)RNAPⅡ的釋放［14］。研究表明SR-剪接因子SRSF2和DEAD-box RNA解旋酶DDX21等涉及這個(gè)過(guò)程［15-16］，BRD4也 能 獨(dú) 立 于P-TEFb促 進(jìn) 轉(zhuǎn) 錄 延伸［17］?；钚誀顟B(tài)的P-TEFb能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)RNAPⅡ的CTD結(jié)構(gòu)域Ser2與NELF及DSIF的磷酸化，促進(jìn)RNAPⅡ釋放并進(jìn)入轉(zhuǎn)錄延伸。磷酸化后的NELF解離并允許NTPs加入RNAPⅡ，而DSIF被磷酸化后則對(duì)轉(zhuǎn)錄延伸起促進(jìn)作用。另外RNAPⅡ的CTD結(jié)構(gòu)域Ser2的磷酸化能夠募集其他延伸因子組裝SEC［18］。

RNAPⅡ從啟動(dòng)子近端釋放還有其他多種蛋白的參與。TFⅡS幫助啟動(dòng)子近端RNAPⅡ釋放并使其處于快速響應(yīng)狀態(tài)［19］。TFⅡD也能將P-TEFb募集至SEC，使RNAPⅡ進(jìn)入延伸狀態(tài)［20］。這與TFⅡD維持RNAPⅡ暫停的結(jié)論相反，但其具體機(jī)制有待進(jìn)一步解析。轉(zhuǎn)錄因子MYC也被證明可促進(jìn)RNAPⅡ在啟動(dòng)子近端的釋放［21］。抑制CDK8-中介體增加RNAPⅡ暫停，提示其在啟動(dòng)子近端暫停的調(diào)控中發(fā)揮作用［22］。研究表明中介體通過(guò)與BRD4互作招募P-TEFb［23］。TRIM28之前被認(rèn)為可穩(wěn)定RNAPⅡ在蛋白質(zhì)編碼基因中的停頓，近年來(lái)的研究則發(fā)現(xiàn)其有雙向特性：在非誘導(dǎo)狀態(tài)下抑制轉(zhuǎn)錄，而在轉(zhuǎn)錄激活中起正調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄延伸的作用［24-25］。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證明，NF-κB、CⅡTA和AIRE等轉(zhuǎn)錄因子能夠直接與P-TEFb發(fā)生互作，并被認(rèn)為在P-TEFb募集中發(fā)揮作用［26-28］。啟動(dòng)子近端暫停和眾多調(diào)控蛋白之間的互作正逐漸被了解，但這些因子在RNAPⅡ-DSIF-NELF復(fù)合物中的具體功能仍有待更深入的研究。

2 RNAPⅡ啟動(dòng)子近端暫停/釋放在機(jī)體發(fā)育中的作用

RNAPⅡ啟動(dòng)子近端暫停/釋放在物種間較為保守，細(xì)胞與動(dòng)物模型研究特別是早期以果蠅模型為代表的發(fā)育研究在RNAPⅡ暫停的現(xiàn)象與功能解析方面做出了重要貢獻(xiàn)。RNAPⅡ在啟動(dòng)子下游暫停的現(xiàn)象最初在果蠅HSP70基因中發(fā)現(xiàn)，如TFⅡS、NELF和DSIF等多個(gè)蛋白在RNAPⅡ啟動(dòng)子近端暫停中的作用在果蠅中得到證實(shí)［29］。果蠅胚胎ChIP-chip分析結(jié)果表明，有至少12%的基因在轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)附近出現(xiàn)了RNAPⅡ積累，而在發(fā)育不同階段RNAPⅡ的累積/暫?？赡茉诓煌虻腡SS處呈現(xiàn)動(dòng) 態(tài) 變化［30］。ChIP-seq數(shù)據(jù)顯示，RNAPⅡ被募集至發(fā)育基因的啟動(dòng)子處并處于暫停狀態(tài)以備激活表達(dá)，而成體組織特異性基因的RNAPⅡ暫停程度較小，并且傾向于由含有TATA box的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)［31］。

生物體的發(fā)育過(guò)程需要通過(guò)RNAPⅡ啟動(dòng)子近端暫停使細(xì)胞群體以精確和同步的方式對(duì)細(xì)胞外信號(hào)作出快速反應(yīng)，由此作為組織器官生成的基礎(chǔ)，驅(qū)動(dòng)細(xì)胞類型的多樣化。在果蠅早期胚胎發(fā)育的中囊胚轉(zhuǎn)換（mid-blastula transition，MBT）階段，RNAPⅡ啟動(dòng)子近端暫停介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄同步激活有助于實(shí)現(xiàn)精確的轉(zhuǎn)錄時(shí)空調(diào)控和發(fā)育中復(fù)雜遺傳程序的有序展開(kāi)［32-33］。在特定時(shí)空的發(fā)育信號(hào)激活下，相關(guān)區(qū)域特定基因上暫停的RNAPⅡ隨即進(jìn)入釋放狀態(tài)，實(shí)現(xiàn)同步轉(zhuǎn)錄，如在由DPP激活的背外胚層形成和由Snail激活的中胚層形成過(guò)程中，廣泛存在的RNAPⅡ啟動(dòng)子近端暫停能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)應(yīng)部位基因的快速同步啟動(dòng)，從而實(shí)現(xiàn)背腹側(cè)體軸的形成［30］。而SPT5突變會(huì)導(dǎo)致果蠅體軸發(fā)育缺陷［34］。NELF通過(guò)阻止發(fā)育基因的異常表達(dá)，并可能通過(guò)與其他在胚胎干細(xì)胞維持中起關(guān)鍵作用的轉(zhuǎn)錄抑制蛋白相互作用來(lái)抑制轉(zhuǎn)錄，幫助維持胚胎干細(xì)胞的未分化狀態(tài)。果蠅胚胎發(fā)育早期的NELF缺失導(dǎo)致胚胎轉(zhuǎn)錄激活失敗，并在MBT和原腸胚形成前死亡［35］。研究表明，NELF突變的小鼠胚胎干細(xì)胞對(duì)分化信號(hào)的反應(yīng)減弱［36］，NELF突變的小鼠胚胎也無(wú)法發(fā)育到妊娠中期［37］；同時(shí)機(jī)體可以通過(guò)調(diào)節(jié)NELF蛋白豐度來(lái)控制細(xì)胞分化。NELF的過(guò)表達(dá)嚴(yán)重阻斷造血干細(xì)胞的分化，其缺失則會(huì)導(dǎo)致粒細(xì)胞分化程序的過(guò)早激活［38］。另外研究表明，斑馬魚中SPT5的缺失導(dǎo)致其在發(fā)育第4天死亡［39］，說(shuō)明對(duì)RNAPⅡ啟動(dòng)子近端暫停/釋放的負(fù)調(diào)控而非正調(diào)節(jié)對(duì)于機(jī)體發(fā)育至關(guān)重要。以上結(jié)果表明，RNAPⅡ啟動(dòng)子近端暫停在細(xì)胞命運(yùn)決定乃至機(jī)體發(fā)育中發(fā)揮重要調(diào)控作用。

3 RNAPⅡ啟動(dòng)子近端暫停與其他基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制的偶聯(lián)

3.1 染色質(zhì)可及性和表觀修飾

RNAPⅡ啟動(dòng)子近端暫停影響核小體修飾并調(diào)控染色質(zhì)的可及性。在暫停RNAPⅡ的CTD結(jié)構(gòu)域的Ser5實(shí)現(xiàn)磷酸化修飾之后，SET被募集至RNAPⅡ并完成H3K4 me3修飾，這又會(huì)促進(jìn)H3K9乙?；⑼ㄟ^(guò)SEC的募集來(lái)促進(jìn)轉(zhuǎn)錄延伸［40］。此外組蛋白去乙酰化酶SIRT6可以去除H3K9ac標(biāo)記，穩(wěn)定暫停的RNAPⅡ復(fù)合物，并通過(guò)調(diào)控P-TEFb和SEC組裝降低靶基因表達(dá)［41］。在果蠅細(xì)胞中通過(guò)Trichostatin A對(duì)組蛋白進(jìn)行去乙?；揎椧矔?huì)導(dǎo)致RNAPⅡ啟動(dòng)子近端的釋放［42］。以上結(jié)果說(shuō)明暫停復(fù)合物與其他染色質(zhì)相關(guān)因子及組蛋白修飾之間存在復(fù)雜關(guān)聯(lián)，證明RNAPⅡ啟動(dòng)子近端暫停是一種環(huán)境依賴的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控途徑。

果蠅胚胎發(fā)育過(guò)程中，許多啟動(dòng)子處的核小體結(jié)合較強(qiáng)，隨時(shí)間推移逐漸開(kāi)放并獲得高度停頓的RNAPⅡ，使基因處于易于對(duì)細(xì)胞外的信號(hào)做出反應(yīng)的狀態(tài)［30］。當(dāng)細(xì)胞未收到激活信號(hào)時(shí)，轉(zhuǎn)錄抑制因子通常會(huì)使RNAPⅡ暫停的基因保持沉默。Polycomb蛋白復(fù)合物（polycomb group，PcG）常結(jié)合于發(fā)育控制基因上，以時(shí)空調(diào)控方式對(duì)核小體進(jìn)行H3K27 me3修飾，防止發(fā)育基因錯(cuò)誤表達(dá)。在果蠅發(fā)育中，同時(shí)被暫停的RNAPⅡ占據(jù)和PcG蛋白抑制的基因常處于表達(dá)的動(dòng)態(tài)調(diào)控過(guò)程，激活和抑制之間的動(dòng)態(tài)平衡使基因處于可誘導(dǎo)狀態(tài)。

3.2 RNA剪切和提前終止

啟動(dòng)子近端的轉(zhuǎn)錄提前終止是機(jī)體常見(jiàn)的基因調(diào)控方式。整合因子復(fù)合體（integrator complex）在啟動(dòng)子近端發(fā)生轉(zhuǎn)錄提前終止發(fā)揮重要作用。一方面，整合因子復(fù)合體與NELF和DSIF相互作用，介導(dǎo)啟動(dòng)子下游新生RNA的切割及降解；另一方面，整合因子復(fù)合體通過(guò)招募絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶2A復(fù)合物驅(qū)動(dòng)暫停RNAPⅡ的CTD去磷酸化，從而抵消CDK9活性和相關(guān)暫停釋放［43］。盡管關(guān)于整合因子復(fù)合體介導(dǎo)的啟動(dòng)子近端轉(zhuǎn)錄提前終止的具體機(jī)制尚不明確，但這些發(fā)現(xiàn)表明任何給定基因的轉(zhuǎn)錄都可以通過(guò)相反的激酶和磷酸酶活性進(jìn)行微調(diào)，并分別驅(qū)動(dòng)RNAPⅡ啟動(dòng)子近端釋放或提前終止。

3.3 RNAPⅡ啟動(dòng)子近端暫停與R環(huán)之間的聯(lián)系

RNAPⅡ啟動(dòng)子近端暫停能夠促進(jìn)新生RNA與模板DNA互補(bǔ)配對(duì)形成R環(huán)，而當(dāng)RNAPⅡ的CTD區(qū)域發(fā)生ser2的磷酸化修飾后，RNAPⅡ進(jìn)入延伸狀態(tài)并導(dǎo)致R環(huán)水平下降，此外，易于發(fā)生RNAPⅡ暫停的啟動(dòng)子區(qū)域富含GC，而非編碼鏈上的GC，特別是G富集序列易形成G-四聯(lián)體（Gquadruplex）結(jié)構(gòu)從而進(jìn)一步穩(wěn)定R環(huán)［44］。全基因組研究也證實(shí)，R環(huán)富集于RNAPⅡ暫停且富含GC的TSS區(qū)［45］。另外NELF-B突變介導(dǎo)的RNAPⅡ暫停的衰減可以降低R環(huán)的積累［46］。SRSF2能夠從7SK復(fù)合物中釋放p-TEFb，SRSF2的活性喪失導(dǎo)致暫停釋放受損并進(jìn)一步促進(jìn)R環(huán)的形成［47］。在果蠅組織中R環(huán)富集于TSS區(qū)域，并在衰老過(guò)程中的下調(diào)基因上廣泛富集，而破壞R環(huán)的動(dòng)態(tài)平衡則會(huì)增加神經(jīng)退行性病變的風(fēng)險(xiǎn)［48］。在果蠅胚胎發(fā)育中，PcG能夠通過(guò)誘導(dǎo)HOX基因處R環(huán)的形成來(lái)阻止轉(zhuǎn)錄延伸向下進(jìn)行，從而達(dá)到調(diào)控發(fā)育的目的［49］，暗示RNAPⅡ啟動(dòng)子近端暫停和R環(huán)調(diào)控存在聯(lián)系。以上研究表明，RNAPⅡ啟動(dòng)子近端暫停與其他基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制偶聯(lián)形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，共同調(diào)控基因表達(dá)及發(fā)育過(guò)程。

4 展望

RNAPⅡ啟動(dòng)子近端暫停/釋放是基因表達(dá)調(diào)控的關(guān)鍵步驟，充分了解參與暫停釋放調(diào)控的蛋白因子和調(diào)控機(jī)制十分具有挑戰(zhàn)性。已有研究為RNAPⅡ啟動(dòng)子近端暫停/釋放的分子機(jī)制解析提供了一個(gè)總體框架。新的調(diào)控因子不斷被發(fā)現(xiàn)，各因子調(diào)控基因的特異性以及相互協(xié)作機(jī)制逐漸被研究清楚。但是目前對(duì)RNAPⅡ啟動(dòng)子近端暫停/釋放的研究主要是通過(guò)敲除或過(guò)表達(dá)調(diào)控因子實(shí)現(xiàn)，而特異性靶向RNAPⅡ暫停因子進(jìn)行敲除或過(guò)表達(dá)需要數(shù)小時(shí)至數(shù)天，研究結(jié)果很有可能混淆了該基因敲除/過(guò)表達(dá)后的次級(jí)效應(yīng)。因此使用靶向蛋白快速降解系統(tǒng)研究候選蛋白的調(diào)控作用十分必要。在復(fù)雜的機(jī)體調(diào)控過(guò)程中，RNAPⅡ啟動(dòng)子近端暫停與其他轉(zhuǎn)錄調(diào)控步驟相互依賴，與其他染色質(zhì)相關(guān)因子和組蛋白修飾互作調(diào)控，從而形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，而該網(wǎng)絡(luò)的系統(tǒng)性解析對(duì)研究者提出了更高要求，RNAPⅡ啟動(dòng)子近端暫停與其他基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制的偶聯(lián)也需要進(jìn)一步深入研究。系統(tǒng)解析發(fā)育及其他生物過(guò)程中，R環(huán)與RNAPⅡ的動(dòng)態(tài)偶聯(lián)機(jī)制也將為全面揭示RNAPⅡ啟動(dòng)子近端暫停/釋放的生理意義提供新的研究方向。