UPLC?MS／MS 法測定右歸丸中3 種雙酯型生物堿及風險評價

刁春玲 鄧杰華 袁秀澤 朱建蒙 楊建冬 周云峰

（1.淳安縣第一人民醫(yī)院， 浙江 杭州311700； 2.宜春市食品藥品檢驗所， 江西 宜春336000）

附子是毛茛科植物烏頭Aconitum carmichaeliiDebx.子根的加工品，具有補火助陽、回陽救逆功效［1］，臨床作用顯著，但毒性較強，使用不當會導(dǎo)致中毒甚至死亡［2?3］，其有效成分和有毒物質(zhì)均為二萜類生物堿，其中雙酯型生物堿毒性最強［4］，包括烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿［5?7］，故需經(jīng)過炮制加工成飲片來減低毒性后才能使用，但不同方法效果有所差異［8?10］，不能保證完全去除該類成分，導(dǎo)致潛在風險一直存在。

右歸丸中含有炮附片［11］，它作為附子炮制飲片可能會引入雙酯型生物堿，其現(xiàn)行質(zhì)量標準是采用TLC 法對烏頭堿含量進行限制［11］，但樣品前處理過程復(fù)雜繁瑣，判定依據(jù)也只是與對照品比較斑點大小，專屬性不強，而且部分雙酯型生物堿的限量控制并不能完全消除安全風險，目前也無關(guān)于對該制劑毒性物質(zhì)評價的報道。因此，本實驗采用超高效液相色譜?串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC?MS／MS）法同時測定右歸丸中烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿3 種雙酯型生物堿的含量，并對其進行風險評價，以期為其他中藥復(fù)方制劑安全性評價及有害物質(zhì)限度控制研究提供依據(jù)。

1 材料

Waters ACQUITY UPLC H?class／xevo TQD 液相色譜?質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Waters 公司）；LE204E 電子天平（萬分之一）、MS205DU 電子天平（十萬之一）［梅特勒?托利多儀器（上海）有限公司］；PL?S60 超聲波清洗儀（東莞康士潔超聲波科技有限公司）。右歸丸（小蜜丸）共12批，由仲景宛西制藥股份有限公司提供。新烏頭堿（批號17011302，純度98%）、烏頭堿（批號17022702，純度98%）、次烏頭堿（批號17072103，純度98%）對照品均購于成都普菲德生物技術(shù)有限公司。甲醇、乙腈（德國默克公司）；甲酸［賽默飛世爾科技（中國）有限公司］；水為屈臣氏蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Waters ACQUITY UPLC?BEH C18色譜柱（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）；流動相乙腈（A）?0.1% 甲酸（B），梯度洗脫，程序見表1；體積流量0.3 mL／min；柱溫30 ℃；樣品室溫度10 ℃；進樣量5 μL。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution programs

2.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（ESI），正離子檢測；多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式；脫溶劑氣溫度600 ℃，體積流量1 000 L／h；錐孔氣體積流量50 L／h，其他參數(shù)見表2。

表2 各雙酯型生物堿質(zhì)譜參數(shù)Tab.2 Mass spectrum parameters for various diester alkaloids

2.3 溶液制備

2.3.1 對照品溶液 精密稱取各對照品適量，50% 甲醇（含0.1% 鹽酸）溶解，制成含烏頭堿166.600 ng／mL、次烏頭堿219.520 ng／mL、新烏頭堿161.500 ng／mL 的貯備液，分別精密量取1、5、10、15、25 mL，置于50 mL 量瓶中，50%甲醇（含0.1%鹽酸）溶解稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3.2 供試品溶液 本品用粉碎機打碎后取約2.5 g，精密稱定，置于250 mL 錐形瓶中，精密加入50%甲醇（含0.1%鹽酸）50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，振搖5 min，常溫超聲（功率250 W，頻率50 kHz）處理30 min，放冷，50%甲醇（含0.1%鹽酸）補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3.3 陰性樣品溶液 取不含炮附片的本品約2.5 g 作為陰性樣品，精密稱定，按“2.3.2”項下方法制備，即得。

2.3.4 空白溶液 不加本品，按“2.3.2”項下方法制備，即得。

2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.3.1”項下系列質(zhì)量濃度貯備液各5 μL，在“2.1”“2.2”項條件下進樣測定。以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）進行回歸，以信噪比（S／N）3∶1 時的質(zhì)量濃度為檢測限，結(jié)果見表3，可知各雙酯型生物堿在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表3 各雙酯型生物堿線性關(guān)系Tab.3 Linear relationships of various diester alkaloids

2.5 專屬性試驗 精密吸取對照品、供試品（批號190502）、陰性樣品、空白溶液各5 μL，在“2.1”“2.2”項條件下進樣測定，結(jié)果見圖1。由此可知，供試品溶液出現(xiàn)與對照品溶液保留時間一致的色譜峰，而且提取的各離子對均有較高響應(yīng)，保留時間也基本相同，同時陰性樣品、空白溶液均無對應(yīng)色譜峰，對測定無干擾，表明該方法專屬性良好。

圖1 各雙酯型生物堿MRM 色譜圖Fig.1 MRM chromatograms of various diester alkaloids

2.6 精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性試驗

2.6.1 精密度試驗 取同一份對照品溶液，在“2.1”“2.2”項條件下進樣測定6次，測得烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿峰面積RSD 分別為0.9%、0.4%、0.5%，表明儀器精密度良好。

2.6.2 重復(fù)性試驗 取同一批本品（批號190502）6份，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”“2.2”項條件下進樣測定，測得烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿峰面積RSD 分別為4.5%、3.1%、3.7%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.6.3 穩(wěn)定性試驗 取同一批本品（批號190502），于0、1、2、4、8、12 h 在“2.1”“2.2”項條件下進樣測定，測得烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿峰面積RSD 分別為3.4%、1.6%、2.2%，表明溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 加樣回收率試驗 取各雙酯型生物堿含量已知的本品（批號190502）約1.25 g，精密稱定，置于250 mL 錐形瓶中，精密加入對照品溶液（含烏頭堿69.2 ng／mL、次烏頭堿485.2 ng／mL、新烏頭堿257.6 ng／mL）5 mL，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”“2.2”項條件下進樣測定6次，計算回收率，結(jié)果見表4，可知均符合2020 年版《中國藥典》四部［12］要求。

表4 各雙酯型生物堿加樣回收率試驗結(jié)果（n＝6）Tab.4 Results of recovery tests for various diester alkaloids（n＝6）

2.8 樣品含量測定 取12 批樣品，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”“2.2”項條件下各進樣測定2次，計算含量，結(jié)果見表5。

表5 各雙酯型生物堿含量測定結(jié)果（μg／g，n＝2）Tab.5 Results of content determination of various diester alkaloids（μg／g，n＝2）

2.9 風險評價 12 批樣品均存在烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿3 種雙酯型生物堿，具有心血管系統(tǒng)［13?14］、神經(jīng)系統(tǒng)［15?16］、生殖［17?18］、胚胎［19］、肝腎［20］毒性，故有必要對三者風險進行評價。

2020 年版《中國藥典》一部規(guī)定，炮附片含雙酯型生物堿以烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿總量計，不得超過0.020%（200 μg／g），其一次服用量為3～15 g，則最大耐受總量為3 000 μg。右歸丸中烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿總量范圍為2.346～3.241 μg／g，其一次服用量為9 g，則人體最大攝入量為29.169 μg，小于最大耐受總量，表明三者風險較小。

半數(shù)致死量（LD50）可衡量藥物安全性，反映急性毒性強弱［21］，烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿的小鼠LD50分別為1.8、5.8、1.9 μg／g，而國際通用標準成人體質(zhì)量為55.9 kg，則折算成三者引起成人急性中毒量分別為100.620、324.220、106.210 mg。服用右歸丸后，進入人體的上述3 種雙酯型生物堿最大總量僅為29.169 μg，即不會構(gòu)成急性中毒風險。

在3 種雙酯型生物堿中，烏頭堿毒性最強，成人口服0.2 mg 即可中毒，3～5 mg 即可致死［22］。以0.2 mg 為口服中毒閾值，測得烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿口服最大總量為29.169 μg，小于該閾值，表明三者產(chǎn)生安全風險的概率較低。

3 討論

烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿既是有效成分，又是毒性物質(zhì)，其治療劑量與中毒劑量接近，臨床治療窗較窄［23?24］，易產(chǎn)生安全風險，故有必要對三者進行限量控制。中成藥處方藥味較多，成分組成復(fù)雜，如僅采用1 個離子對進行MRM 定量檢測時，分子結(jié)構(gòu)式類似者易產(chǎn)生干擾，導(dǎo)致假陽性，故需先對其進行定性鑒別。本實驗通過一、二級質(zhì)譜發(fā)現(xiàn)，各批次右歸丸均存在與烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿對照品相應(yīng)的碎片離子，即均含有上述3 種毒性物質(zhì)，再選取3 個以上響應(yīng)較高者進行MRM 定量測定。

雙酯型生物堿會發(fā)生水解反應(yīng)，加熱時其含量下降更快［25］，故對該類成分進行含量測定時需考慮上述情況。右歸丸屬于蜜丸，具有黏性，難以研成細粉，故本實驗考察了水、0.1% 鹽酸、甲醇（含0.1%鹽酸）、50%甲醇（含0.1%鹽酸）等溶劑，以及常溫超聲處理30 min、過夜浸泡、過夜浸泡后再常溫超聲處理30 min 等提取方法對烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿含量的影響，最終確定為50%甲醇（含0.1%鹽酸）、常溫超聲處理30 min。

本實驗建立UPLC?MS／MS 法同時測定右歸丸中新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿3 種雙酯型生物堿的含量，發(fā)現(xiàn)市售樣品中三者均較低，風險評價顯示安全性較高，不易產(chǎn)生中毒風險。因此，有關(guān)企業(yè)在生產(chǎn)含附子的藥品時需加強質(zhì)量管理和風險把控，嚴格控制雙酯型生物堿含量，保證原料藥材和飲片質(zhì)量，優(yōu)化生產(chǎn)工藝，以期從源頭上減少該類成分帶來的安全風險。