中鏈甘油三酯聯(lián)合復(fù)合乳酸菌的抗疲勞作用及其機(jī)制研究

高 倩， 樸美子， 陳芊汝， 劉英華， 劉昕琦， 徐 慶

(1 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院， 山東青島 266109；2青島特種食品研究院， 山東青島 266109；3解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心營(yíng)養(yǎng)科， 北京 100853)

中鏈甘油三酯(MCTs) 作為一種特殊的快速供能物質(zhì)廣泛應(yīng)用于臨床營(yíng)養(yǎng)方面[1-3]。 已有研究表明, MCTs 具有提高認(rèn)知能力、 提高胰島素敏感性[4]、 減脂[5]、 減重[2]、 抗炎癥[6]、 調(diào)節(jié)腸道菌群作用[7]。 在緩解疲勞方面, MCTs 能快速生酮供能、 提高脂肪抗氧化性、 抑制糖酵解和降低血乳酸濃度、 緩解肌肉酸痛[8-11]。 機(jī)體補(bǔ)充益生菌能促進(jìn)SCFA 和脂肪酸氧化, 激活線粒體能量代謝輔助活化因子, 調(diào)節(jié)新陳代謝和能量平衡[12-13], 調(diào)節(jié)體內(nèi)抗氧化酶活性, 改善運(yùn)動(dòng)性能、 抗炎癥, 提高肌肉質(zhì)量, 延緩疲勞[14-15]。 MCTs 聯(lián)合復(fù)合乳酸菌在抗疲勞作用中研究較少。 本研究通過(guò)負(fù)重力竭游泳實(shí)驗(yàn)建立動(dòng)物模型, 從能量調(diào)節(jié)、 代謝產(chǎn)物累積和氧化應(yīng)激等3 個(gè)方面來(lái)評(píng)價(jià)MCTs 聯(lián)合復(fù)合乳酸菌的抗疲勞效果。

1. 材料與方法

1.1 材料

MCTs 油劑, 由日清奧利友(中國(guó)) 投資有限公司提供, 成分見(jiàn)表1。 復(fù)合乳酸菌凍干粉, 購(gòu)于遼寧中世生物技術(shù)有限公司(由嗜酸乳桿菌和干酪乳桿菌按1: 1混合, 菌粉濃度為1.01×1011CFU/g)。

表1 MCTs 中的脂肪酸種類(lèi)和含量

1.2 試劑與配制

血乳酸試劑盒、 肌酸激酶試劑盒、 乳酸脫氫酶試劑盒、 血清尿素氮試劑盒、 丙二醛試劑盒、 肝/肌糖原試劑盒、 總超氧化物歧化酶試劑盒、 過(guò)氧化氫酶試劑盒、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶試劑盒, 均購(gòu)自南京建成生物工程研究所； 無(wú)水乙醇、 冰醋酸、 濃硫酸等均為分析純； 無(wú)水葡萄糖。 葡萄糖原液: 稱(chēng)取56.25 g 無(wú)水葡萄糖加適量蒸餾水加熱溶解, 冷卻至室溫后定容到100 mL, 備用。 復(fù)合乳酸菌液: 稱(chēng)取3 000 mg 混合菌粉溶于60.6 mL 蒸餾水中, 分裝后-20℃保存, 備用。 MCTs 灌胃液:稱(chēng)取5 mL MCTs 溶于15 mL 蒸餾水中, 分裝備用。 MCTs＋復(fù)合乳酸菌液: 稱(chēng)取3 000 mg 混合菌粉溶于45.45 mL蒸餾水后加入15.15 mL MCT, 分裝后-20℃保存, 備用。

1.3 儀器與設(shè)備

玻璃游泳箱(60 cm×50 cm×45 cm)、 500 W 自動(dòng)恒溫加熱棒, 青島永圖商貿(mào)有限公司； AX423ZH 電子分析天平, 奧豪斯儀器有限公司； Spectra Max i3X 酶標(biāo)儀, 美谷分子儀器有限公司； HH-4 數(shù)顯恒溫水浴鍋,國(guó)華儀器制造有限公司； 10 ～1 000 μL 移液槍、 5430R離心機(jī), 德國(guó)Eppendorf 公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)條件

小鼠, 購(gòu)于濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司, 許可證編號(hào): SYXK (魯) 2017 0005； 質(zhì)量檢測(cè)單位: 山東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。 選用健康的雄性Balb/c 小鼠, 7～8 w齡, 體重20～22 g, 特異性無(wú)病原體SPF 級(jí), 共96 只。在保證通風(fēng)條件良好, 溫度控制在(23±3)℃, 相對(duì)濕度為(55±5)%, 光照/黑暗周期為12 h/12 h, 每間隔3 d 換1 次墊料, 自由攝食飲水。

1.5 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w, 每天進(jìn)行30 min 游泳訓(xùn)練。1 w后, 將學(xué)會(huì)游泳的小鼠選出, 隨機(jī)抓取稱(chēng)重, 每只小鼠用苦味酸做好標(biāo)記。 隨機(jī)分為6 組, 每組16 只,具體分組為: 空白對(duì)照組(BL)、 模型組(Md)、 MCTs組(MCT)、 復(fù)合乳酸菌組(LAC)、 MCTs ＋復(fù)合乳酸菌組(MLA)、 陽(yáng)性對(duì)照組(Pt) (表2)。 小鼠每晚20:00 灌胃, 每周稱(chēng)量空腹體重, 并做好記錄。

表2 小鼠分組及干預(yù)情況(n ＝16)

1.6 負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)

力竭游泳試驗(yàn)根據(jù)Kan 等[16]方法基礎(chǔ)上稍加修改。除空白組, 每組各取1 只小鼠將其尾部懸掛占體重5 %的空心鉛墜, 放入60 cm×50 cm×45 cm 游泳箱內(nèi)互不接觸進(jìn)行同池游泳, 水深35 cm、 水溫(25 ±1)℃, 游泳時(shí)尾巴不接觸箱底。 按照Z(yǔ)hong 等[17]方法判斷小鼠力竭狀態(tài)。 游泳結(jié)束后, 用毛巾擦干小鼠, 放回原籠中。

1.7 實(shí)驗(yàn)樣本收集

第42 天小鼠游泳結(jié)束后擦干, 放回原籠休息30 min,腹腔注射4%水合氯醛(0.1 mL/10 g) 麻醉, 摘眼球收集靜脈叢眼球后血液收集到2 mL 肝素鈉管中。 血樣室溫靜置30 min 后, 放入低溫高速離心機(jī)中, 在4℃下, 以3 000 r/min 離心10 min, 取血清分裝后儲(chǔ)存于-80℃冰箱中備用。 以斷髓的方式處死小鼠, 剖取肝臟、 骨骼肌。 在冰生理鹽水中沖凈血漬, 濾紙吸干表面殘留水分, 稱(chēng)重, 用錫紙包裹暫時(shí)存于液氮中, 后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱備用。

1.8 血清及組織樣本測(cè)定

尿素氮(BUN)、 肌酸激酶(CK)、 乳酸(LD)、乳酸脫氫酶(LDH)、 肝糖原(LG)、 丙二醛(MDA)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、 總過(guò)氧化物歧化酶(T-SOD)、 谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)、 肌糖原(MG), 均嚴(yán)格按照相應(yīng)試劑盒說(shuō)明書(shū)的方法測(cè)定。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 9.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析及作圖,所有數(shù)據(jù)均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示, 進(jìn)行單因素方差統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和事后Tukey多重比較檢驗(yàn),P<0.05 認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 中鏈甘油三酯聯(lián)合乳酸菌對(duì)負(fù)重游泳時(shí)間的影響

如圖1 所示, 與Md 組相比, 各組游泳時(shí)間均增加(P<0.05)； 與Pt 組相比, MLA 組(P<0.01) 及MCT 組(P<0.05) 的游泳時(shí)間均顯著增加, LAC 組無(wú)顯著差異(P>0.05), 結(jié)果提示MCTs 和LAC 干預(yù)均能延長(zhǎng)小鼠游泳時(shí)間,且MLA 干預(yù)的效果優(yōu)于MCTs 及LAC 單獨(dú)干預(yù)。

圖1 干預(yù)前后負(fù)重游泳時(shí)間變化(n ＝9)

2.2 中鏈甘油三酯聯(lián)合乳酸菌對(duì)體重的影響

如圖2 所示, 干預(yù)結(jié)束時(shí)Md 組、 LAC 組、 Pt 組體重分別增加了4.07 %、 5.64 %、 2.43 %； 而MCT 組與MLA 組的體重呈下降趨勢(shì), 各組體重在干預(yù)前后無(wú)顯著差異(P>0.05)。

圖2 負(fù)重游泳期間體重變化(n ＝9)

2.3 中鏈甘油三酯聯(lián)合乳酸菌對(duì)糖原的影響

糖原是運(yùn)動(dòng)中重要的能量來(lái)源, 含量與運(yùn)動(dòng)耐力成正比[18]。 干預(yù)結(jié)束各組小鼠的肌糖原(MG) 和肝糖原(LG) 儲(chǔ)存情況如圖3 所示。 與BL 組相比, 運(yùn)動(dòng)后各組糖原含量顯著降低(P<0.05), 說(shuō)明在運(yùn)動(dòng)中有部分糖原分解供能。 與Md 組相比, MCT 組、 LAC 組、 MLA組和Pt 組的糖原含量均增加, 有顯著差異(P<0.05)。與Pt 組相比較, MCT 組和LAC 組MG 含量均差異顯著(P<0.05)。 MLA 組與MCT 組和LAC 組相比均具有顯著差異(P<0.01)。 結(jié)果提示, MLA 能夠節(jié)約更多的糖原, 提高運(yùn)動(dòng)耐力。

圖3 游泳后糖原的變化(n ＝9)

2.4 中鏈甘油三酯聯(lián)合復(fù)合乳酸菌對(duì)代謝產(chǎn)物的影響

持續(xù)運(yùn)動(dòng)使BUN 和LD 積累, 導(dǎo)致肌肉酸痛無(wú)力,易產(chǎn)生疲勞[19]。 如圖4 所示, 與Md 組相比, 其他各組小鼠BUN 和LD 含量均顯著下降(P<0.05)。 MCT 組、LAC 組、 Pt 組BUN 分別降低了14.3 %、 17.4 %、 14.5%。 與BL 組相比, MLA 組BUN 降低了26.1 %、 LD 降低了16.4 %, 但無(wú)顯著差異(P>0.05), 提示MLA 有助于減少運(yùn)動(dòng)中蛋白質(zhì)分解。 與BL 組相比, 負(fù)重游泳使血清中LDH 和CK 含量增加。 LAC 組與MCT 組、 Pt組比較, LDH 含量無(wú)顯著差異(P＝0.06、P＝0.96)；MCT 組與LAC 組和Pt 組相比, CK 含量無(wú)顯著差異(P＝0.53、P＝0.10)。 MLA 組與MCT 組和LAC 組相比,LDH 和CK 降低差異顯著(P<0.05), 提示MLA 可能通過(guò)減少細(xì)胞損傷, 保護(hù)肌肉組織。

圖4 血清代謝產(chǎn)物的變化(n ＝9)

2.5 中鏈甘油三酯聯(lián)合乳酸菌對(duì)氧化應(yīng)激的影響

如圖5 所示, 與BL 組相比, Md 組的MDA 含量增加了近1 倍, 抗氧化酶活性均降低, 提示負(fù)重力竭游泳會(huì)誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)氧化損傷。 與Md 組相比, MCT 組、LAC 組、 MLA 組、 Pt 組MDA 含 量 降 低(P<0.01),GSH-Px、 CAT 和T-SOD 活性較高(P<0.01)。 與Pt 組相比較, MCT 組和LAC 組的MDA 含量、 CAT 和T-SOD活性均無(wú)顯著差異(P>0.05)； MLA 組與MCT 組和LAC 組相 比, MDA 含 量 降 低, GSH-Px、 CAT、 T-SOD活性提高, 有顯著差異(P<0.05), 提示MLA 提高機(jī)體抗氧化活性。

圖5 肝臟抗氧化酶活性變化(n ＝9)

3 討論

負(fù)重力竭游泳可作為一種廣泛用于評(píng)估動(dòng)物運(yùn)動(dòng)耐力的方法[20-21], 故本研究選用負(fù)重力竭游泳, 評(píng)價(jià)MCTs、 復(fù)合乳酸菌以及兩者聯(lián)合干預(yù)的抗疲勞作用。

本研究中MLA 組干預(yù)后可顯著延長(zhǎng)小鼠游泳時(shí)間,優(yōu)于MCTs 和LAC 單獨(dú)干預(yù), MLA 與MCTs 體重呈下降趨勢(shì), 各組體重在游泳前后無(wú)顯著差異。 這與Rial 等[2]報(bào)道MCTs 可顯著提高產(chǎn)熱水平, 減少肝臟脂肪、 減輕體重的結(jié)果相符。 運(yùn)動(dòng)后MLA 組中MG 和LG 含量顯著增加。 與Md 組相比, LG 和MG 的含量分別增加了86.49 %、 44.94 %, 提示MLA 可能有助于糖原儲(chǔ)存, 延緩疲勞。 當(dāng)機(jī)體長(zhǎng)時(shí)間無(wú)法從碳水化合物或脂肪代謝中攝取能量, 此時(shí)蛋白質(zhì)和氨基酸分解代謝率加快產(chǎn)生BUN, 危及肌肉收縮功能。 與Md 組比較, MLA 組的BUN 和LD 含量分別降低了26.1 %、 16.4 %。 正常情況下, LD 被LDH 催化生成丙酮酸, 然后糖異生轉(zhuǎn)化生成葡萄糖為機(jī)體供能； 肌酸與CK 生成含有高能磷酸鍵的磷酸肌酸快速提供能量。 劇烈運(yùn)動(dòng)可能會(huì)導(dǎo)致肌肉細(xì)胞損傷, 細(xì)胞內(nèi)滲透壓調(diào)節(jié)紊亂, 使CK 和LDH 從細(xì)胞滲透到血液中, 故血清中CK 和LDH 活性增高提示肌肉損傷產(chǎn)生[22]。 與Md 相比, MCT 組和LAC 組均降低；MLA 組與MCT 組和LAC 組相比, LDH 和CK 含量降低了約15 %和27 %。 以上研究結(jié)果與齊陽(yáng)[23]關(guān)于MCTs抗疲勞研究結(jié)果相符, 表明MLA 降低血清中LA、 BUN、LDH 和CK 的積累延緩肌肉疲勞。 自由基累積學(xué)說(shuō)表示, 運(yùn)動(dòng)體內(nèi)發(fā)生氧化應(yīng)激, 活性氧(ROS) 含量增加, 脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)生代謝產(chǎn)物MDA 并伴隨抗氧化酶活性降低, 線粒體呼吸鏈電子傳遞不足產(chǎn)生ATP 不能為肌肉收縮提供所需能量, 因此清除自由基對(duì)緩解疲勞至關(guān)重要。 SOD、 GSH-Px 和CAT 是機(jī)體內(nèi)主要內(nèi)源酶防御系統(tǒng)。 與Md 組相比, MLA 組降低了MDA 的含量, 提高了GSH-Px、 CAT、 T-SOD 活性。 這與Sengupta 等[24]關(guān)于富含MCTs 的米糠油對(duì)氧化應(yīng)激作用的結(jié)果相符,表明MLA 可能通過(guò)降低自由基或氫過(guò)氧化物形成, 減少脂質(zhì)過(guò)氧化, 延緩疲勞。

綜上所述, 本研究結(jié)果提示, 中鏈甘油三酯聯(lián)合復(fù)合乳酸菌可延長(zhǎng)運(yùn)動(dòng)時(shí)間提高運(yùn)動(dòng)耐力, 這可能與其能增加糖原儲(chǔ)存提供ATP、 減少代謝產(chǎn)物的積累、 增強(qiáng)抗氧化酶活性、 改善氧化應(yīng)激造成細(xì)胞損傷有關(guān), 進(jìn)而起到緩解疲勞的作用, 但其具體分子機(jī)制還有待進(jìn)一步研究證實(shí)。