植物油中生育酚分析檢測(cè)技術(shù)的建立和品質(zhì)研究

蔣 雁， 于連洋， 孔凡華

(1 貴州省糧油產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)站， 貴陽(yáng) 550001；2 北京生物制品研究所有限責(zé)任公司， 北京 100176；3北京市營(yíng)養(yǎng)源研究所有限公司， 北京 100069)

生育酚由α, β, δ, γ-生育酚和α, β, δ, γ-三烯生育酚8 個(gè)異構(gòu)體組成, 其中α-生育酚的生理活性最強(qiáng), 起著主導(dǎo)抗氧化能力的作用[1-2]。 生育酚存在于植物油、 肉、 乳、 蛋和果蔬中, 植物油中生育酚含量豐富, 是生育酚良好的食物來(lái)源[3]。 生育酚在機(jī)體生命活動(dòng)中發(fā)揮著重要的作用[4-9]。 目前, 生育酚測(cè)定方法主要有熒光法、 比色法、 高效液相色譜法[10-16]、 氣相色譜法[17]、 氣相色譜-質(zhì)譜法[18-19]、 電化學(xué)分析法等。 比色法只能測(cè)定生育酚的總含量, 不能測(cè)定各種單體的含量； 光譜法前處理繁瑣, 共存物對(duì)檢測(cè)結(jié)果干擾較大； 氣相色譜法因生育酚分子量大, 分子汽化度低, 保留時(shí)間長(zhǎng)且靈敏度低； 氣相色譜-質(zhì)譜法儀器昂貴, 普適性低； 電化學(xué)分析法雖然靈敏度高、 具有一定的選擇性, 但植物油中共存物的干擾會(huì)導(dǎo)致生育酚結(jié)果偏高, 不適合植物油中生育酚含量的測(cè)定[20-21]；正相高效液相色譜法前處理簡(jiǎn)單, 但對(duì)儀器的污染較大, 不適合大批量樣品的檢測(cè)； 反相高效液相色譜法具有快速、 靈敏、 準(zhǔn)確度和精密度高等優(yōu)點(diǎn), 適合于植物油中生育酚含量的測(cè)定。 生育酚的組成和含量是衡量植物油脂質(zhì)量的重要指標(biāo)[22], 建立植物油中生育酚含量的精準(zhǔn)分析檢測(cè)技術(shù), 對(duì)植物油的質(zhì)量控制和品質(zhì)評(píng)價(jià)具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料和試劑 茶葉籽油、 特級(jí)初榨橄欖油、 胡麻油、 5S 壓榨一級(jí)花生油、 葵花籽油、 玉米油、 大豆油、 植物調(diào)和油、 亞麻籽油A、 亞麻籽油B、 冷榨初榨亞麻籽油、 有機(jī)冷榨亞麻籽油、 浸出菜籽油、 土榨菜籽油、 低芥酸特香菜籽油、 油菜籽油、 沙棘果油、 核桃油, 市售； 無(wú)水乙醇、 氫氧化鉀、 石油醚、 無(wú)水硫酸鈉(均為分析純), 北京化工廠； 抗壞血酸(分析純), 天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司； 乙醚(分析純), 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司； 甲醇(色譜純), Fisher Chemical； δ-生 育 酚 (純 度: 95.0%)、 γ-生 育 酚 (純 度:99.1%)、 β-生育酚(純度: 99.0%)、 α-生育酚(純度: 96.0%), SIGMA 公司。

1.1.2 儀器和設(shè)備 BS224S 分析天平, 德國(guó)賽多利斯科學(xué)儀器(北京) 有限公司； ZHWY-110X30 往復(fù)式恒溫水浴搖床, 上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司； EYELA N-1100 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀, 東京理化株式會(huì)社； CCA-1111 冷卻水循環(huán)裝置, 東京理化株式會(huì)社； MMV-1000W 振蕩器, 東京理化株式會(huì)社； 安捷倫1260 高效液相色譜儀,配二極管陣列檢測(cè)器, 美國(guó)Agilent 公司。

1.2 方法

1.2.1 皂化 稱取1 g 植物油樣品于150 mL 平底燒瓶中, 加入1.0 g 抗壞血酸輕輕混勻, 加入30 mL 無(wú)水乙醇和10 mL 50% 氫氧化鉀水溶液, 輕輕混勻后于80 ℃恒溫水浴搖床皂化30 min, 冷卻至室溫。

1.2.2 提取 冷卻后的皂化溶液轉(zhuǎn)入250 mL 的分液漏斗中, 用水將皂化瓶沖洗干凈, 加入50 mL 石油醚-乙醚混合液(1∶1/v∶v), 振蕩萃取3 ～5 min, 靜置, 待溶液分層后, 轉(zhuǎn)移下層溶液于另一分液漏斗中, 重復(fù)萃取2 次, 合并上層有機(jī)層溶液。 用水洗滌有機(jī)層, 重復(fù)洗滌3 次, 將有機(jī)層洗至中性, 去除下層水相, 收集有機(jī)層溶液。

1.2.3 濃縮 有機(jī)層經(jīng)無(wú)水硫酸鈉吸水后濾入250 mL旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中, 用石油醚-乙醚混合液(1∶1/v∶v) 沖洗分液漏斗及無(wú)水硫酸鈉2 次, 沖洗液并入蒸發(fā)瓶中, 將蒸發(fā)瓶在40 ℃水浴中減壓蒸餾, 蒸發(fā)至近干后, 轉(zhuǎn)移到10 mL 容量瓶中, 用甲醇定容至10 mL 刻度, 定容液過(guò)0.45 μm 有機(jī)系濾膜, 供高效液相色譜儀上機(jī)測(cè)定。

1.2.4 色譜條件 分析柱: C30(250 mm ×4.6 mm, 3 μm)。 柱溫: 20 ℃。 流動(dòng)相: A 為水、 B 為甲醇, 洗脫程序0.0～13.0 min, 水4%； 13.0～20.0 min, 水由4%變換至0%； 20.0 ～24.0 min, 水保持0%； 24.0 ～24.5 min,水由0%變換至4%； 24.5～30.0 min, 水保持4%； 流速0.8 mL/min； 紫外檢測(cè)波長(zhǎng)294 nm； 進(jìn)樣量10 μL。

1.2.5 結(jié)果計(jì)算 樣品中生育酚的含量按式(1)計(jì)算:

式(1) 中,X－樣品中生育酚的含量(mg/100 g)；ρ－根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到的樣品中生育酚的濃度(μg/mL)；v-定容體積(mL)； 100 －樣品中量以每100 g 計(jì)算的換算系數(shù)；m-樣品的稱樣量(g)。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法的線性關(guān)系

按照建立的方法, 配制1.00 ～60.00 μg/mL δ, γ,β, α-生育酚標(biāo)準(zhǔn)溶液, 上機(jī)制定, 結(jié)果顯示, δ-生育酚標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y ＝6.355 5x-4.423 3, 線性相關(guān)系數(shù)R2＝0.998 7, γ-生育酚標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y ＝6.904 7x-0.429, 線性相關(guān)系數(shù)R2＝0.997 1, β-生育酚標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y ＝6.941 1x ＋3.611 9, 線性相關(guān)系數(shù)R2＝0.999 2, α-生育酚標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y ＝5.195 9x ＋12.816, 線性相關(guān)系數(shù)R2＝0.999 3, δ, γ,β, α-生育酚線性關(guān)系良好, 可以滿足檢測(cè)要求。

2.2 方法的檢出限和定量限

取樣品按照標(biāo)準(zhǔn)方法處理, 上機(jī)測(cè)定觀察信噪比, 適當(dāng)進(jìn)行稀釋測(cè)定檢出限濃度。 逐步稀釋到R(S/N) ＝3 時(shí)的測(cè)定濃度作為檢出限, R (S/N) ＝10時(shí)的測(cè)定濃度作為定量限, 得到生育酚檢出濃度為0.214 2 μg/mL, 當(dāng)樣品稱樣量為5 g, 定容體積為10 mL 時(shí), 折算得出方法檢出限為42.84 μg/100 g,定量限為142.80 μg/100 g。

2.3 方法的精密度

準(zhǔn)確稱取6 份沙棘果油樣品, 按照實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行提取并連續(xù)測(cè)定, 計(jì)算精密度。 由表1 可知, 沙棘果油中δ, γ, β, α-生育酚和生育酚總和6 次平行測(cè)定結(jié)果的RSD 分別為3.45%、 1.52%、 4.20%、 2.22%、 1.78%,表明方法的精密度良好, 適合定量分析。

表1 沙棘果油中精密度測(cè)定結(jié)果

2.4 方法的準(zhǔn)確度

準(zhǔn)確稱取9 份沙棘果油樣品, 根據(jù)樣品本底值選取3 個(gè)加標(biāo)水平, 分別為本底值的0.5、 1、 1.5 倍, 每個(gè)加標(biāo)水平平行測(cè)定3 次, 進(jìn)行三水平三平行加標(biāo)回收試驗(yàn)。 按照上述方法進(jìn)行提取并連續(xù)測(cè)定, 計(jì)算回收率。由表2 可知, 沙棘果油中δ, γ, β, α-生育酚和生育酚總和的加標(biāo)回收率分別在91.67% ～102.08%、 94.21%～103.11%、 92.42% ～102.30%、 97.01% ～104.22%、94.03% ～102.89%, 加標(biāo)回收率的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為3.37%、 2.94%、 3.78%、 2.65%、 2.76%, 加標(biāo)回收率均在90% ～110%, 加標(biāo)回收率的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于5%。

表2 沙棘果油中加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.5 樣品的測(cè)定

采集市售植物油樣品, 按試驗(yàn)方法測(cè)定生育酚的含量。 由表3 可知, 18 種植物油中均檢測(cè)出了生育酚, 不同植物油中生育酚的含量差異顯著, 植物油中生育酚主要以γ-生育酚和α-生育酚為主, δ-生育酚和β-生育酚含量相對(duì)較低。 沙棘果油中生育酚的含量最高, 其次是大豆油和植物調(diào)和油, 玉米油中生育酚含量也相對(duì)較高。 茶葉籽油、 特級(jí)初榨橄欖油、 葵花籽油、 油菜籽油、 沙棘果油中生育酚以α-生育酚為主, 胡麻油、 玉米油、 大豆油、 植物調(diào)和油、 亞麻籽油、 浸出菜籽油、 土榨菜籽油、 低芥酸特香菜籽油和核桃油中生育酚以γ-生育酚為主, 5S 壓榨一級(jí)花生油中γ-生育酚和α-生育酚的比例接近。 植物油中生育酚的含量不同, 除了與植物本身生育酚含量的差異有關(guān)外, 還與植物油的制備工藝有關(guān), 冷榨亞麻籽油中生育酚的含量顯著高于普通工藝制備的亞麻籽油。

表3 市售植物油中生育酚的含量 單位: mg/100 g

研究表明, α-生育酚的生理活性最強(qiáng), β-生育酚和γ-生育酚生理活性不及α-生育酚的一半, δ-生育酚幾乎沒(méi)有活性[23]。 以α-生育酚當(dāng)量為評(píng)價(jià)指標(biāo), 各種植物油中α-生育酚當(dāng)量的順序?yàn)樯臣?葵花籽油>油菜籽油>植物調(diào)和油>玉米油>大豆油>菜籽油>花生油>茶葉籽油>胡麻油>核桃油>亞麻籽油,因此, 僅考慮植物油中生育酚的含量, 沙棘果油最優(yōu),葵花籽油次之。 實(shí)驗(yàn)得分排序結(jié)果并不能綜合評(píng)價(jià)植物油的品質(zhì), 評(píng)分高的植物油中生育酚的含量高, 適合一定的人群食用, 而評(píng)分低的植物油并不代表其品質(zhì)不好, 只說(shuō)明其生育酚的含量相對(duì)低。 要綜合評(píng)價(jià)植物油的品質(zhì), 需要在后續(xù)的研究中繼續(xù)補(bǔ)充脂肪酸組成及各種脂肪酸組成比例、 植物甾醇、 角鯊烯、 類胡蘿卜素、 磷脂成分等, 對(duì)植物油進(jìn)行全面的品質(zhì)評(píng)價(jià)。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)建立了反相高效液相色譜法測(cè)定植物油中生育酚的分析檢測(cè)技術(shù), 以沙棘果油為樣品, 進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證, 結(jié)果顯示, δ, γ, β, α-生育酚線性關(guān)系良好,可滿足檢測(cè)要求。 沙棘果油中δ, γ, β, α-生育酚和生育酚總和6 次平行測(cè)定結(jié)果的RSD 均小于5%, 表明方法的精密度良好, 適合定量分析。 沙棘果油中δ, γ,β, α-生育酚和生育酚總和的加標(biāo)回收率在90% ～110%, 加標(biāo)回收率的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于5%, 表明方法添加回收率高, 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小, 能夠滿足檢測(cè)實(shí)際樣品的需要。 試驗(yàn)建立的方法前處理操作簡(jiǎn)便、 靈敏度高、 重現(xiàn)性和準(zhǔn)確性好, 適合植物油中生育酚的測(cè)定。采集市售18 種植物油, 以α-生育酚當(dāng)量進(jìn)行品質(zhì)評(píng)價(jià),結(jié)果顯示, 沙棘果油最優(yōu), 葵花籽油次之。