氧化應(yīng)激反應(yīng)在邊緣供肝肝移植缺血-再灌注損傷中的作用研究進(jìn)展

高偉東 楊龍龍 尹清臣

肝移植是各種終末期肝病唯一有效的治療方式，隨著肝移植技術(shù)的不斷成熟以及等待移植人數(shù)的急劇增多，供肝嚴(yán)重短缺，大量邊緣供肝被逐漸應(yīng)用于肝移植中。邊緣供肝一般是指肝移植術(shù)后存在移植物原發(fā)性無(wú)功能（primary nonfunction，PNF）、移植物功能延遲恢復(fù)（delayed graft function，DGF）等風(fēng)險(xiǎn)的供肝[1]。常見(jiàn)的邊緣供肝主要包括脂肪變性供肝、高齡供肝、小體積供肝、心臟死亡器官捐獻(xiàn)（donation after cardiac death，DCD）供肝等。雖然邊緣供肝的應(yīng)用擴(kuò)大了供肝的范圍，但相較于正常肝臟其發(fā)生缺血-再灌注損傷（ischemia-reperfusion injury，IRI）的風(fēng)險(xiǎn)更高。肝臟IRI是指肝臟在阻斷入肝血流一段時(shí)間后恢復(fù)血流供應(yīng)肝臟結(jié)構(gòu)及功能損傷并未恢復(fù)，反而加重的現(xiàn)象，是肝葉切除及肝移植手術(shù)中不可避免的問(wèn)題，影響患者術(shù)后恢復(fù)[2]。研究顯示過(guò)量活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）介導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)是導(dǎo)致肝臟IRI重要的機(jī)制[3]，且在邊緣供肝肝移植IRI表現(xiàn)更為明顯，因此若能夠有效控制邊緣供肝肝移植過(guò)程的氧化應(yīng)激反應(yīng)，便能有效地提高邊緣供肝肝移植的成功率。

1 氧化應(yīng)激反應(yīng)

氧化應(yīng)激反應(yīng)是指機(jī)體產(chǎn)生過(guò)多ROS超過(guò)自身抗氧化防御能力，從而損傷蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA的狀態(tài)。ROS是包括超氧陰離子（O2-）、過(guò)氧化氫（H2O2）、羥自由基（OH-）和臭氧（O3）等在內(nèi)的氧的還原產(chǎn)物的統(tǒng)稱[4]。ROS產(chǎn)生的主要部位是細(xì)胞內(nèi)線粒體呼吸鏈復(fù)合物，其可將電子傳遞給氧，當(dāng)氧不完全還原時(shí)，ROS便作為該過(guò)程的副產(chǎn)物產(chǎn)生，其中的絡(luò)合物Ⅰ和Ⅲ是線粒體內(nèi)ROS的主要來(lái)源。此外，細(xì)胞色素酶和還原性輔酶Ⅱ也可參與產(chǎn)生ROS。正常情況下，低濃度ROS對(duì)于細(xì)胞維持正常生理活性是必不可少的，參與信號(hào)傳導(dǎo)、基因表達(dá)、生物合成、細(xì)胞生長(zhǎng)等生理過(guò)程[5-6]。由于抗氧化系統(tǒng)的存在，細(xì)胞產(chǎn)生ROS的能力和清除ROS的效率處于動(dòng)態(tài)平衡，氧化還原平衡得以維持，此過(guò)程稱為ROS穩(wěn)態(tài)[7]。例如，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）可將ROS轉(zhuǎn)化為H2O2，然后通過(guò)H2O2酶予以清除。然而，在肝移植過(guò)程中IRI不可避免，各種來(lái)源的ROS產(chǎn)生增加，破壞了這一微妙的平衡，增加的ROS消耗內(nèi)源性抗氧化劑，此時(shí)雖可代償性增加抗氧化酶的表達(dá)，以維持氧化還原平衡，但當(dāng)損傷持續(xù)發(fā)生時(shí)，代償反應(yīng)不足以糾正失衡的氧化還原狀態(tài)，則引起氧化應(yīng)激損傷，進(jìn)而導(dǎo)致無(wú)菌性炎癥反應(yīng)和肝細(xì)胞凋亡、壞死，甚至導(dǎo)致移植失敗。

2 ROS在邊緣供肝肝移植IRI中的作用及防治要點(diǎn)

肝臟是人體第二大器官，由于其具有雙重血供的特點(diǎn)，肝細(xì)胞習(xí)慣于富氧環(huán)境，故而對(duì)缺血缺氧損傷更為敏感。如何減輕肝移植IRI是眾多學(xué)者不斷探討的問(wèn)題，在肝臟IRI早期ROS已開始升高并對(duì)肝細(xì)胞產(chǎn)生損傷，在后期無(wú)菌性炎癥反應(yīng)時(shí)中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞被激活并在肝臟中積聚，這些細(xì)胞通過(guò)釋放ROS和炎癥因子加劇IRI[8]。因此，ROS介導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)貫穿IRI整個(gè)過(guò)程，而邊緣供肝的自身特性導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)在其IRI中對(duì)肝細(xì)胞損傷更為嚴(yán)重。

2.1 脂肪變性供肝

隨著全球肥胖率的上升，10%～24%的世界人口患有肝脂肪變性，并且預(yù)計(jì)在將來(lái)會(huì)繼續(xù)上升[9]。尸體和活體供肝中都常發(fā)現(xiàn)肝脂肪變性，有研究顯示，供肝中有9%～26%存在脂肪變性[10]，由于部分供肝存在嚴(yán)重脂肪變性，大約40%的供肝被舍棄[11]。因此，使用脂肪變性供肝進(jìn)行移植成為了研究的熱點(diǎn)。肝脂肪性變性依據(jù)脂肪變性程度分為輕度（＜30%）、中度（30%～60%）和重度（＞60%），有研究認(rèn)為供肝脂肪變性程度＜60%時(shí)可用于肝移植，重度脂肪變性供肝的應(yīng)用會(huì)導(dǎo)致移植肝初期肝功能不良和PNF發(fā)生率增高，輕至中度脂肪變性供肝對(duì)于肝移植遠(yuǎn)期預(yù)后無(wú)明顯影響[12]。

ROS對(duì)脂肪變性供肝細(xì)胞的損傷程度較正常肝細(xì)胞明顯增加[13-14]。Zhao等[15]認(rèn)為這可能是由于沉積在肝細(xì)胞中的多余脂肪是過(guò)氧化反應(yīng)的靶標(biāo)，且肝脂肪變性過(guò)程中，肝細(xì)胞體積增大，竇狀隙受擠壓，導(dǎo)致脂肪變性供肝處于相對(duì)缺血的環(huán)境，對(duì)外界刺激較為敏感[8,16]。越來(lái)越多的證據(jù)表明肝脂肪變性與線粒體功能障礙有關(guān)，肝脂肪變性會(huì)引起線粒體形態(tài)變化和功能障礙，包括類結(jié)晶包涵體產(chǎn)生，線粒體DNA表達(dá)水平降低以及線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ的活性降低，從而引起ROS產(chǎn)生增多以及三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）合成減少，過(guò)量的ROS產(chǎn)生會(huì)增強(qiáng)脂質(zhì)過(guò)氧化作用，攻擊細(xì)胞膜產(chǎn)生脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物丙二醛（malondialdehyde，MDA）[17-20]。此外，Zhang等[21]證實(shí)ROS還可直接氧化線粒體膜脂質(zhì)和線粒體蛋白，改變其結(jié)構(gòu)和功能特性，導(dǎo)致線粒體損傷。由于線粒體功能受損，致使線粒體呼吸鏈復(fù)合物產(chǎn)生更多ROS，而ROS又進(jìn)一步攻擊線粒體，導(dǎo)致線粒體中ROS的產(chǎn)生不斷增多，這一ROS產(chǎn)生自我增強(qiáng)的過(guò)程，被稱為“ROS誘導(dǎo)的ROS釋放”[22]。線粒體受損不能產(chǎn)生足夠的ATP，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞水腫，而過(guò)量的ROS會(huì)通過(guò)內(nèi)源性及外源性途徑啟動(dòng)細(xì)胞凋亡[23]。

抑制過(guò)量ROS產(chǎn)生可阻止線粒體和肝細(xì)胞進(jìn)一步損傷，Zhang等[24]使用鳶尾素作用于肝脂肪變性缺血-再灌注小鼠模型及HL7702脂肪變性細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型，結(jié)果顯示鳶尾素可明顯減少肝細(xì)胞內(nèi)ROS生成，并改善線粒體功能、抑制肝細(xì)胞炎癥反應(yīng)及壞死，最終減輕肝脂肪變性小鼠肝臟IRI。此外，肝脂肪變性和IRI之間的相互作用進(jìn)一步促進(jìn)了巨噬細(xì)胞的激活和積累，IRI過(guò)程誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞從肝微循環(huán)中募集，活化的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α等促炎介質(zhì)，誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子表達(dá)，刺激趨化因子產(chǎn)生，導(dǎo)致中性粒細(xì)胞的募集，釋放更多的ROS和蛋白酶，進(jìn)一步對(duì)肝臟造成損傷[25]。以巨噬細(xì)胞為靶點(diǎn)，Thurman等[26]使用三氯化釓選擇性破壞肝脂肪變性大鼠體內(nèi)巨噬細(xì)胞后可以抑制ROS的形成并改善微循環(huán)，從而減輕肝臟IRI，阻止肝細(xì)胞凋亡。

2.2 高齡供肝

隨著我國(guó)人口老齡化加劇，高齡供肝在供肝池中所占比例勢(shì)必逐漸增多。在供肝短缺的情況下高齡供肝可以在一定程度上擴(kuò)大供肝來(lái)源，但受者術(shù)后發(fā)生移植肝衰竭和死亡的風(fēng)險(xiǎn)亦相對(duì)升高。在現(xiàn)有的研究中一般將高齡供肝定義為年齡＞60歲供者肝臟[27-28]。過(guò)去認(rèn)為與青少年相比，老年人肝臟的血流量和總?cè)莘e略有下降，近些年研究表明在正常情況下，這種減少不會(huì)導(dǎo)致明顯的肝功能損害，但會(huì)影響肝臟對(duì)IRI的敏感性[29]。老年人肝臟的自由基總量明顯高于年輕人，過(guò)氧化脂質(zhì)和MDA含量明顯上升，SOD活性及多不飽和脂肪酸/總脂肪酸比值顯著下降[30]。

衰老方面的實(shí)驗(yàn)研究主要基于嚙齒動(dòng)物模型，Okaya等[31]比較了12～13月齡小鼠和8～12周齡小鼠在70%肝臟IRI模型中的損傷情況，結(jié)果表明老年小鼠肝臟損傷更為嚴(yán)重。Park等[32]使用9月齡大鼠及3月齡大鼠分別建立70% 肝臟IRI模型后得出了類似結(jié)論。衰老過(guò)程會(huì)加重肝臟氧化應(yīng)激反應(yīng)，隨著機(jī)體的衰老，氧化損傷在肝臟線粒體中不斷積累，細(xì)胞內(nèi)線粒體功能發(fā)生一系列變化，主要為呼吸鏈氧化磷酸化酶活性降低，電子傳遞受阻，ATP合成減少，自由基產(chǎn)生增多[33-34]。此外，在IRI發(fā)生發(fā)展過(guò)程中一氧化氮（nitric oxide，NO）亦參與機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)，NO由NO合酶（NO synthase，NOS）合成，主要存在3種亞型，即神經(jīng)元型NOS（neuronal NOS，nNOS）、內(nèi)皮型NOS（endothelial NOS， eNOS）和誘導(dǎo)型NOS（inducible NOS，iNOS），iNOS產(chǎn)生高濃度NO可加重氧化應(yīng)激損傷，而eNOS產(chǎn)生的低濃度NO可抑制ROS產(chǎn)生。研究表明與成年大鼠相比，老年大鼠IRI后肝臟iNOS水平明顯增加，eNOS水平明顯下降，褪黑素是松果體產(chǎn)生的一種ROS清除劑，可明顯降低機(jī)體iNOS含量，增加eNOS含量，減輕高齡供肝氧化應(yīng)激反應(yīng)[35-36]。

2.3 小體積供肝

小體積供肝是指供肝體積小于標(biāo)準(zhǔn)肝體積的40%或移植物與受者質(zhì)量比為0.8%～1.0%，最常見(jiàn)于劈離式肝移植。劈離式肝移植是根據(jù)肝臟Couinaud分段理論將一個(gè)完整的供肝分成2個(gè)或2個(gè)以上的解剖功能單位移植到不同的受者中，可以擴(kuò)大20%～30%的供肝來(lái)源，是緩解供肝短缺的重要方式[37]。臨床通常將供肝劈分為左外葉和右三葉或者左、右半肝，以增加肝臟利用率。雖然劈離式供肝選擇標(biāo)準(zhǔn)明顯高于普通供肝，但因移植物質(zhì)量與受者不匹配而引起的小肝綜合征嚴(yán)重影響受者預(yù)后，目前認(rèn)為在劈離式肝移植中移植物與受者質(zhì)量比應(yīng)大于1.0%才能夠有效避免小肝綜合征的發(fā)生[38-39]。

小體積供肝相較于正常供肝更易受到IRI影響，小體積供肝較全肝移植會(huì)產(chǎn)生更多ROS，而ROS不僅可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及炎癥，還可以致使肝細(xì)胞DNA受損，抑制肝細(xì)胞分裂，延緩小體積供肝移植后生長(zhǎng)[40-41]。因此，通過(guò)增強(qiáng)機(jī)體抗氧化系統(tǒng)，清除體內(nèi)過(guò)量的ROS對(duì)小體積供肝移植顯得至關(guān)重要。Cui等[42]使用SOD模擬物（MnTBAP）作用于小體積供肝移植大鼠模型，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，使用MnTBAP處理可明顯降低大鼠術(shù)后血清MDA、轉(zhuǎn)氨酶、炎癥因子水平，促進(jìn)移植肝的肝細(xì)胞增殖，表明增強(qiáng)機(jī)體抗氧化水平可以明顯降低肝臟氧化應(yīng)激反應(yīng)及炎癥反應(yīng)。Zhang等[43]通過(guò)體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)也得到相似結(jié)果，即通過(guò)過(guò)表達(dá)eNOS促使機(jī)體產(chǎn)生大量NO可以抑制ROS生成。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)eNOS后大鼠體內(nèi)NO含量明顯增多，同時(shí)明顯改善大鼠肝功能及減少肝細(xì)胞凋亡，遺憾的是這兩項(xiàng)實(shí)驗(yàn)并未直接觀察ROS生成情況。而Zhong等[41]的實(shí)驗(yàn)表明具有ROS清除能力的山茶多酚可以明顯減少小體積供肝移植中ROS含量，減弱脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，減少肝細(xì)胞壞死、白細(xì)胞浸潤(rùn)，提高大鼠術(shù)后存活率。

2.4 心臟死亡器官捐獻(xiàn)供肝

DCD供肝在心臟停搏過(guò)程中，不可避免地經(jīng)歷低血壓、缺氧等熱缺血過(guò)程，熱缺血時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)影響供肝質(zhì)量、延長(zhǎng)移植肝功能恢復(fù)時(shí)間，甚至引起移植肝失活[44-45]。DCD供肝在熱缺血期間，隨著缺血時(shí)間延長(zhǎng)，供肝受到的氧化應(yīng)激損傷不斷增加。魏寶龍等[46]通過(guò)建立功能性熱缺血大鼠肝移植模型，用于比較不同熱缺血時(shí)間對(duì)供肝損傷的影響，結(jié)果表明與對(duì)照組相比，肝臟在熱缺血開始時(shí)已發(fā)生氧化應(yīng)激損傷，且隨著缺血時(shí)間增加損傷不斷加劇。因此，DCD供肝應(yīng)用于臨床首要問(wèn)題便是盡可能減少心臟停搏后供肝熱缺血過(guò)程中的再灌注損傷。

體外膜肺氧合（extracorporeal membrane oxygenation，ECMO）是一種使用體外循環(huán)設(shè)備短暫替代心肺功能，為全身器官供氧的技術(shù)，可有效緩解由于器官缺氧導(dǎo)致的氧化應(yīng)激損傷，主要用于暫時(shí)為嚴(yán)重呼吸和心功能不全患者提供支持治療。在DCD供者中應(yīng)用ECMO可減輕器官IRI，同時(shí)為移植前充分評(píng)估供肝及受者情況及制定手術(shù)方式提供時(shí)間[47]。Sun等[48]觀察了在摘取供肝前應(yīng)用ECMO以使熱缺血時(shí)間＜10 min對(duì)患者預(yù)后影響，數(shù)據(jù)表明6例受者肝功能及凝血功能在短時(shí)間內(nèi)恢復(fù)正常，隨訪2年無(wú)受者死亡及移植物失功發(fā)生。Jiménez-Galanes等[49]比較了腦死亡供肝與ECMO支持下的DCD供肝肝移植的預(yù)后情況，結(jié)果表明兩者之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。若將ROS清除劑加入灌注液中并不斷檢測(cè)灌注液中ROS濃度，以使ROS處于合適濃度，則可將ROS在肝移植IRI中的損傷作用轉(zhuǎn)變?yōu)楸Ｗo(hù)作用。因此，在DCD供者中應(yīng)用ECMO可擴(kuò)大供者來(lái)源并提高獲取器官的質(zhì)量，改善受者預(yù)后。ECMO的應(yīng)用雖取得不錯(cuò)效果，但仍存在一些問(wèn)題需不斷完善，如ECMO置管時(shí)機(jī)的選擇，ECMO運(yùn)行時(shí)間及流量的不統(tǒng)一等[47]。

3 小 結(jié)

綜上所述，由ROS介導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)在邊緣供肝肝移植IRI中扮演重要角色，減少肝臟IRI時(shí)大量產(chǎn)生的ROS對(duì)于減輕肝臟IRI具有重要意義。但是，ROS并非對(duì)機(jī)體總是具有破壞作用，有研究表明低濃度ROS可通過(guò)激活自噬反應(yīng)、磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B （phosphatidylinositol 3-kinase /protein kinase B，PI3K/Akt）信號(hào)通路、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號(hào)通路在肝臟IRI中起到保護(hù)作用[23]。因此，最理想的方式應(yīng)是將ROS濃度控制在對(duì)肝臟IRI具有保護(hù)作用時(shí)的最適濃度范圍。遺憾的是，最適濃度范圍目前仍不清楚，邊緣供肝肝移植IRI仍是需要攻克的難題。不過(guò)，令人欣喜的是如鳶尾素、三氯化釓、SOD模擬物、ECMO技術(shù)等可減少邊緣供肝肝移植過(guò)程中產(chǎn)生的ROS，對(duì)提高移植成功率可能會(huì)有幫助，有一定應(yīng)用前景。