從肝論治音樂療法治療晝夜節(jié)律性睡眠障礙患者的臨床觀察

姚冉，陳明鑒，李清

晝夜節(jié)律性睡眠障礙是由于睡眠-覺醒周期與人體的24 h生物節(jié)律或與人群的睡眠-覺醒時相不一致所致的一類睡眠疾病，其臨床主要表現為失眠和（或）白天嗜睡，嚴重影響患者的生活質量[1]。病因學上可歸因于晝夜節(jié)律系統的改變和（或）內源性晝夜節(jié)律與外源性因素的不一致[2]。目前，光照、褪黑素及時間療法是臨床應用最多的治療手段，但仍缺乏高質量的臨床證據，限制了其推廣應用[3,4]。

從肝論治音樂療法是以中醫(yī)理論為基礎，以傳統古典音樂為干預手段，達到防治疾病目的的一種音樂療法[5-7]。學者發(fā)現古典音樂作為一種簡單、無創(chuàng)的非藥物干預措施，具備促進睡眠質量、改善白天焦慮和疲勞的潛力[8]。目前，國內采用傳統古典音樂干預晝夜節(jié)律性睡眠障礙的臨床研究鮮有報道，本研究一方面通過經典臨床量表評價從肝論治音樂療法對晝夜節(jié)律性睡眠障礙患者的有效性和安全性，另一方面從晝夜節(jié)律“轉錄-翻譯”負反饋環(huán)路著手，通過相關節(jié)律基因表達水平的變化，深入探討其發(fā)揮療效的潛在機制，以期為該治療方案的臨床推廣應用提供基礎和依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2018年11月至2021年6月于武漢市優(yōu)撫醫(yī)院招募晝夜節(jié)律性睡眠障礙患者60 例，納入標準：年齡18～65周歲；符合診斷標準：參照《睡眠障礙國際分類（第三版）》[9]，符合以下三點：呈現慢性的或反復出現的睡眠-覺醒節(jié)律紊亂，至少持續(xù)3月；出現失眠或嗜睡癥狀，或兩者兼而有之；睡眠-覺醒節(jié)律紊亂對患者精神、軀體、社交、工作、學習等重要功能領域造成臨床顯著的痛苦或損害。排除標準：缺乏適宜的睡眠機會或睡眠環(huán)境；伴嚴重的未治愈的呼吸、循環(huán)、消化、血液、內分泌及神經精神系統疾?。凰幬餅E用；懷孕及哺乳期；聽力障礙或患聽力系統疾病。中止和脫落標準：發(fā)生嚴重不良事件；使用課題規(guī)定禁用藥物；未完成完整觀察周期。本研究已通過武漢市優(yōu)撫醫(yī)院倫理委員會的審批，且受試者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 試驗設計及分組 試驗遵循隨機對照原則設計，利用SPSS生成隨機數字序列，由第三方將其封于信封中并編號。隨后，研究人員根據患者招募次序打開信封，決定其納入組別。研究全部完成后，兩名研究者分別錄入試驗數據以交叉核對，并交予統計人員進行一級揭盲，統計分析完成后再行二次揭盲。

1.2.2 治療方案 2組均給予常規(guī)睡眠健康衛(wèi)生宣教，治療組則還給予從肝論治音樂療法干預，具體參照郝萬山等編制的《中國傳統五行音樂》[10]，遵五行-五臟理論，辨臟腑病位所在，選取適宜的古典音樂進行干預，30 min/次，1次/d，2組均干預4周。

1.3 觀察指標

1.3.1 主要結局 干預前后分別采用匹茲堡睡眠質量指數（Pittsburgh Sleep Quality Index，PSQI）和愛潑沃斯嗜睡量表（Epworth Sleepiness Scale，ESS）評估1次。

1.3.2 次要結局 采用RT-PCR 法檢測Per1、Bmal1mRNA 的表達水平。干預前后分別留取患者的外周血樣本，使用QIAamp?RNA Blood Mini Kit從人全血中提取總RNA，并通過分光光度法評估RNA樣品純度。通過NCBI Primer-blast 網站設計引物，引物序列見表1。使用Roche 公司實時熒光定量PCR 儀器，設置PCR 儀反應程序為65 ℃、5 min，4 ℃、∞；加入5×Prime Script Buffer 2 等，充分混合均勻，設置PCR儀反應程序為42 ℃、60 min，70 ℃、5 min，4 ℃、∞。配置PCR 反應液，加入PCR Forward Primer、PCR Reverse Primer、DNA 模板、ddH2O 等。充分混 合均勻，離 心，采用GAPDH為內參，設置Real Time-PCR儀反應條件：96℃、30 min，95℃、5 min，60℃、30 min，95 ℃、10 min，65 ℃、5 min，95 ℃、6 min，共進行40個循環(huán)，繪制溶解曲線，運用2-ΔΔCt法計算mRNA的相對表達量。

表1 引物序列

1.4 安全性觀察

干預前后分別檢測2 組患者的血常規(guī)、尿常規(guī)、糞便常規(guī)、肝腎功能和心電圖，并對不良事件進行詳細記錄。

1.5 統計學處理

主要應用SPSS23.0 軟件(Chicago,IL,USA)進行統計分析。服從正態(tài)分布的計量資料以（均值±標準差）表示，不服從的則以中位數（四分位間距）表示。符合正態(tài)分布且方差齊性的計量資料比較采用t檢驗。計數資料采用率或構成比表示，組間計數資料的比較采用Pearson χ2檢驗。雙側檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般資料

觀察4 周后，治療組脫落1 例，對照組脫落5 例，共計54 例完成完整觀察周期，總脫落率為10%。對照組25例，男8例，女17 例；年齡（43.28±11.69）歲；身高（160.44±7.05）cm，體質量（56.11±8.91）kg。治療組29 例，男10 例，女19 例；年齡（43.31±9.78）歲；身高（164.38±7.41）cm，體質量（60.70±8.68）kg。2組一般資料比較差異無統計學意義（均P＞0.05）。

2.2 2組PSQI與ESS評分比較

干預前，2 組的PSQI 和ESS 評分差異無統計學意義（P＞0.05）；干預后，2 組PSQI 和ESS 評分均較干預前顯著降低（P＜0.01），且治療組的量表評分顯著低于對照組（P＜0.01），見圖1。

圖1 2組干預前后PSQI和ESS評分比較

2.3 2組Per1和Bmal1的表達水平比較

干預前，2 組的Per1和Bmal1mRNA 的表達水平差異無統計學意義（P＞0.05）；干預后，治療組的Per1和Bmal1mRNA 的表達水平顯著上調（P＜0.01），而對照組僅Bmal1mRNA的表達水平上調（P＜0.05），Per1mRNA 的表達水平未見改變（P＞0.05）；此外，治療組干預后的Per1、Bmal1mRNA表達水平均顯著高于對照組（P＜0.01），見圖2。

圖2 2組干預前后Per1和Bmal1 mRNA相對表達情況

2.4 相關性分析

在基線時，患者PSQI量表的評分與其Per1和Bmal1mRNA表達水平顯著相關（P＜0.01）；ESS 量表評分與Per1和Bmal1mRNA表達水平也顯著相關（P＜0.01），見圖3。

圖3 PSQI（A）和ESS（B）量表與患者Per1和Bmal1 mRNA表達水平的相關性分析

2.5 安全性觀察

治療組有1例因耳鳴退出研究；對照組有2例因眩暈退出研究，3例主動要求退出研究。停止干預后，上述不良反應消失。

3 討論

人體的晝夜節(jié)律基因以24 h 左右為周期對機體體溫、攝食、情緒、睡眠-覺醒等生理、行為發(fā)揮調控作用[11]。其中，睡眠-覺醒周期是晝夜節(jié)律最直觀的體現之一。由晝夜節(jié)律紊亂引起的睡眠障礙被稱為晝夜節(jié)律性睡眠-覺醒障礙，臨床以失眠和日間嗜睡為主要表現[12]。人體晝夜節(jié)律的中央起搏器位于下丘腦視交叉上核，由視網膜的感光細胞檢測到可見光，并將信息直接投射到負責全身晝夜節(jié)律的視交叉上核[13]。而晝夜節(jié)律的周期轉換由兩條關鍵的轉錄-翻譯負反饋回路調控。其一，Clock和Bmal1基因表達的CLOCK、BMAL1蛋白結合成異源二聚體，并激活生物鐘基因（如Per1、Per2、Per3、Cry1和Cry2）啟動子的E-box區(qū)域，上調后者的轉錄表達水平[14]，使PER和CRY蛋白能夠在細胞質中逐漸累積，并與磷酸化受酪蛋白激酶I 形成復合物，轉運至細胞核中，抑制CLOCK:BMAL1 二聚體的活性來抑制自身的表達，完成負反饋調控環(huán)[15]。其二，鐘控基因Rev-erb和Ror表達的2 種視黃酸相關孤兒核受體REV-ERBα與RORα可競爭性結合Bmal1 啟動子上的視黃酸相關孤兒受體反應元件，抑制Bmal1的轉錄和表達以實現負反饋調節(jié)[16]。

本研究發(fā)現，從肝論治音樂療法可顯著降低晝夜節(jié)律性睡眠障礙患者的PSQI和ESS量表評分，可見該治療可有效改善患者的夜間睡眠質量，并緩解其日間嗜睡癥狀。與之相似，張瑞芳等[17]發(fā)現，五行音樂療法聯合中藥能夠顯著降低圍絕經期失眠患者的PSQI評分，明顯改善其生活質量。而從趙璐[18]的研究結果可見，采用擇時策略的五行音樂療法對患者失眠癥狀的改善效果要明顯優(yōu)于無擇時策略的治療方案。此外，研究表明人外周血生物鐘基因Per1和Bmal1的表達水平與機體晝夜節(jié)律周期直接相關[19,20]。因而，調節(jié)生物鐘基因的表達可能是糾偏機體晝夜節(jié)律紊亂的途徑之一。本研究發(fā)現，本治療方法可明顯上調患者外周血中Per1和Bmal1基因的表達水平，這可能是該法發(fā)揮臨床療效的潛在機制。

綜上所述，本研究表明從肝論治音樂療法可能是通過調控Per1和Bmal1基因的表達來改善晝夜節(jié)律性睡眠障礙患者的失眠和日間嗜睡癥狀。音樂治療不良反應輕微，與單純藥物治療相比不增加額外的不良反應，不良反應小，可進一步提高患者的治療依從性，提高療效[21]。