基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討杜仲葉的營養(yǎng)價值與作用機(jī)制

張寶軍， 張 磊， 王健英

(上海中醫(yī)健康服務(wù)協(xié)同創(chuàng)新中心/上海中醫(yī)藥大學(xué)， 上海 201203)

杜仲葉為杜仲科植物杜仲(Eucommia ulmoides) 的干燥葉, 性溫, 味微辛, 具有補(bǔ)肝腎、 強(qiáng)筋骨的功效,可用于治療肝腎不足、 頭暈?zāi)垦！?腰膝酸痛、 筋骨痿軟等癥狀[1]。 現(xiàn)代藥理研究表明, 杜仲葉富含黃酮類、 環(huán)烯醚萜類、 苯丙素類、 木脂素類、 酚類、 杜仲膠、 多糖類等化學(xué)成分[2], 具有免疫調(diào)節(jié)、 降脂降糖、 抗衰老、抗氧化、 抗炎、 抗骨質(zhì)疏松等多種保健作用[3]。 2019年國家衛(wèi)生健康委同國家市場監(jiān)管總局將杜仲葉列入黨參等9 種試點按照傳統(tǒng)既是食品又是中藥材的物質(zhì)名單[4], 作為一種藥食同源物質(zhì), 歷年來杜仲葉已廣泛應(yīng)用于功能性健康食品領(lǐng)域, 相關(guān)產(chǎn)品種類繁多, 諸如杜仲葉復(fù)合保健飲料[5]、 發(fā)酵醋[6]、 保健牙膏[7]、 超微粉饅頭[8]、 茶飲[9]等。 目前, 杜仲葉的研究主要集中在某一類成分的提取分離、 質(zhì)量控制、 含量測定、 動物實驗等方面, 杜仲葉相關(guān)健康產(chǎn)品的研究更偏向于制備工藝方面, 然而從分子水平系統(tǒng)闡述杜仲葉整體營養(yǎng)功能及評價的研究鮮有報道, 在一定程度上限制了其新型食品資源的開發(fā)與利用。 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為一種有效預(yù)測藥物靶點和分子機(jī)制的分析手段, 因其整體性、 系統(tǒng)性和綜合性的屬性特征與中藥多成分、 多靶點、 整體性的特點具有高度的相似性[10], 目前已廣泛應(yīng)用于食品、 藥品領(lǐng)域。 本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法, 對杜仲葉潛在關(guān)鍵靶點及信號通路進(jìn)行挖掘分析, 探討杜仲葉營養(yǎng)價值與作用機(jī)制, 以期為杜仲葉藥食同源類健康產(chǎn)品的開發(fā)提供理論依據(jù)和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 杜仲葉化合物信息及潛在靶點的獲取

基于中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺TCMSP(https: / /www.tcmsp-e.com/) 檢索, 以“杜仲葉” 為關(guān)鍵詞, 獲取杜仲葉化合物成分信息及對應(yīng)的潛在靶點, 結(jié)合Uniport 數(shù)據(jù)庫(https: / /www.uniprot.org/),將靶點名稱轉(zhuǎn)化為對應(yīng)的基因名, 形成化合物-基因?qū)?yīng)關(guān)系, 以便后續(xù)分析。

1.2 蛋白質(zhì)作用網(wǎng)絡(luò)(PPI) 的構(gòu)建與分析

通過在線STRING 數(shù)據(jù)庫平臺(https: / /cn.stringdb.org/, 版本號11.5), 以物種設(shè)置為“Homo sapiens”, 最高置信度蛋白交互參數(shù)評分值0.9 作為初始條件, 導(dǎo)入243 個靶點, 去掉網(wǎng)絡(luò)中離散的節(jié)點構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖。 將PPI 數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2 軟件中, 通過“Network Analyzer” 功能進(jìn)行靶點拓?fù)鋵傩苑治觥?/p>

1.3 基因功能富集分析

利用DAVID 數(shù)據(jù)庫(https: / /david.ncifcrf.gov/)及KEGG 數(shù)據(jù)庫(https: / /www.kegg.jp/kegg/) 進(jìn)行GO 富集和KEGG 通路富集分析243 個基因靶點信息。

1.4 “化合物-靶點-通路” 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

運用Cytoscape 可視化網(wǎng)絡(luò)繪圖軟件, 繪制杜仲葉化合物-靶點-通路網(wǎng)絡(luò), 并獲取相關(guān)網(wǎng)絡(luò)參數(shù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 杜仲葉化合物信息數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建

通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫檢索到78 個化合物成分及289個對應(yīng)潛在靶點, 去除數(shù)據(jù)庫中無靶點及非人源靶點對應(yīng)化合物信息, 經(jīng)uniport 數(shù)據(jù)庫轉(zhuǎn)化為基因名去重后,共得53 個化合物信息對應(yīng)243 個基因靶點, 杜仲葉關(guān)鍵化合物信息見附表。

附表 杜仲葉關(guān)鍵化合物信息

2.2 杜仲葉化合物作用靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)分析

通過在線STRING 數(shù)據(jù)庫, 導(dǎo)入243 個靶點構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)圖, 拓?fù)鋵傩苑治鼋Y(jié)果顯示, 網(wǎng)絡(luò)中包含186個節(jié)點, 731 條邊。 以連接度(degree) 值為參考, 排名前10 的靶點分別為SRC (degree ＝39)、 TP53 (degree ＝37)、 AKT1 (degree ＝36)、 MAPK1 (degree ＝35)、 MAPK3 (degree ＝35)、 RELA (degree ＝35)、 TNF(degree ＝27)、 FOS (degree ＝25)、 RXRA (degree ＝24)、 IL6 (degree ＝24), 其中度值最高的SRC 能與39個蛋白發(fā)生相互作用, 預(yù)示著這些靶點可能是杜仲葉作為藥食兩用物質(zhì), 發(fā)揮營養(yǎng)價值和保健功效的潛在關(guān)鍵蛋白, 蛋白-蛋白相互作用(PPI) 網(wǎng)絡(luò)見圖1。

圖1 蛋白-蛋白相互作用(PPI) 網(wǎng)絡(luò)

2.3 基因功能GO 富集分析

以P<0.05、FDR<0.05 為篩選條件, 物種設(shè)置為“Homo sapiens”, 在“Gene Ontology” 項下, 在DAVID數(shù)據(jù)庫中GO 富集分析243 個作用靶點, 結(jié)果顯示, GO條目包含424 個生物過程(biological process, BP), 主要涉及基因表達(dá)的正調(diào)控、 藥物反應(yīng)、 細(xì)胞增殖的正調(diào)控、 對外源刺激的反應(yīng)、 衰老、 對脂多糖的反應(yīng)、 對缺氧的反應(yīng)、 絲裂原活化蛋白激酶級聯(lián)反應(yīng)的正調(diào)控、 對乙醇的反應(yīng)、 細(xì)胞對鎘離子的響應(yīng)等過程。 94 個細(xì)胞組成(cellular component, CC) 主要富集在細(xì)胞外間隙、 質(zhì)膜、 細(xì)胞小凹、 突觸后膜、 質(zhì)膜的整體成分、 胞外區(qū)、 膜筏、 大分子復(fù)合物、 細(xì)胞表面等區(qū)域。 94 個分子功能(molecular function, MF) 條目, 主要富集在酶結(jié)合、 相同的蛋白質(zhì)結(jié)合、 蛋白質(zhì)同源二聚體化活性、遞質(zhì)門控離子通道活性參與突觸后膜電位的調(diào)節(jié)、 興奮性細(xì)胞外配體門控離子通道活動、 神經(jīng)遞質(zhì)受體活性、RNA 聚合酶II 轉(zhuǎn)錄因子活性, 配體激活序列特異性DNA 結(jié)合、 蛋白結(jié)合、 胞外配體門控離子通道活性、 蛋白激酶活性等功能。 根據(jù)P值, 分別選取BP、 CC、 MF排名前10 的條目(圖2)。

圖2 GO 功能富集分析柱狀圖

2.4 KEGG 通路富集分析

以P<0.05、FDR<0.05 為篩選條件, 對上述243個作用靶點進(jìn)行KEGG 通路富集分析, 共得到186 個條目, 主要涉及腫瘤通路、 脂質(zhì)與動脈粥樣硬化、 人類巨細(xì)胞病毒感染、 卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、 流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化、 乙型肝炎、 糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE 信號通路、 前列腺癌、 胰腺癌、 膀胱癌信號通路等。 選取排名前20 的通路進(jìn)行KEGG 通路富集分析氣泡圖繪制(圖3), 圓點越大表示富集的基因數(shù)越多； P 值越小, 圓點顏色越藍(lán)； P 值越大, 圓點顏色越黃。 以富集基因數(shù)最多的腫瘤通路為例, 結(jié)合KEGG Pathway 數(shù)據(jù)庫, 標(biāo)注66 個涉及靶點在通路上的相關(guān)調(diào)控過程, 相關(guān)靶點調(diào)控過程用藍(lán)色標(biāo)識, 其中排名前10靶點涉及調(diào)控過程用紅色標(biāo)識, 杜仲葉營養(yǎng)成分對腫瘤通路的作用靶點標(biāo)注圖見圖4。

圖3 KEGG 通路富集分析氣泡圖

圖4 杜仲葉營養(yǎng)成分對腫瘤通路的作用靶點標(biāo)注圖

2.5 杜仲葉“化合物-靶點-通路” 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及分析

KEGG 通路富集分析排名前10 通路及其涉及的96個靶點和靶點對應(yīng)的34 個成分導(dǎo)入Cytoscape 軟件中,構(gòu)建杜仲葉“化合物-靶點-通路” 網(wǎng)絡(luò)(圖5)。 根據(jù)拓?fù)浞治? 網(wǎng)絡(luò)中化合物連接度值越大意味著其對應(yīng)的靶點越多, 以連接度(degree) 值為參考, 排名前5 的化合 物 依 次 為 MOL000098 槲 皮 素 (degree ＝80)、MOL000422 山 奈 酚 (degree ＝25)、 MOL000415 蘆 丁(degree ＝9)、 MOL003735 桃葉珊瑚苷(degree ＝8)、MOL000123 牻牛兒醇(degree ＝6), 在網(wǎng)絡(luò)中具有較高的連接度表明, 這些成分可能是杜仲葉發(fā)揮藥效的潛在活性物質(zhì)； 以≥2 倍中位數(shù)的degree 值(degree 中位數(shù)值為5) 進(jìn)行篩選, 排名前10 的靶點分別為PTGS2(degree ＝32)、 RELA (degree ＝13)、 F2R (degree ＝12)、 TNF (degree ＝11)、 AKT1 (degree ＝11)、 TP53(degree ＝10)、 MAPK3 (degree ＝10)、 MAPK1 (degree＝10)、 BCL2 (degree ＝10)、 BAX (degree ＝10), 預(yù)示著這些靶點在相關(guān)通路上發(fā)揮著重要的作用。

圖5 杜仲葉“化合物-靶點-通路” 網(wǎng)絡(luò)

3 討論

近年來, 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)已廣泛應(yīng)用于食品科學(xué)領(lǐng)域分析, 為營養(yǎng)成分的功能定位提供了科學(xué)依據(jù)。 現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明, 應(yīng)劍等[11]利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法通過建立“成分-靶標(biāo)-疾病” 的關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò), 闡述了蜂膠成分改善代謝性疾病的“多成分、 多靶點” 特征, 分析了核心作用通路。 黃旭龍等[12]通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法, 篩選了8個西瓜皮活性營養(yǎng)成分, 并對糖尿病防治潛在作用靶點和通路進(jìn)行了預(yù)測分析, 為西瓜皮藥用價值的研究和資源開發(fā)提供了參考。 安莉等[13]基于生物信息學(xué)探討了山藥的營養(yǎng)藥理功能及作用機(jī)制, 分析挖掘了其潛在關(guān)鍵靶點及關(guān)鍵代謝途徑。 為了更好地明確杜仲葉營養(yǎng)價值的功能定位, 探討其對人體作用機(jī)制的重要意義, 本文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué), 探討了杜仲葉的營養(yǎng)價值功能與作用機(jī)制。

通過杜仲葉靶點蛋白PPI 網(wǎng)絡(luò)圖分析, 篩選出degree 值≥35 的潛在關(guān)鍵靶點, 具體包括SRC、 TP53、AKT1、 MAPK1、 MAPK3、 RELA。 SRC 作為一類重要的非受體酪氨酸蛋白激酶, 在胰腺癌、 肺癌、 前列腺癌和乳腺癌等多種腫瘤的發(fā)生、 發(fā)展中發(fā)揮著重要作用, 如參與細(xì)胞增殖、 凋亡、 轉(zhuǎn)移、 影響細(xì)胞連接和粘附、 血管生成、 細(xì)胞周期和信號通路等多個方面[14-15]。 TP53作為一種重要的抑癌基因, 基因狀態(tài)的改變可誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生, 在基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控中發(fā)揮重要的作用, 其編碼的多功能的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子可參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、 修復(fù)DNA損傷及促進(jìn)細(xì)胞的程序性凋亡[16-17], 此外TP53 的基因狀態(tài)也是判斷淋巴瘤和血液病預(yù)后的重要指標(biāo)[18], 可通過其突變情況, 指導(dǎo)臨床用藥和治療方案的選擇。 絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶AKT 為磷脂酰肌醇3 激酶(PI3K) 下游的重要靶點, 其參與PI3K/Akt 信號通路在抑郁 癥[19]、 糖 尿 病[20]、 心 血 管 疾 病[21]、 腦 神 經(jīng) 疾病[22]、 高血壓[23]防治過程中扮演著重要角色。

杜仲葉“化合物-靶點-通路” 網(wǎng)絡(luò)分析顯示, 黃酮類(槲皮素、 山奈酚、 蘆丁)、 環(huán)烯醚萜類(桃葉珊瑚苷)、 單萜類(牻牛兒醇) 可能是其發(fā)揮營養(yǎng)功能的重要化合物。 研究表明, 槲皮素作為一種具有廣闊應(yīng)用前景的天然膳食化合物, 在疾病預(yù)防及治療方面具有廣泛的藥理作用, 近年來因其在抗糖尿病、 抗氧化、 抗高血壓病、 抗炎、 抗菌、 抗衰老及心血管保護(hù)方面的重要藥用價值而備受關(guān)注[24-25]。 山奈酚具有豐富多樣的生物學(xué)活性, 其功能涉及癌癥、 糖尿病、 骨質(zhì)疏松、 動脈粥樣硬化、 保護(hù)神經(jīng)以及抑制蛋白激酶等多個方面, 還可作為食品加工中的防腐保鮮劑及抗氧劑[26]。 研究表明,蘆丁是一種天然抗氧化劑, 具有心血管保護(hù)、 神經(jīng)保護(hù)、 抗炎、 抗菌、 抗腫瘤等生物活性, 其多種藥理作用的發(fā)揮與其抗氧化性和抗炎活性有著密切的關(guān)系[27-29],此外蘆丁還是一種具有顯著護(hù)肝生物活性的重要藥膳兩用功能成分[30]。 桃葉珊瑚苷可通過調(diào)節(jié)Nrf2、 NF-κB、AMPK、 NO、 JNK 等多條信號通路, 發(fā)揮神經(jīng)和生殖系統(tǒng)保護(hù)、 降低血糖水平、 抗骨關(guān)節(jié)炎、 抗骨質(zhì)疏松、 抗腫瘤以及抗老化等藥理作用[31], 此外桃葉珊瑚苷經(jīng)人腸道菌群代謝后, 其苷元是起解毒保肝作用的主要活性形式[32], 具有顯著的抗菌作用, 且活性優(yōu)于桃葉珊瑚苷[33]。 牻牛兒醇又名香葉醇, 具有改善糖脂代謝異常及血管內(nèi)皮功能障礙、 抑制細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)、 抗炎、調(diào)節(jié)血膽固醇等藥理作用, 在心血管疾病防治方面具有廣闊的應(yīng)用前景[34-35]。 由此可見, 杜仲葉中富集靶點較多的這些化合物在抗炎、 抗腫瘤、 抗氧化、 心血管保護(hù)等方面發(fā)揮著重要的營養(yǎng)保健功能。

4 結(jié)論

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討了杜仲葉營養(yǎng)價值功能及生物學(xué)機(jī)制, 通過構(gòu)建“化合物-靶點-通路” 網(wǎng)絡(luò), 分析挖掘了具備營養(yǎng)功能重要化合物的潛在靶點及作用通路, 結(jié)果顯示出杜仲葉具有抗炎、 抗腫瘤、 抗氧化、 心血管保護(hù)等功效, 揭示了其多成分、 多靶點、 多途徑協(xié)同作用的特點, 為后續(xù)杜仲葉產(chǎn)業(yè)化開發(fā)奠定了理論基礎(chǔ), 對其藥食同源類功能產(chǎn)品的開發(fā)提供了良好的基礎(chǔ)和科學(xué)指導(dǎo)。