鹽膚木果油中沒食子酸的UPLC-MS及HPLC分析

鄭牧垚

摘 要：鹽膚木果實中沒食子酸等多酚類物質(zhì)是重要的生物活性成分，具有抗氧化、抗病毒、消腫瘤等多種生物學(xué)活性。采用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（UPLC-MS），分別對壓榨法、乙醚浸提法和超臨界CO2萃取法3種提取方法所得鹽膚木果油中沒食子酸等多酚成分進行了定性分析，再以沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品為對照，采用高效液相色譜法（HPLC）對各樣品中沒食子酸含量進行了定量分析。結(jié)果表明：3種樣品中均檢測到?jīng)]食子酸的存在，其含量在69.5～434.4 mg/L之間，但不同樣品中沒食子酸含量差異顯著，即提取鹽膚木果油的方式不同，其油脂中含沒食子酸的多少不同，其中以乙醚浸提油中樣品中沒食子酸最多，達（426.7±7.7）mg/L。該研究可為進一步開發(fā)利用鹽膚木果油資源提供方法借鑒。

關(guān)鍵詞：沒食子酸;超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析;高效液相色譜法;鹽膚木;果油

鹽膚木是漆樹科鹽膚木屬的落葉小喬木或灌木，其在我國分布廣泛，除東北、新疆和內(nèi)蒙古外，其余各省區(qū)均有分布[1]。鹽膚木是中國傳統(tǒng)藥用植物，其根、莖、葉、果實及五倍子均可入藥，具有祛風(fēng)化濕、消腫軟堅、收斂解毒、生津潤肺、降火化痰等功效[2]。鹽膚木樹上所產(chǎn)的五倍子主要成分為鞣酸（單寧酸）、沒食子酸及綠原酸等。沒食子酸，又名倍酸、3，4，5-三羥基苯甲酸，常用作抗氧化劑，具有抗炎癥、抗突變、抗氧化、抗自由基等多種生物學(xué)活性[3]，在食品、生物、醫(yī)藥化工等領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用[4]。鹽膚木果油富含不飽和脂肪酸，其不飽和脂肪酸含量可達72%，極具開發(fā)應(yīng)用價值[5-7]，作為木本油料，鹽膚木果油已被批準(zhǔn)為新資源食品（衛(wèi)生部公告2013年第1號），而鹽膚木果油中沒食子酸等多酚類物質(zhì)有無及其含量高低，是其品質(zhì)高低的一項重要指標(biāo)[8]。對鹽膚木果實及果油中沒食子酸等多酚成分及其含量的研究，可為進一步開發(fā)利用鹽膚木資源提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 儀器設(shè)備

超臨界CO2萃取裝置，南通市華安超臨界萃取有限公司;超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，安捷倫1290II，Q-TOF，含單四級桿-飛行時間質(zhì)量分析器;高效液相色譜，依利特P230II含紫外檢測器;超聲波清洗儀，寧波新芝生物科技股份有限公司;電子天平（FA1204N），上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司;粉碎機（DXP-20C），廣州市大祥電子機械有限公司;電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（DGT-G250），合肥華德利科學(xué)器材有限公司;小型榨油機。

1.2 材料與主要試劑

鹽膚木果實，采自安徽六安佛子嶺，曬干后冰柜中保存;色譜純甲醇，上海星可高純?nèi)軇┯邢薰?磷酸，AR，國隴化工股份有限公司;質(zhì)譜純甲醇，法國默克公司;甲酸，質(zhì)譜純;水，市售瓶裝娃哈哈純凈水;沒食子酸，標(biāo)準(zhǔn)對照品，上海原液生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 鹽膚木果油的提取 （1）壓榨法：將鹽膚木果過篩去除雜質(zhì)后，用小型榨油機壓榨，得到鹽膚木果壓榨毛油。（2）乙醚浸提法：將鹽膚木果實清洗干凈，烘干至恒重，粉碎過篩，采用索氏抽提法，以無水乙醚為提脂劑，于45 ℃水浴加熱回流抽提3～5 h，直至回流液無色，用玻璃棒蘸取回流液于濾紙上風(fēng)干后無印記為止，充分提取鹽膚木果油及其他脂溶性物質(zhì)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器內(nèi)去除乙醚，并在鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)45 ℃烘至恒重，即得鹽膚木果實乙醚浸提油。（3）超臨界萃取法：將鹽膚木果實置60～70 ℃鼓風(fēng)干燥箱中烘干，粉碎成80～100目的粉末，稱取300～400 g該粉末，裝入料筒后放于萃取釜中，設(shè)定超臨界CO2萃取的條件分別是：萃取壓力25 MPa、萃取溫度40 ℃、分離壓力10 MPa、分離溫度50 ℃、萃取時間2 h，即每30 min收集萃取油脂1次，重復(fù)收集4次，即得超臨界CO2萃取鹽膚木果油。

1.3.2 分析樣品的處理 由于鹽膚木果油粘稠而成分復(fù)雜，如果用該油脂直接進樣進行HPLC或UPLC-MS分析，其油脂成分又是多酚類成分分析的干擾雜質(zhì)，油脂成分相對于多酚類物質(zhì)含量又過高，因此，必須除去絕大部分油脂成分。利用多酚類物質(zhì)易溶于甲醇、乙醇等醇類溶劑的特性，在測定前，用甲醇萃取出油脂中的多酚類成分。具體方法：分別準(zhǔn)確吸取以上制備的各種鹽膚木果油1 mL，加入質(zhì)譜純甲醇1 mL，充分振蕩后靜置24 h，吸取醇層，用0.22 μm微孔濾膜過濾，即得UPLC-MS分析或HPLC分析所需的樣液。因此，每mL如此處理的樣品所含沒食子酸的量視為等同于同體積鹽膚木果油中沒食子酸含量。

1.4 沒食子酸的超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（UPLC-MS）分析鑒定

1.4.1 超高效液相色譜（UPLC）條件[7，9-11] Agilent Eclipse Plus C18色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.8 μm），柱溫30 ℃，進樣量2 μL，流速0.25 mL/min，流動相A為0.1%質(zhì)譜甲酸水溶液，B為質(zhì)譜甲醇（表1）。

1.4.2 質(zhì)譜（MS）條件 電子電離（EI），負離子模式，單四極桿-飛行時間質(zhì)量分析器，分子分離器條件：干燥氣（N2）流速10 L/min，溫度320 ℃;鞘氣：280 ℃，流速為11 L/min;霧化器噴霧壓力35 psi。

1.4.3 質(zhì)譜檢測參數(shù)的確定 單四極桿—飛行時間質(zhì)量分析器進行掃描的時候，有2個關(guān)鍵的檢測參數(shù)，一個是一級質(zhì)譜的電離電壓，另一個是二級質(zhì)譜的碰撞能，在最優(yōu)的電離電壓下樣品分子會產(chǎn)生穩(wěn)定的母離子，在最優(yōu)的碰撞能下，產(chǎn)生的二級質(zhì)譜的子離子數(shù)是最大的，因此測定不同的物質(zhì)，2個參數(shù)都需要經(jīng)過儀器條件的優(yōu)化，然后才能在最優(yōu)參數(shù)下進行定量和定性分析。經(jīng)電離電壓設(shè)定為145～175 V的沒食子酸一級質(zhì)譜質(zhì)子流（M/Z=169.016）大小可見，在145 V時最大，出峰最好;由碰撞能為10～40 eV時沒食子酸二級質(zhì)譜圖可看出，沒食子酸二級質(zhì)譜質(zhì)子流（M/Z=125.026）在碰撞能為20 eV時最好。因此，鹽膚木果油中沒食子酸的最優(yōu)參數(shù)優(yōu)化結(jié)果是：一級質(zhì)譜的電離電壓為145 V，二級質(zhì)譜的碰撞能為20 eV[7]。

1.5 高效液相色譜（HPLC）紫外檢測含量測定

1.5.1 HPLC色譜條件[12-13] ODS C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫25 ℃;檢測波長273 nm;進樣量10 μL;流動相：A為色譜甲醇，B為0.1%磷酸水溶液，流速1 mL/min（表2）。

1.5.2 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 將沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇∶0.1%磷酸水=80∶20的流動相溶液稀釋成梯度濃度分別是0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，按上述1.5.1的HPLC色譜條件對標(biāo)準(zhǔn)系列溶液分別進行測定（圖3），將測定結(jié)果以峰面積（mAU.s）為縱坐標(biāo)Y、沒食子酸濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)X，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖4），得到回歸方程。

1.5.3 樣品中沒食子酸含量的測定 按照沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液測定的同樣條件，對各樣品進行進樣分析，將各樣品的HPLC峰面積數(shù)值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程，計算出各樣品中的沒食子酸含量（mg/mL）（表3）。

2 結(jié)果與分析

2.1 沒食子酸的液質(zhì)聯(lián)用分析鑒定結(jié)果

2.1.1 常見多酚類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品的一級質(zhì)譜及沒食子酸的一、二級質(zhì)譜 按上述1.4 UPLC-MS的條件，對鹽膚木中常見的5種多酚類物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)品（沒食子酸、兒茶素、綠原酸、咖啡酸和漆酚）的混標(biāo)溶液進行UPLC-MS分析，一級質(zhì)譜總離子流色譜圖可見，沒食子酸的負離子模式（M/Z=169.016）一級質(zhì)譜總離子流出峰時間是1.321 min，其二級質(zhì)譜中碎片離子（M/Z=125.02）較穩(wěn)定（圖1）。

2.1.2 鹽膚木果油樣品中沒食子酸的一級、二級質(zhì)譜定性分析結(jié)果 按上述1.4UPLC-MS的條件，對3種方式提取的鹽膚木果油樣品進行一級、二級質(zhì)譜分析的結(jié)果可見，壓榨鹽膚木果油樣品、乙醚萃取及超臨界CO2萃取鹽膚木果油樣品中一級質(zhì)譜中總離子流出峰時間在1.32左右均有一個質(zhì)荷比M/Z=169.016的較強的離子峰，其二級質(zhì)譜中質(zhì)荷比為M/Z=125.02的離子流也較穩(wěn)定，說明3種方式提取鹽膚木果油中均含有多酚類物質(zhì)——沒食子酸（圖2）。

2.2 HPLC紫外檢測含量測定結(jié)果

2.2.1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)系列的HPLC圖譜及標(biāo)準(zhǔn)曲線沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)系列的HPLC圖譜及標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖3、圖4。

2.2.2 各樣品中沒食子酸的HPLC圖譜及其含量 3種樣品在沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品相同色譜條件下的HPLC圖譜見圖5，將各自峰面積數(shù)值輸入標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程，計算出各自的沒食子酸含量（表3）。

由表3可見，3種樣品中均檢測到?jīng)]食子酸的存在，其含量在69.5～434.4 mg/L之間;但不同樣品中沒食子酸含量差異顯著，即提取鹽膚木果油的方式不同，其油脂中含沒食子酸的多少不同，其中以乙醚浸提油中樣品中沒食子酸最多，達（426.7±7.7）mg/L。

3 討論

采用UPLC-MS定性分析可以確定不同提取方法所得鹽膚木油脂中均含有沒食子酸，該方法正是目前對未知成分定性分析的通用的方法，也是較準(zhǔn)確的方法之一。而HPLC的紫外檢測定量分析更是較普及的定量檢測方法之一。

從分析結(jié)果可以看出，鹽膚木果油提取方法不同，其中所含沒食子酸的量存在顯著差異，乙醚浸提鹽膚木果油中含量是壓榨法或超臨界CO2萃取法所得鹽膚木果油中的7～8倍之多，可能的原因：一是沒食子酸性質(zhì)決定的，沒食子酸易溶于熱水、乙醇、乙醚，而不溶于苯、石油醚等[14]，因此，乙醚提取鹽膚木果油時，沒食子酸也就留在了油脂中。二是不同提取方式提取鹽膚木果油所用的原料鹽膚木果實的材料來源于不同批次，也就是不同植株的鹽膚木果實，這些原材料中所含沒食子酸含量也可能有所差異。因此，鹽膚木不同植株或不同生長環(huán)境條件下其果實中的沒食子酸含量，也有待深入研究。

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