CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在絲狀真菌中的應(yīng)用

于鯤，薛佳琪，王進(jìn)寬，余永濤*

1.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，銀川750021；

2.固原市原州區(qū)張易鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)工作站，寧夏 固原756022

絲狀真菌（filamentous fungi）統(tǒng)稱為霉菌，廣泛分布于自然界中，因其種類豐富、來源廣泛、易于工業(yè)化等特點(diǎn)而在多個領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。曲霉屬（Aspergillus）和木霉屬（Trichoderma）等絲狀真菌具有良好的蛋白質(zhì)合成和分泌能力，常被用于各種同源性或異源性蛋白質(zhì)表達(dá)的生產(chǎn)，如利用黑曲霉（Aspergillus niger）通過人工生物合成來生產(chǎn)纖維素酶、菊粉酶［1］；用米曲霉（Aspergillus oryzae）生產(chǎn)人乳鐵蛋白、小牛凝乳素等。部分絲狀真菌還可用于合成有重要生物活性作用的次級代謝產(chǎn)物，如青霉素、洛伐他汀等。在環(huán)境保護(hù)方面，絲狀真菌可用來處理廢水、生產(chǎn)生物燃料、降解低密度聚乙烯［2］等。同時，絲狀真菌與人類的生產(chǎn)生活密切相關(guān)，一些絲狀真菌是人或動植物的病原真菌，如鐮刀菌屬（Fusariumspp.）和曲霉屬部分真菌可引起真菌性角膜炎［3］，煙曲霉（Aspergillus fumigatus）［4］可引起人類真菌性皮膚??；稻 瘟 病 菌（Magnaporthe oryzae）［5］、灰 霉 菌（Botrytis cinerea）［6］等 可 引 起 農(nóng) 作 物 的 真 菌 性病害。

通過研究絲狀真菌生物合成相關(guān)基因的功能，并應(yīng)用生物技術(shù)手段對其進(jìn)行遺傳選育或改造，可以顯著提升絲狀真菌合成生物活性物質(zhì)的能力，從而達(dá)到利用絲狀真菌進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用的目的［7］?；谕粗亟M原理的基因敲除等技術(shù)，如Split-marker、λRed等已廣泛應(yīng)用于絲狀真菌基因功能的研究［8］。但由于同源重組效率低、脫靶率高、需要對大量轉(zhuǎn)化子進(jìn)行篩選、工作量巨大等因素，近年來已逐漸被基因編輯等技術(shù)所替代［9］。近年來，科研人員陸續(xù)開發(fā)了多種用于基因編輯的特異性核酸內(nèi)切酶技術(shù)，如鋅指核酸酶（zinc finger nuclease，ZFN）、類轉(zhuǎn)錄因子樣效應(yīng)核酸 酶（transcription activator-like effector nuclease，TALEN）、CRISPR/Cas9等技術(shù)，與ZFN技術(shù)［10］和TALEN技術(shù)［11］相比，CRISPR/Cas9技術(shù)具有操作簡單、靶向性好、安全性高等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成為絲狀真菌基因編輯的首選技術(shù)。本文綜述了CRISPR/Cas9技術(shù)的起源與基本原理，sgRNA的合成策略，Cas9蛋白、CRISPR/Cas9系統(tǒng)的遞送、實現(xiàn)基因編輯的方式和存在的問題，以期為該技術(shù)在絲狀真菌中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 CRISPR/Cas9技術(shù)的起源與基本原理

1987年日本微生物學(xué)家Ishino等［12］首次在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)了成簇而規(guī)律地間隔短回文重復(fù)序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）。2002年Jansen等［13］發(fā)現(xiàn)了與CRISPR序列相鄰的Cas基因，并且在細(xì)菌（＞40%）以及古細(xì)菌（＞90%）中都存在這一系統(tǒng)，同時證實這一系統(tǒng)與細(xì)菌免疫有關(guān)。隨著研究的深入，該系統(tǒng)的各組成成分及功能逐漸被揭示。2013年該系統(tǒng)首次被應(yīng)用于基因編輯，隨后該系統(tǒng)被廣泛應(yīng)用于植物［14］、動物以及微生物［15］的基因編輯中。2015年Liu等［16］首次將CRISPR/Cas9技術(shù)運(yùn)用于絲狀真菌模式生物—里氏木霉（Trichoderma reesei）中，之后在多種絲狀真菌的基因改造中得到廣泛應(yīng)用。

目前，被廣泛應(yīng)用的Ⅱ型CRISPR/Cas9系統(tǒng)來自于化膿性鏈球菌，該系統(tǒng)主要由兩部分組成：一個組成部分是通過堿基互補(bǔ)配對方式對目的基因編輯區(qū)域進(jìn)行定位的向?qū)NA（small guide RNA，sgRNA）；另一組成部分是通過PAM序列（5'-NGG-3'）與靶向DNA結(jié)合且具有核酸內(nèi)切酶功能的Cas9蛋白。sgRNA引導(dǎo)Cas9蛋白與靶向序列結(jié)合后實現(xiàn)對DNA雙鏈的切割［17］。DNA雙鏈斷裂后，細(xì)胞內(nèi)啟動非同源末端連接或同源重組修復(fù)機(jī)制來重新連接斷裂雙鏈，在此過程中實現(xiàn)基因的敲除或替換。

2 絲狀真菌中sgRNA的表達(dá)策略

sgRNA作為CRISPR/Cas9系統(tǒng)的重要組成部分，其能否正確表達(dá)是基因編輯成功的關(guān)鍵因素，而合適的啟動子才能高效驅(qū)動sgRNA的表達(dá)來實現(xiàn)基因編輯，因此選擇合適的啟動子對sgRNA的表達(dá)至關(guān)重要。gRNA在真核細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)通常分為RNA聚合酶Ⅲ啟動子驅(qū)動和RNA聚合酶Ⅱ啟動子驅(qū)動兩種表達(dá)策略。

2.1 由RNA聚合酶Ⅲ啟動子驅(qū)動sgRNA表達(dá)

sgRNA轉(zhuǎn)錄完成后不需要在5'端和3'端分別添加帽子結(jié)構(gòu)以及polyA尾巴，所以由RNA聚合酶Ⅲ啟動子驅(qū)動gRNA的表達(dá)更為合適。U6 sn-RNA基因在真核生物中高度保守，而U6啟動子作為廣泛存在的組成型啟動子在多種真核生物CRISPR/Cas9系統(tǒng)中被用于驅(qū)動sgRNA的表達(dá)。Arazoe等［18］成功將稻瘟病菌的內(nèi)源性U6啟動子應(yīng)用于sgRNA的表達(dá)，通過CRISPR/Cas9技術(shù)成功實現(xiàn)了SDH基因的替換。之后，U6啟動子還被用于嗜熱毀絲菌［19］、里氏木霉［20］、米曲霉［21］、黑曲霉［22］等絲狀真菌sgRNA地表達(dá)和基因編輯。此外，tRNA啟動子也被成功用于sgRNA的表達(dá)。Song等［23］在黑曲霉中測試了37個tRNA啟動子，發(fā)現(xiàn)其中36個具有良好的驅(qū)動sgRNA表達(dá)的功能。但tRNA啟動子驅(qū)動的RNA表達(dá)具有自我剪切功能，在某些情況下并不能正確地表達(dá)sgRNA，基于tRNA啟動子的基因編輯效率一直存在爭議。研究表明，5S rRNA作為細(xì)胞的基本成分，具有高度保守且含量豐富的特點(diǎn)，Zheng等［24］根據(jù)這一特點(diǎn)構(gòu)建了基于5S rRNA基因內(nèi)部啟動子的新型sgRNA表達(dá)策略，并在5S rRNA序列和sgRNA序列之間插入一個88 bp的丁型肝炎病毒（hepatitis dvirus，HDV）核酶來避免5S rRNA對sgRNA結(jié)構(gòu)和功能的影響。在黑曲霉中，基于5S rRNA啟動子的基因編輯效率（96%）明顯高于基于U6啟動子的基因編輯效率（15%～23%）。Shi等［25］在藤倉鐮孢菌（Fusarium fujikuroi）中的研究結(jié)果也表明，基于內(nèi)源性5S rRNA啟動子的基因編輯效率明顯高于其他啟動子。Wang等［26］在草酸青霉（Penicillium oxalicum）和里氏木霉的基因編輯實驗中發(fā)現(xiàn)，來自黑曲霉的5S rRNA啟動子可以高效地驅(qū)動草酸青霉中的基因編輯，但幾乎不能驅(qū)動里氏木霉中的基因編輯，而天然的5S rRNA啟動子更適合在里氏木霉基因編輯中驅(qū)動sgRNA表達(dá)。以上研究表明，RNA聚合酶Ⅲ啟動子對于sgRNA序列的驅(qū)動具有獨(dú)特優(yōu)勢，且越來越多的RNA聚合酶Ⅲ啟動子被用于絲狀真菌的CRISPR/Cas9系統(tǒng)，這使得絲狀真菌基因編輯系統(tǒng)的建立逐漸變得容易。但不同的RNA聚合酶Ⅲ啟動子在不同絲狀真菌中的驅(qū)動效果具有極大差異，因此選擇合適的內(nèi)源啟動子尤為重要。

2.2 由RNA聚合酶Ⅱ啟動子驅(qū)動sgRNA表達(dá)

盡管目前已有多種由RNA聚合酶Ⅲ啟動子驅(qū)動gRNA表達(dá)的策略，但由于RNA聚合酶Ⅲ類啟動子本身存在一些局限性，如表達(dá)看家基因、開發(fā)尚不完善等［27］，無法適應(yīng)所有CRISPR/Cas9系統(tǒng)，因此人們開始關(guān)注RNA聚合酶Ⅱ啟動子。RNA聚合酶Ⅱ啟動子主要參與mRNA的轉(zhuǎn)錄，其會在轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的5'端和3'端分別添加帽子結(jié)構(gòu)和Poly A尾。所以在使用RNA聚合酶Ⅱ啟動子驅(qū)動sgRNA的表達(dá)時，需要在sgRNA序列的兩側(cè)分別添加錘頭狀核酶（hammerhead，HH）和HDV核酶，對轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行自體剪切，從而產(chǎn)生結(jié)構(gòu)和功能正常的sgRNA［28］。N?dvig等［29］根據(jù)這一特點(diǎn)，應(yīng)用構(gòu)巢曲霉RNA聚合酶Ⅱ啟動子gpdA和trpC終止子建立了由RNA聚合酶Ⅱ啟動子驅(qū)動錘頭狀核酶和丁型肝炎病毒核酶介導(dǎo)的sgRNA表達(dá)策略，并成功應(yīng)用于多種絲狀真菌。此外，RNA聚合酶Ⅱ啟動子tef1也被用于sgRNA的表達(dá)中［30］。RNA聚 合 酶Ⅱ啟 動 子 的 應(yīng) 用 豐 富 了sgRNA序列表達(dá)驅(qū)動的可選擇性。

2.3 體外轉(zhuǎn)錄sgRNA

除以上兩種表達(dá)策略外，在有些真菌的基因編輯中部分研究者還會采用體外轉(zhuǎn)錄sgRNA的策略，通常先合成一段由T7啟動子調(diào)控的sgRNA表達(dá)序列，然后使用體外轉(zhuǎn)錄試劑盒生成sgRNA［31］。獲得的sgRNA可以與體外表達(dá)并純化后的Cas9蛋白共同構(gòu)成核糖核蛋白（ribonucleoprotein，RNP）后再進(jìn)行宿主轉(zhuǎn)化，該方法在宿主的基因編輯過程中沒有出現(xiàn)質(zhì)粒，所以也被稱為無質(zhì)粒CRISPR/Cas9系統(tǒng)［32］。與質(zhì)粒轉(zhuǎn)化系統(tǒng)相比，體外合成sgRNA可以進(jìn)行切割效率驗證，方便選擇高效的sgRNA進(jìn)行研究，同時也會降低將外源基因轉(zhuǎn)化到基因組的可能性。目前RNP介導(dǎo)的無質(zhì)粒CRISPR/Cas9系統(tǒng)已被應(yīng)用于尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）［33］、煙曲霉［32］、卷枝毛霉（Mucor circinelloides）［34］等多種絲狀真菌的基因編輯中。RNA的體外表達(dá)在進(jìn)行基因編輯時可以引入選擇標(biāo)記，這降低了外源基因引入的風(fēng)險，但也會增大轉(zhuǎn)化子篩選的難度，且gRNA在轉(zhuǎn)化時存在被降解的風(fēng)險。以上結(jié)果表明，不同的絲狀真菌因其菌體結(jié)構(gòu)、代謝機(jī)制和生理生化等方面的差異，應(yīng)選用不同的sgRNA表達(dá)策略進(jìn)行研究。

3 用于絲狀真菌的Cas9蛋白改造與表達(dá)

3.1 Cas9蛋白的序列優(yōu)化以及核定位信號的添加

具有核酸內(nèi)切酶功能的Cas9蛋白是CRISPR/Cas9系統(tǒng)的重要組成部分，目前被廣泛應(yīng)用的CRISPR/Cas9系統(tǒng)來自于原核生物化膿鏈球菌。不同的物種在編碼蛋白質(zhì)時具有密碼子偏好性，當(dāng)CRISPR/Cas9系統(tǒng)被用于不同物種的基因編輯時，需要對編碼Cas9蛋白的基因序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化，因此應(yīng)根據(jù)不同物種需求，在絲狀真菌基因編輯的研究過程中對氨基酸密碼子優(yōu)化［29］。CRISPR/Cas9系統(tǒng)分離自細(xì)菌中，天然Cas9蛋白不具備核定位信號，所以CRISPR/Cas9系統(tǒng)被應(yīng)用于真核生物時，需要在Cas9蛋白兩端添加核定位信號（nuclear localization signal，NLS）用來引導(dǎo)Cas9蛋白進(jìn)入細(xì)胞核。來自于猿猴空泡病毒（Simian vacuolating virus40，SV40）的核定位序列（PKKKRKV）被證明可以廣泛應(yīng)用于不同物種［29］。但SV40 NLS并不適用于所有的絲狀真菌，F(xiàn)eng等［35］和Wang等［33］的研究表明，經(jīng)典的核定位序列無法在大豆疫霉（Phytophthora megasperma）和尖孢鐮刀菌中完成入核引導(dǎo)，最終他們將內(nèi)源性核定位序列融合到Cas9蛋白的N端用以引導(dǎo)sgRNA進(jìn)入細(xì)胞核。Shi等［25］在藤倉鐮孢菌的研究中同樣證明經(jīng)典核定位序列不能被應(yīng)用，而選擇了VELNLS和HTBNLS完成基因編輯。以上研究表明，添加適當(dāng)?shù)暮硕ㄎ恍蛄惺荂as9蛋白順利進(jìn)入細(xì)胞核行使功能的關(guān)鍵因素，在經(jīng)典核定位序列不能完成入核引導(dǎo)時應(yīng)盡量尋找該物種的內(nèi)源性核定位序列或同屬親緣關(guān)系較近的物種中已知的核定位序列。

3.2 Cas9蛋白表達(dá)策略

與sgRNA相似，Cas9蛋白是否能表達(dá)與啟動子的類型密切相關(guān)，啟動子調(diào)控能力的強(qiáng)弱直接影響外源性Cas9蛋白的表達(dá)。生物體中的RNA聚合酶Ⅱ啟動子主要分為組成型啟動子和誘導(dǎo)型啟動子。在大多數(shù)研究中會選擇組成型啟動子來驅(qū)動Cas9蛋白在絲狀真菌中的表達(dá)，原因為組成型啟動子驅(qū)動基因表達(dá)不受空間和時間因素的影響，在組織細(xì)胞中可以穩(wěn)定持續(xù)表達(dá)。絲狀真菌CRISPR/Cas9系統(tǒng)常用的組成型啟動子主要是gpdA啟動子［21，30，36］、tef1啟動子、trpC啟動子。通常，誘導(dǎo)型啟動子在受到特定條件刺激后才會驅(qū)動基因的表達(dá)，所以Cas9在誘導(dǎo)型啟動子的驅(qū)動下表達(dá)使CRISPR/Cas9系統(tǒng)成為絲狀真菌基因組編輯的時空控制器。此外有研究中使用了由淀粉誘導(dǎo)的amyB啟動子［37］、溫度誘導(dǎo)的hsp70啟動子［38］等。Liu等［39］將cbh1啟動子應(yīng)用于Cas9的表達(dá)。以上研究表明，在實際研究中，對驅(qū)動Cas9蛋白表達(dá)啟動子的選擇需要根據(jù)實際情況進(jìn)行，以保證CRISPR/Cas9系統(tǒng)能夠在目標(biāo)菌株中高效合理的發(fā)揮作用。

4 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的遞送進(jìn)真菌細(xì)胞的方式

用于真菌基因組編輯的CRISPR/Cas9系統(tǒng)需要合適的方法轉(zhuǎn)染至細(xì)胞內(nèi)。聚乙二醇-氯化鈣介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法作為一種周期短、成本低的真菌遺傳轉(zhuǎn)化方法，可對質(zhì)粒、線性化DNA、RNA、蛋白質(zhì)等多種大分子物質(zhì)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，已被廣泛應(yīng)用于煙曲霉［40］、嗜熱毀絲菌［19］、里氏木霉［26］、黑曲霉［41］等絲狀真菌中。在易產(chǎn)生多核孢子和多核原生質(zhì)體的絲狀真菌中，從RNP瞬時轉(zhuǎn)化中分離純合轉(zhuǎn)化子較困難，所以Zou等［42］在原生質(zhì)體制備前的菌絲培養(yǎng)過程中加入了肌醇或苯菌靈來控制有絲分裂周期，明顯提高了純合轉(zhuǎn)化體的獲得效率。

雖然目前原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化已被大量運(yùn)用于絲狀真菌CRISPR/Cas9系統(tǒng)的轉(zhuǎn)化中，但原生質(zhì)體的活力取決于用于生產(chǎn)原生質(zhì)體的菌絲生長狀態(tài)以及所用酶的批次質(zhì)量，這嚴(yán)重影響了原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化效率。相對而言，在農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化方法中起始材料選擇范圍較為廣泛，這使得CRISPR/Cas9系統(tǒng)的轉(zhuǎn)化變得更加方便快捷。Wei等［43］使用根癌農(nóng)桿菌LBA4404對絲狀真菌（Glarea lozoyensis）的菌絲體完成了CRISPR質(zhì)粒轉(zhuǎn)化。Zou等［31］使用根癌農(nóng)桿菌LBA1100與里氏木霉的分生孢子共同培養(yǎng)完成了Cas9表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化。目前通過原生質(zhì)體法和電擊法未實現(xiàn)嗜熱絲狀真菌（Thermoascus aurantiacus）的轉(zhuǎn)化，Gabriel等［44］使用根癌農(nóng)桿菌EHA105與嗜熱絲狀真菌的子囊孢子共培養(yǎng)的方法進(jìn)行了實驗，并完成了基因編輯。在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法中選擇合適的農(nóng)桿菌菌株以及轉(zhuǎn)化起始材料尤為重要，這對轉(zhuǎn)化效率的影響較大。除以上兩種常見的遺傳轉(zhuǎn)化方法外，基因槍轉(zhuǎn)化法［30］、電穿孔轉(zhuǎn)化法［45］等也被應(yīng)用到絲狀真菌CRISPR/Cas9系統(tǒng)的遺傳轉(zhuǎn)化中。以上研究表明，不同的絲狀真菌生長狀況及其生理特性不盡相同，所以在遺傳轉(zhuǎn)化方法的選擇中需要綜合考慮多方面因素，合適的轉(zhuǎn)化方法可以極大地提高陽性轉(zhuǎn)化子的獲得率。

5 CRISPR/Cas9系統(tǒng)實現(xiàn)基因編輯的方式

當(dāng)Cas9蛋白成功作用于靶位點(diǎn)后，會導(dǎo)致DSB，當(dāng)DSB產(chǎn)生后，細(xì)胞為了保持DNA雙鏈的完整性，會通過非同源性末端鏈接（nonhomologous end joining，NHEJ）和同源重組（homologydirected repair，HDR）兩種途徑對斷裂的雙鏈進(jìn)行連接修復(fù)從而實現(xiàn)基因編輯。

5.1 NHEJ機(jī)制試驗絲狀真菌基因敲除

NHEJ機(jī)制具有高效、迅速等特性，幾乎可在細(xì)胞復(fù)制的所有周期進(jìn)行DSB修復(fù)［46］。NHEJ修復(fù)通路過程中Ku70蛋白和Ku80蛋白起到了重要作用［47］。通常由NHEJ通路完成的DSB修復(fù)保真性較差，在斷端修復(fù)過程中會引起堿基的插入或缺失造成移碼突變，導(dǎo)致基因開放閱讀框的提前終止，從而實現(xiàn)目標(biāo)基因的敲除。

5.2 HDR機(jī)制實現(xiàn)絲狀真菌定向基因編輯

HDR機(jī)制具有高保真特性，在正常修復(fù)過程中需以未受損的同源序列為模板進(jìn)行修復(fù)［48］。在基因工程中，通過人為引入具有同源片段的DNA分子作為模板來實現(xiàn)基因的定向編輯［49］，如基因的定向敲除［43］、構(gòu)建特殊表型［50］、外源基因或報告基因的敲入［39，51］等。Liu等［39］在研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)供體DNA中具有≥200 bp的同源區(qū)域，則可以刺激里氏木霉中的同源重組，添加≥600 bp的同源臂時，同源重組的頻率幾乎為100%。Wang等［26］在草酸青霉（Penicillium oxalicum）中使用不帶標(biāo)記的40 bp上下游同源臂直接融合產(chǎn)物，編輯效率極低（6%），而使用帶有40 bp上下游同源片段以及潮霉素標(biāo)記的供體DNA，則可以進(jìn)行同源重組。Kuivanen等［52］在黑曲霉中以40 bp的側(cè)翼序列作為供體DNA的一部分，同樣實現(xiàn)了同源重組。由于HDR的修復(fù)條件較為苛刻，通常由迅速反應(yīng)的NHEJ搶先修復(fù)，而由HDR介導(dǎo)的基因敲入效率往往較低，所以近期研究中，人們致力于如何提高HDR介導(dǎo)基因定向編輯的效率問題，如有研究表明，在絲狀真菌的NHEJ缺陷株中HDR的效率會得到一定的提高［7，53］，Gandía等［54］研究表明，破壞參與非同源末端連接的Ku70蛋白會促進(jìn)同源重組的發(fā)生。

6 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在絲狀真菌中的編輯效率與脫靶效應(yīng)

6.1 編輯效率

編輯效率是指實現(xiàn)目標(biāo)基因成功編輯的菌株所占的比率，相較于傳統(tǒng)基因編輯系統(tǒng)，CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)具有編輯效率高的特性，但也不能保證所有的研究都能高效進(jìn)行，如Katayama等［37］在研究中應(yīng)用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)分別對米曲霉wA、pyrG和yA基因進(jìn)行編輯，編輯效率分別為10%～20%、10%和100%，這表明同一菌株中不同的基因在進(jìn)行CRISPR/Cas9基因編輯時，編輯效率具有較大差異。Gabriel等［44］在嗜熱絲狀真菌（Thermoascus aurantiacus）的研究中針對同一基因的不同靶位點(diǎn)設(shè)計了3個sgRNA（sgRNA1、sgRNA2、sgRNA3），最終只有sgRNA1和sgRNA3實現(xiàn)了基因編輯，成功率分別為10%和35%。van Rhijn等［40］的研究表明，使用選擇性培養(yǎng)基再生的菌株的編輯效率明顯高于非選擇性培養(yǎng)基上再生的菌株。Li等［21］構(gòu)建了nDsRed報告基因，將原間區(qū)序列和PAM區(qū)共同插入到DsRed起始密碼子下游并構(gòu)建失活的熒光蛋白的表達(dá)質(zhì)粒，當(dāng)CRISPR系統(tǒng)成功表達(dá)并作用于原間區(qū)序列后有一定概率再次造成移碼突變，使得紅的熒光蛋白恢復(fù)活性，從而為挑選陽性突變株提供便利。以上研究表明，通過各種方法提高編輯效率，有助于快速獲得所需的基因編輯目標(biāo)菌株，從而大大降低試驗工作量和試驗成本。

6.2 脫靶效應(yīng)

脫靶效應(yīng)是指sgRNA沒有作用于靶點(diǎn)序列而產(chǎn)生的非特異性切割，從而產(chǎn)生非預(yù)期基因突變的情況。產(chǎn)生脫靶的原因主要有sgRNA與靶點(diǎn)序列等長但存在錯配堿基，sgRNA存在一個或多個堿基“凸起”，靶點(diǎn)DNA存在一個或多個“凸起”［55-56］。在CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)得到廣泛應(yīng)用后，脫靶效應(yīng)問題日益突出，并嚴(yán)重影響編輯效率的提高。研究表明，每個sgRNA的脫靶位點(diǎn)不會超過5個［57］。針對脫靶效應(yīng)問題，不同的研究采用了不同的策略，Leynaud-Kieffer等［36］在黑曲霉的研究中引入“跳躍系統(tǒng)”，使脫靶菌株在含有5-FOA的培養(yǎng)基上死亡，從而降低脫靶菌株率。sgRNA和Cas9蛋白的濃度過高以及持續(xù)表達(dá)也會引起脫靶效應(yīng)，故質(zhì)粒的CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)［33-34，42］被開發(fā)應(yīng)用于絲狀真菌基因編輯。Huck等［38］在毛霉病菌的CRISPR/Cas9表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建時去除了介導(dǎo)自我復(fù)制的元件，使得其不能自我復(fù)制而只能做瞬時表達(dá)，從而降低脫靶效應(yīng)?；诘诙鷾y序的GUIDE-seq［58］、Digenomeseq［59］等分子生物學(xué)技術(shù)也可用于脫靶位點(diǎn)的檢測，從而減少脫靶產(chǎn)物的產(chǎn)生。以上研究表明，脫靶效應(yīng)是不可避免的，但通過不同的實驗設(shè)計以及檢測方法，可以減少脫靶產(chǎn)物的產(chǎn)生。

7 CRISPR/Cas9技術(shù)在絲狀真菌中的應(yīng)用

絲狀真菌與人類生活有著極為密切的聯(lián)系，利用絲狀真菌生產(chǎn)具有重要價值的生物酶和次級代謝產(chǎn)物已成為工業(yè)界和學(xué)術(shù)界關(guān)注的焦點(diǎn)。野生型菌株并不能實現(xiàn)所需產(chǎn)物工業(yè)化水平的生產(chǎn)，為了解決這一問題，科研人員開發(fā)了許多基因技術(shù)來增加所需目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量。鑒于絲狀真菌的復(fù)雜性，包括多細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞分化、厚幾丁質(zhì)細(xì)胞壁以及缺乏合適的質(zhì)粒，CRISPR/Cas9技術(shù)在工業(yè)菌株的改造中極大地提高了基因改造能力。

作為生物酶工業(yè)化生產(chǎn)中最常用的真菌，里氏木霉具有強(qiáng)大的異源蛋白合成及分泌能力［60］。Fonseca等［61］使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在里氏木霉RUT-C30引入6種基因修飾，包括纖維素酶主調(diào)節(jié)因子XYR1的突變等位基因的組成型表達(dá)、兩種異源酶的表達(dá)，即來自埃默森籃狀菌（Talaromyces emersonii）的β-葡萄糖苷酶CEL3A和來自黑曲霉的轉(zhuǎn)化酶SUC1，以及編碼纖維素酶阻遏物ACE1和細(xì)胞外蛋白酶SLP1和PEP1的基因缺失。最終所得基因編輯菌株的纖維素混合酶分解纖維素的能力明顯高于RUT-C30。Liu等［62］同樣將里氏木霉RUT-C30作為試驗菌株，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除SxlR基因來調(diào)節(jié)木聚糖酶和纖維素酶的比例，獲得了更高的木質(zhì)纖維素水解效率。里氏木霉的纖維素酶共表達(dá)特性對于纖維素分解酶混合物具有重要意義，但在異源蛋白表達(dá)時這種特性通常是不被看好的。Rantasalo等［63］利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)及通用功能合成基因表達(dá)系統(tǒng)作用于里氏木霉，成功獲得了高純度脂肪酶B（來自于南極假絲酵母）。Rojas-Sanchez等［64］在使用黑曲霉生產(chǎn)人類促紅細(xì)胞生成素時，使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對vps、prtT、algC和och1基因進(jìn)行敲除，獲得了一種不含蛋白酶的菌株，其重組人紅細(xì)胞生長素（recombinant human erythropoietin，rHuEPO）生產(chǎn)水平提高了41.1倍。Yang等［65］在生產(chǎn)檸檬酸的黑曲霉ATCC 1015菌株中進(jìn)行了連續(xù)的基因操作，替換高效的C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白并過表達(dá)可溶性NADH依賴性延胡索酸還原酶，顯著提高了工程菌株中琥珀酸的產(chǎn)量，這說明通過基因敲除策略可以顯著提高黑曲霉的異源蛋白表達(dá)效率。以上研究表明，CRISPR/Cas9系統(tǒng)已逐漸應(yīng)用于工業(yè)真菌，而使用CRISPR/Cas9基因組編輯系統(tǒng)可以進(jìn)一步增強(qiáng)這些工業(yè)真菌的適用性。

除了對以上工業(yè)真菌的改造，CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)還可用于其他絲狀真菌，如Seekles等［50］在 絲 狀 真 菌Paecilomyces variotii和Penicillium roqueforti的研究中，使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對參與非同源末端修復(fù)的kusA基因進(jìn)行敲除，創(chuàng)建了非同源末端連接機(jī)制受到破壞的菌株；Vieira等［30］使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)生成具有pyr4營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記的哈茨木霉，對農(nóng)業(yè)生物防治劑具有重要生態(tài)學(xué)價值。以上對菌株本身的改造為后期菌株的基因編輯提供了有力的基礎(chǔ)。

8 展望

相對于傳統(tǒng)的ZFN和TALEN基因編輯系統(tǒng)，CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)具有獨(dú)特的優(yōu)勢。CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)組成成分簡單，僅由sgRNA和Cas9蛋白兩部分組成，它們可根據(jù)具體需要構(gòu)建于不同載體或同一載體上，也可直接體外合成后構(gòu)建穩(wěn)定復(fù)合物，并轉(zhuǎn)入細(xì)胞。該系統(tǒng)要求條件較少，僅需要一個特定的PAM序列（NGG），而PAM序列廣泛存在于生物體的基因組中，即CRISPR/Cas9系統(tǒng)幾乎適用于所有基因的編輯。此外，CRISPR/Cas9系統(tǒng)可使用較少的選擇性標(biāo)記同時對多個基因進(jìn)行編輯［39］。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)因其獨(dú)特的優(yōu)勢，目前在絲狀真菌模式生物其他真菌都被大力開發(fā)應(yīng)用。在工程菌株的改造方面取得了巨大成果，越來越多的絲狀真菌工程菌株被開發(fā)利用。盡管CRISPR/Cas9系統(tǒng)已被廣泛應(yīng)用于絲狀真菌的基因編輯，但仍存在編輯效率低、脫靶效應(yīng)等問題。根據(jù)DNA雙鏈斷裂和染色體易位原理，Yin等［66］基于高通量測序方法開發(fā)了一種引物延伸介導(dǎo)測序（primer extension-mediated sequencing，PEM-seq）的新方法。PEM-seq可以靈敏識別Cas9的脫靶位點(diǎn)，還可以準(zhǔn)確量化CRISPR/Cas9對靶點(diǎn)的切割效率位點(diǎn)，從而找到更有效的Cas9切割位點(diǎn)。雖然目前該方法還未在絲狀真菌中建立，但隨著研究的深入PEM-seq將會在真菌基因編輯中發(fā)揮巨大作用。在非模式絲狀真菌中存在編輯難度較高、編輯效率波動較大等問題，這可能與人們不了解宿主真菌的代謝、防御等機(jī)制，無法解除宿主內(nèi)CRISPR系統(tǒng)的限制因素相關(guān)。隨著研究的深入，未來將會有更多的絲狀真菌的基因組被破譯，以幫助研究人員設(shè)計更加適合絲狀真菌的CRISPR系統(tǒng)。