蔣 雁, 于連洋, 孔凡華
(1 貴州省糧油產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)站, 貴陽(yáng) 550001;2 北京生物制品研究所有限責(zé)任公司, 北京 100176;3北京市營(yíng)養(yǎng)源研究所有限公司, 北京 100069)
生育酚由α, β, δ, γ-生育酚和α, β, δ, γ-三烯生育酚8 個(gè)異構(gòu)體組成, 其中α-生育酚的生理活性最強(qiáng), 起著主導(dǎo)抗氧化能力的作用[1-2]。 生育酚存在于植物油、 肉、 乳、 蛋和果蔬中, 植物油中生育酚含量豐富, 是生育酚良好的食物來(lái)源[3]。 生育酚在機(jī)體生命活動(dòng)中發(fā)揮著重要的作用[4-9]。 目前, 生育酚測(cè)定方法主要有熒光法、 比色法、 高效液相色譜法[10-16]、 氣相色譜法[17]、 氣相色譜-質(zhì)譜法[18-19]、 電化學(xué)分析法等。 比色法只能測(cè)定生育酚的總含量, 不能測(cè)定各種單體的含量; 光譜法前處理繁瑣, 共存物對(duì)檢測(cè)結(jié)果干擾較大; 氣相色譜法因生育酚分子量大, 分子汽化度低, 保留時(shí)間長(zhǎng)且靈敏度低; 氣相色譜-質(zhì)譜法儀器昂貴, 普適性低; 電化學(xué)分析法雖然靈敏度高、 具有一定的選擇性, 但植物油中共存物的干擾會(huì)導(dǎo)致生育酚結(jié)果偏高, 不適合植物油中生育酚含量的測(cè)定[20-21];正相高效液相色譜法前處理簡(jiǎn)單, 但對(duì)儀器的污染較大, 不適合大批量樣品的檢測(cè); 反相高效液相色譜法具有快速、 靈敏、 準(zhǔn)確度和精密度高等優(yōu)點(diǎn), 適合于植物油中生育酚含量的測(cè)定。 生育酚的組成和含量是衡量植物油脂質(zhì)量的重要指標(biāo)[22], 建立植物油中生育酚含量的精準(zhǔn)分析檢測(cè)技術(shù), 對(duì)植物油的質(zhì)量控制和品質(zhì)評(píng)價(jià)具有重要的意義。
1.1.1 原料和試劑 茶葉籽油、 特級(jí)初榨橄欖油、 胡麻油、 5S 壓榨一級(jí)花生油、 葵花籽油、 玉米油、 大豆油、 植物調(diào)和油、 亞麻籽油A、 亞麻籽油B、 冷榨初榨亞麻籽油、 有機(jī)冷榨亞麻籽油、 浸出菜籽油、 土榨菜籽油、 低芥酸特香菜籽油、 油菜籽油、 沙棘果油、 核桃油, 市售; 無(wú)水乙醇、 氫氧化鉀、 石油醚、 無(wú)水硫酸鈉(均為分析純), 北京化工廠; 抗壞血酸(分析純), 天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司; 乙醚(分析純), 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司; 甲醇(色譜純), Fisher Chemical; δ-生 育 酚 (純 度: 95.0%)、 γ-生 育 酚 (純 度:99.1%)、 β-生育酚(純度: 99.0%)、 α-生育酚(純度: 96.0%), SIGMA 公司。
1.1.2 儀器和設(shè)備 BS224S 分析天平, 德國(guó)賽多利斯科學(xué)儀器(北京) 有限公司; ZHWY-110X30 往復(fù)式恒溫水浴搖床, 上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司; EYELA N-1100 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀, 東京理化株式會(huì)社; CCA-1111 冷卻水循環(huán)裝置, 東京理化株式會(huì)社; MMV-1000W 振蕩器, 東京理化株式會(huì)社; 安捷倫1260 高效液相色譜儀,配二極管陣列檢測(cè)器, 美國(guó)Agilent 公司。
1.2.1 皂化 稱取1 g 植物油樣品于150 mL 平底燒瓶中, 加入1.0 g 抗壞血酸輕輕混勻, 加入30 mL 無(wú)水乙醇和10 mL 50% 氫氧化鉀水溶液, 輕輕混勻后于80 ℃恒溫水浴搖床皂化30 min, 冷卻至室溫。
1.2.2 提取 冷卻后的皂化溶液轉(zhuǎn)入250 mL 的分液漏斗中, 用水將皂化瓶沖洗干凈, 加入50 mL 石油醚-乙醚混合液(1∶1/v∶v), 振蕩萃取3 ~5 min, 靜置, 待溶液分層后, 轉(zhuǎn)移下層溶液于另一分液漏斗中, 重復(fù)萃取2 次, 合并上層有機(jī)層溶液。 用水洗滌有機(jī)層, 重復(fù)洗滌3 次, 將有機(jī)層洗至中性, 去除下層水相, 收集有機(jī)層溶液。
1.2.3 濃縮 有機(jī)層經(jīng)無(wú)水硫酸鈉吸水后濾入250 mL旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中, 用石油醚-乙醚混合液(1∶1/v∶v) 沖洗分液漏斗及無(wú)水硫酸鈉2 次, 沖洗液并入蒸發(fā)瓶中, 將蒸發(fā)瓶在40 ℃水浴中減壓蒸餾, 蒸發(fā)至近干后, 轉(zhuǎn)移到10 mL 容量瓶中, 用甲醇定容至10 mL 刻度, 定容液過(guò)0.45 μm 有機(jī)系濾膜, 供高效液相色譜儀上機(jī)測(cè)定。
1.2.4 色譜條件 分析柱: C30(250 mm ×4.6 mm, 3 μm)。 柱溫: 20 ℃。 流動(dòng)相: A 為水、 B 為甲醇, 洗脫程序0.0~13.0 min, 水4%; 13.0~20.0 min, 水由4%變換至0%; 20.0 ~24.0 min, 水保持0%; 24.0 ~24.5 min,水由0%變換至4%; 24.5~30.0 min, 水保持4%; 流速0.8 mL/min; 紫外檢測(cè)波長(zhǎng)294 nm; 進(jìn)樣量10 μL。
1.2.5 結(jié)果計(jì)算 樣品中生育酚的含量按式(1)計(jì)算:
式(1) 中,X-樣品中生育酚的含量(mg/100 g);ρ-根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到的樣品中生育酚的濃度(μg/mL);v-定容體積(mL); 100 -樣品中量以每100 g 計(jì)算的換算系數(shù);m-樣品的稱樣量(g)。
按照建立的方法, 配制1.00 ~60.00 μg/mL δ, γ,β, α-生育酚標(biāo)準(zhǔn)溶液, 上機(jī)制定, 結(jié)果顯示, δ-生育酚標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y =6.355 5x-4.423 3, 線性相關(guān)系數(shù)R2=0.998 7, γ-生育酚標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y =6.904 7x-0.429, 線性相關(guān)系數(shù)R2=0.997 1, β-生育酚標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y =6.941 1x +3.611 9, 線性相關(guān)系數(shù)R2=0.999 2, α-生育酚標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y =5.195 9x +12.816, 線性相關(guān)系數(shù)R2=0.999 3, δ, γ,β, α-生育酚線性關(guān)系良好, 可以滿足檢測(cè)要求。
取樣品按照標(biāo)準(zhǔn)方法處理, 上機(jī)測(cè)定觀察信噪比, 適當(dāng)進(jìn)行稀釋測(cè)定檢出限濃度。 逐步稀釋到R(S/N) =3 時(shí)的測(cè)定濃度作為檢出限, R (S/N) =10時(shí)的測(cè)定濃度作為定量限, 得到生育酚檢出濃度為0.214 2 μg/mL, 當(dāng)樣品稱樣量為5 g, 定容體積為10 mL 時(shí), 折算得出方法檢出限為42.84 μg/100 g,定量限為142.80 μg/100 g。
準(zhǔn)確稱取6 份沙棘果油樣品, 按照實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行提取并連續(xù)測(cè)定, 計(jì)算精密度。 由表1 可知, 沙棘果油中δ, γ, β, α-生育酚和生育酚總和6 次平行測(cè)定結(jié)果的RSD 分別為3.45%、 1.52%、 4.20%、 2.22%、 1.78%,表明方法的精密度良好, 適合定量分析。
表1 沙棘果油中精密度測(cè)定結(jié)果
準(zhǔn)確稱取9 份沙棘果油樣品, 根據(jù)樣品本底值選取3 個(gè)加標(biāo)水平, 分別為本底值的0.5、 1、 1.5 倍, 每個(gè)加標(biāo)水平平行測(cè)定3 次, 進(jìn)行三水平三平行加標(biāo)回收試驗(yàn)。 按照上述方法進(jìn)行提取并連續(xù)測(cè)定, 計(jì)算回收率。由表2 可知, 沙棘果油中δ, γ, β, α-生育酚和生育酚總和的加標(biāo)回收率分別在91.67% ~102.08%、 94.21%~103.11%、 92.42% ~102.30%、 97.01% ~104.22%、94.03% ~102.89%, 加標(biāo)回收率的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為3.37%、 2.94%、 3.78%、 2.65%、 2.76%, 加標(biāo)回收率均在90% ~110%, 加標(biāo)回收率的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于5%。
表2 沙棘果油中加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果
采集市售植物油樣品, 按試驗(yàn)方法測(cè)定生育酚的含量。 由表3 可知, 18 種植物油中均檢測(cè)出了生育酚, 不同植物油中生育酚的含量差異顯著, 植物油中生育酚主要以γ-生育酚和α-生育酚為主, δ-生育酚和β-生育酚含量相對(duì)較低。 沙棘果油中生育酚的含量最高, 其次是大豆油和植物調(diào)和油, 玉米油中生育酚含量也相對(duì)較高。 茶葉籽油、 特級(jí)初榨橄欖油、 葵花籽油、 油菜籽油、 沙棘果油中生育酚以α-生育酚為主, 胡麻油、 玉米油、 大豆油、 植物調(diào)和油、 亞麻籽油、 浸出菜籽油、 土榨菜籽油、 低芥酸特香菜籽油和核桃油中生育酚以γ-生育酚為主, 5S 壓榨一級(jí)花生油中γ-生育酚和α-生育酚的比例接近。 植物油中生育酚的含量不同, 除了與植物本身生育酚含量的差異有關(guān)外, 還與植物油的制備工藝有關(guān), 冷榨亞麻籽油中生育酚的含量顯著高于普通工藝制備的亞麻籽油。
表3 市售植物油中生育酚的含量 單位: mg/100 g
研究表明, α-生育酚的生理活性最強(qiáng), β-生育酚和γ-生育酚生理活性不及α-生育酚的一半, δ-生育酚幾乎沒(méi)有活性[23]。 以α-生育酚當(dāng)量為評(píng)價(jià)指標(biāo), 各種植物油中α-生育酚當(dāng)量的順序?yàn)樯臣?葵花籽油>油菜籽油>植物調(diào)和油>玉米油>大豆油>菜籽油>花生油>茶葉籽油>胡麻油>核桃油>亞麻籽油,因此, 僅考慮植物油中生育酚的含量, 沙棘果油最優(yōu),葵花籽油次之。 實(shí)驗(yàn)得分排序結(jié)果并不能綜合評(píng)價(jià)植物油的品質(zhì), 評(píng)分高的植物油中生育酚的含量高, 適合一定的人群食用, 而評(píng)分低的植物油并不代表其品質(zhì)不好, 只說(shuō)明其生育酚的含量相對(duì)低。 要綜合評(píng)價(jià)植物油的品質(zhì), 需要在后續(xù)的研究中繼續(xù)補(bǔ)充脂肪酸組成及各種脂肪酸組成比例、 植物甾醇、 角鯊烯、 類胡蘿卜素、 磷脂成分等, 對(duì)植物油進(jìn)行全面的品質(zhì)評(píng)價(jià)。
本試驗(yàn)建立了反相高效液相色譜法測(cè)定植物油中生育酚的分析檢測(cè)技術(shù), 以沙棘果油為樣品, 進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證, 結(jié)果顯示, δ, γ, β, α-生育酚線性關(guān)系良好,可滿足檢測(cè)要求。 沙棘果油中δ, γ, β, α-生育酚和生育酚總和6 次平行測(cè)定結(jié)果的RSD 均小于5%, 表明方法的精密度良好, 適合定量分析。 沙棘果油中δ, γ,β, α-生育酚和生育酚總和的加標(biāo)回收率在90% ~110%, 加標(biāo)回收率的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于5%, 表明方法添加回收率高, 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小, 能夠滿足檢測(cè)實(shí)際樣品的需要。 試驗(yàn)建立的方法前處理操作簡(jiǎn)便、 靈敏度高、 重現(xiàn)性和準(zhǔn)確性好, 適合植物油中生育酚的測(cè)定。采集市售18 種植物油, 以α-生育酚當(dāng)量進(jìn)行品質(zhì)評(píng)價(jià),結(jié)果顯示, 沙棘果油最優(yōu), 葵花籽油次之。
中國(guó)食物與營(yíng)養(yǎng)2022年11期