二甲雙胍對大鼠腦出血后血腫周圍組織繼發(fā)損害有保護作用

向攀懿，李作孝

腦出血（intracerebral hemorrhage，ICH）存在原發(fā)性和繼發(fā)性損害，前者指血腫擴大導(dǎo)致淤血所引起的機械性破壞，后者則與多種因素有關(guān)，包括腦水腫、炎癥反應(yīng)、自由基損害及細胞凋亡等。研究發(fā)現(xiàn)[1]，血腫周圍腦組織的繼發(fā)性損害與ICH 的高殘疾率和高死亡率密切相關(guān)。因此，研究ICH后繼發(fā)性損害的機制及防治藥物具有重要價值。

二甲雙胍（Metformin，Met）為雙胍類口服降血糖藥，是臨床治療2型糖尿病的一線藥物，在血漿中不與血漿蛋白結(jié)合，通過抑制人體糖異生作用及增加對外周葡萄糖的消耗，發(fā)揮降血糖作用，且可減弱胰島素抵抗，不影響胰島素在人體內(nèi)的分泌。相關(guān)研究證實[2]，Met 會抑制葡萄糖在腸道的吸收，且不促進脂肪合成，對正常人的血糖無影響；且可在人體內(nèi)通過清除氧自由基，減輕炎癥反應(yīng)，抗細胞凋亡等機制，發(fā)揮對各臟器的保護作用。本研究通過制備大鼠ICH 模型，觀察Met 對大鼠ICH 后神經(jīng)功能障礙評分、血腫周圍腦組織含水量、自由基含量、炎癥反應(yīng)及細胞凋亡蛋白等指標(biāo)變化的影響，探討Met對ICH后血腫周圍組織繼發(fā)性損害的保護作用及其機制，旨在為Met 的作用領(lǐng)域與ICH 的臨床治療提供新的選擇方案。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 雄性健康成年體質(zhì)量250～300 g的Sprague-Dawley 大鼠（由西南醫(yī)科大學(xué)動物室提供），適應(yīng)性喂養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑及設(shè)備 Met，購于上海麥克林生物化學(xué)科技有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）測定試劑盒，購于南京建成生物科技有限公司；B淋巴細胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bcl-2 associated X，Bax）抗體，購于武漢恒意賽生物科技有限公司；立體定向儀、膠片掃描儀，購于西南醫(yī)科大學(xué)動物中心實驗室；50 μL 微量進樣器，購于無錫德凡玻璃儀器有限公司；轉(zhuǎn)移電泳儀槽，購于北京市六一儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 動物分組、模型制備 將60只大鼠采用隨機數(shù)字抽樣法分為假手術(shù)組、對照組及Met 組，每組20 只，每組再分為1、3、7、14 d 四個亞組。造模方法：對照組及Met組大鼠稱重后，腹腔注射10%水合氯醛3 mL/kg 麻醉，固定于立體定向儀行大鼠頭部正中線縱切口，暴露出顱骨標(biāo)志，在前囟后1.6 mm、中線左側(cè)旁開3 mm 處鉆孔，調(diào)整微量注射儀尖端移至鉆孔處。消毒大鼠尾后在距末端0.5 cm 處斷尾取自體不凝血50 μL[3]，沿鉆孔進針將血注入腦內(nèi)，注射完畢后封閉鉆孔并縫合頭皮。假手術(shù)組在相同位置注入50 μL 生理鹽水。按Bederson[4]的評定方法分成四級判定大鼠ICH模型是否成功，若達1、2、3 級判定為成功。給藥方法：Met 組予以Met 100 mg/(kg·d)連續(xù)灌胃，對照組與假手術(shù)組連續(xù)灌胃生理鹽水100 mg/(kg·d)。

1.2.2 神經(jīng)功能障礙評分 造模后第1、3、7、14 天對各組大鼠按改良Garcia[5]方法對進行神經(jīng)功能障礙評分（3～18分），分數(shù)越低提示神經(jīng)功能障礙越重。

1.2.3 標(biāo)本制備 造模后第1、3、7、14天腹腔注射1%戊巴比妥鈉2～3 mL，斷頭處死每組5只大鼠，迅速開顱取距血腫邊緣外側(cè)1 cm范圍內(nèi)腦組織4～5塊（1 mm3），取1～2 塊腦組織用電子天平稱重后放入稱量瓶，存放在電熱鼓風(fēng)干燥箱中備用；1～2 塊腦組織進行脫水包埋石蠟切片處理，常規(guī)HE染色，采用ELISA進行測定SOD活力、MDA含量；1 塊腦組織放入－80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，擬作Western blot檢測。

1.2.4 血腫周圍腦組織含水量測定 采用干濕法測定含水量。于相應(yīng)時間點，取干燥箱中各組腦組織塊，然后置于恒溫烤箱中，恒溫105 ℃24 h 烤至恒重，運用Elliott 公式計算：腦組織含水量=(濕重－干重)/濕重×100%。

1.2.5 血腫周圍腦組織病理變化觀察 于相應(yīng)時間點，各組取血腫周圍腦組織塊，置于4%多聚甲醛中固定24 h以上后，脫水行常規(guī)石蠟包埋切片，按照HE染色說明書進行染色，光鏡下觀察腦組織病變情況。

1.2.6 血腫周圍腦組織SOD 活力與MDA含量檢測 于相應(yīng)時間點，各組取血腫周圍腦組織塊加生理鹽水配成3%腦組織勻漿，離心10 min，取上清液用于檢測MDA 和SOD，按照說明書步驟進行檢測，并通過公式計算出組織塊中總SOD 活力與MDA含量。

1.2.7 血腫周圍腦組織Bax 及Bcl-2 蛋白表達的測定 于相應(yīng)時間點，各組取低溫保存的血腫周圍腦組織塊置于預(yù)冷的PBS緩沖液中漂洗數(shù)次，清洗表面血污后切割成均勻小塊放入勻漿器中，加入相應(yīng)體積裂解液，冰浴徹底勻漿后轉(zhuǎn)移至離心管中振蕩，保證勻漿液完全裂解。4 ℃12 000 rpm 離心5 min，收集上清，即為總蛋白溶液。樣品蛋白濃度用BCA測定試劑盒測定，根據(jù)樣品濃度調(diào)控每個樣品總蛋白上樣量均為40 μg。將適量的蛋白上樣緩沖液加入樣品中，沸水浴5 min。室溫冷卻并離心后，取樣品進行SDS-PAGE 丙烯酰胺凝膠電泳并轉(zhuǎn)移至PVDF濾膜上，加入稀釋液室溫依次孵育一抗、二抗，化學(xué)檢測法曝光。掃描存檔膠片，運用相關(guān)軟件分析計算Bax 及Bcl-2 蛋白平均灰度值及分析目標(biāo)帶的光密度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS20.0軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）表示，單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能的變化

與假手術(shù)組相比，對照組各時間點神經(jīng)功能障礙評分降低（P＜0.05）；與對照組相比，Met 組各時間點神經(jīng)功能障礙評分增高（P＜0.05），見表1。

表1 3組神經(jīng)功能障礙評分比較（±s）

表1 3組神經(jīng)功能障礙評分比較（±s）

組別假手術(shù)組對照組Met組例數(shù)20 20 20神經(jīng)功能障礙評分/分造模后第1天17.60±0.55 9.00±0.71①9.80±0.84②③造模后第3天17.80±0.45 7.40±0.55①9.60±0.55②③

注：與假手術(shù)組比較，①P＜0.01，②P＜0.05；與對照組比較，③P＜0.05

2.2 血腫周圍腦組織病理變化

假手術(shù)組第1、3、7、14天各時間點腦組織未見明顯病理改變；對照組各相應(yīng)時間點血腫周圍腦組織形態(tài)異常，可見細胞明顯腫脹、周圍間歇增寬，有大量淋巴細胞浸潤和膠質(zhì)細胞增生，還可見少量血管擴張；與對照組比較，Met組各相應(yīng)時間點上述病理改變程度明顯減輕，見圖1。

圖1 3組腦組織（HE染色，×400，n=5）

2.3 血腫周圍腦組織含水量變化

對照組各時間點血腫周圍組織含水量較假手術(shù)組各相應(yīng)時間點增多（P＜0.05）；Met組各時間點血腫周圍組織含水量較對照組各相應(yīng)時間點降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

2.4 血腫周圍腦組織SOD活力和MDA含量變化

對照組各時間點血腫周圍組織較假手術(shù)組各相應(yīng)時間點SOD活力降低，MDA含量升高（P＜0.05）；Met組各時間點血腫周圍組織較對照組各相應(yīng)時間點SOD 活力升高，MDA 含量降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 3組造模后SOD活力和MDA含量比較（±s）

表2 3組造模后SOD活力和MDA含量比較（±s）

組別假手術(shù)組對照組干預(yù)組只數(shù)20 20 20 SOD活力/(U/mgprot)1 d 25.37±1.37 9.44±0.77①14.7±1.36②③3 d 25.16±0.69 0.58±0.12①5.86±1.02②③7 d 24.85±1.65 0.58±0.12①14.4±0.99②③14 d 25.32±0.66 15.39±0.84①23.85±0.38②③MDA含量/(nmol/mgprot)1 d 0.77±0.17 10.44±0.73①8.45±0.72②③

注：與假手術(shù)組比較，①P＜0.01，②P＜0.05；與對照組比較，③P＜0.05

2.5 血腫周圍腦組織Bax和Bcl-2表達的變化

對照組各時間點血腫周圍組織較假手術(shù)組各相應(yīng)時間點Bax表達增加，Bcl-2表達降低；Met組各時間點血腫周圍組織較對照組各相應(yīng)時間點Bax 表達降低，Bcl-2 表達增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖2、表3。

表3 3組腦組織中造模后不同時間點Bax和Bcl-2平均灰度值的比較（±s)

表3 3組腦組織中造模后不同時間點Bax和Bcl-2平均灰度值的比較（±s)

組別假手術(shù)組對照組干預(yù)組只數(shù)20 20 20 Bax 1 d 0.07±0.02 0.48±0.03①0.29±0.02②③3 d 0.05±0.02 0.75±0.07①0.56±0.05②③7 d 0.07±0.17 0.60±0.05①0.45±0.02②③14 d 0.06±0.12 0.34±0.06①0.17±0.03②③Bcl-2 1 d 0.13±0.01 0.15±0.03①0.53±0.05②③

注：與假手術(shù)組比較，①P＜0.01，②P＜0.05；與對照組比較，③P＜0.05

圖2 3組大鼠造模后各時間點血腫周圍組織Bax和Bcl-2蛋白的表達

3 討論

ICH 后血腫周圍白細胞浸潤和小膠質(zhì)細胞活化會釋放炎癥細胞因子加重細胞炎性病理改變[6]。同時血腫壓迫可致局部腦組織缺血、缺氧而產(chǎn)生大量氧自由基攻擊腦細胞膜磷脂，可造成細胞損傷發(fā)生腦水腫，加速細胞凋亡[7-10]。SOD是生物體內(nèi)一種抗氧化酶，其活力與清除氧自由基的能力相關(guān)，在氧化與抗氧化平衡中起到至關(guān)重要的作用。MDA作為生物體內(nèi)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物，其含量可反映氧自由基水平，間接反映出細胞損傷的程度[7]。Bcl-2蛋白作為內(nèi)源性神經(jīng)保護物質(zhì)，主要通過抑制神經(jīng)元細胞凋亡參與腦細胞保護作用[11]。Bax蛋白是促細胞凋亡蛋白，可抑制Bcl-2保護效應(yīng)而加速細胞凋亡[12]。細胞凋亡抑制作用強弱與Bcl-2/Bax的值有關(guān)，較高的值表示細胞凋亡被抑制，較低的值表示細胞凋亡受到促進[13]。本研究結(jié)果顯示大鼠ICH后可見神經(jīng)功能障礙評分升高，血腫周圍組織炎癥細胞的浸潤及血管擴張等病理反應(yīng)，血腫周圍腦組織含水量明顯增加，SOD活力值降低及MDA含量增加，Bax表達增加及Bcl-2表達降低。說明大鼠ICH后血腫周圍組織局部缺血、炎癥反應(yīng)等多因素共同作用下氧化及抗氧化失衡，大量氧自由基產(chǎn)生，發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，造成明顯腦損傷和腦水腫，促進細胞凋亡發(fā)生，加重繼發(fā)性腦損害。

Met是人工合成的雙胍類口服降血糖藥，無促使脂肪合成的作用，藥效穩(wěn)定，且不降低非糖尿病患者的血糖[14]。近年的研究發(fā)現(xiàn)，Met 給藥后可透過血腦屏障于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中產(chǎn)生療效，減輕腦組織過度氧化引起的白細胞活性降低與細胞凋亡[15]。其途徑包括Met通過直接抑制NLRP3炎性小體激活，從而抑制促炎癥蛋白酶Caspase-1活化與自切割，阻礙炎癥細胞因子的成熟，降低炎癥反應(yīng)的表達；Met通過激活含有氧化應(yīng)激的血清標(biāo)志物修飾蛋白，促進抗OH 自由基生成，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而降低自由基水平，提升細胞抗氧化能力，維持組織穩(wěn)態(tài)；Met通過抑制bax/bax 同源二聚體的過量表達及Caspase-3 的活化，影響細胞凋亡的效應(yīng)與執(zhí)行階段，從而減少細胞凋亡[16-18]。本研究結(jié)果顯示Met 干預(yù)后ICH 大鼠神經(jīng)功能障礙評分降低，大鼠血腫周圍腦組織炎癥細胞的浸潤及血管擴張等病理反應(yīng)及血腫周圍腦組織含水量減少，SOD 活力增高及MDA 含量降低，Bax表達降低及Bcl-2表達增高，說明Met可改善大鼠ICH后神經(jīng)功能缺失癥狀，減輕腦組織水腫及炎性細胞浸潤，抑制細胞凋亡而減輕血腫周圍組織繼發(fā)損害，發(fā)揮保護作用。

綜上所述，Met可對ICH后血腫周圍組織繼發(fā)損害產(chǎn)生保護作用，其機制可能與炎癥反應(yīng)、氧化及凋亡作用減弱有關(guān)，這為Met 在急性ICH 治療中的應(yīng)用提供實驗依據(jù)，也為急性ICH的臨床防治提供新的應(yīng)用前景。